Sirt3基因的用途及其相关药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物研发领域，具体公开了SIRT3基因的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒OfepatitisBVirus,HBV)感染呈世界范围广泛流行，全球有超过3 亿慢性感染者；并逐步发展为慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌，每年约有100万人死于乙肝相 关的各种终末期疾病。目前，治疗乙型肝炎现症患者的主要药物包括干扰素和核苷类似物。 干扰素仅对不到30%的患者效果明显，且副反应较大，应用受到一定限制。已上市的核苷类 似物（nucleotideanalog，NAs)包括拉米夫定、阿德福韦、替比夫定、恩替卡韦和替诺福韦 共五种。这些药物可在一定时期内降低多数患者的血清HBV载量，改善转氨酶水平及肝脏 组织学表现，但最终达到病毒cccDNA清除这一理想治疗目标的比例仍然较低，而且，NAs通 常需要长期用药以维持效果，但长期用药又可能产生病毒耐药问题。
[0003] 因此，寻找新的分子生物学治疗靶点，发展新的治疗策略，尤其是发展阻断HBV cccDNA新靶点或策略显得尤为重要。
[0004] HBV基因组长约3. 2kb，为部分环状双链DNA，其复制过程中最基本的事件是rcDNA 转化成cccDNA。cccDNA是HBV所有mRNA转录的模板，与多种组蛋白和非组蛋白共同组成 病毒微染色体，其形成标志着病毒初始感染。目前，多项研究证实cccDNA的表观遗传修饰 可以过程调控HBV的复制过程。
[0005]Sirtuin家族是一组依赖烟碱腺嘌呤二核苷酸（NAD+)的III类组蛋白去乙酰化酶。 它包括7个家族成员（SIRT1-7)，分别通过其去乙酰化的活性广泛参与了多种细胞生理过 程的调节，如应激反应、能量代谢、细胞增殖、DNA修复、细胞衰老和细胞凋亡等。SIRT3对 HBV复制和转录的影响，现有技术中未见任何报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供SIRT3基因的用途及其相关药物。
[0007] 为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明的第一方面，提供了一种分离的SIRT3基因在筛选乙型肝炎治疗药物中的 用途。
[0009] 将分离的SIRT3基因用于筛选乙型肝炎治疗药物，是指将SIRT3基因作为药物或 制剂
[0010] 针对乙型肝炎的作用靶标应用于筛选乙型肝炎治疗药物或制剂。
[0011] 所述将SIRT3基因作为药物或制剂针对乙型肝炎的作用靶标应用于筛选乙型肝 炎治疗药物或制剂具体是指：将SIRT3基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到 可以提高或促进SIRT3基因表达的药物作为乙型肝炎治疗备选药物。如本发明所述的过表 达SIRT3基因的质粒，是以SIRT3基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制乙型肝炎病 毒作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将SIRT3基因及其蛋白作为作 用对象。
[0012] 所述乙型肝炎治疗药物为能够特异性提高或促进SIRT3基因的转录或翻译，或能 够特异性提高或促进SIRT3蛋白的表达或活性的分子，从而提高细胞中SIRT3基因的表达 水平，达到抑制乙肝病毒的复制或存活的目的。
[0013] 所述通过分离的SIRT3基因筛选获得的乙肝病毒治疗药物包括但不限于：核酸分 子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或病毒。
[0014] 所述乙型肝炎治疗药物的施用量为足够提高或促进SIRT3基因的转录或翻译，或 者足够提高或促进SIRT3蛋白的表达或活性的剂量。
[0015] 采用前述乙型肝炎治疗药物治疗乙型肝炎的方法，主要是通过提高或促进SIRT3 基因的表达水平抑制乙型肝炎病毒的复制来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效促 进或提高SIRT3基因表达水平的物质给药于患者。
[0016] 本发明的第二方面，提供了一种筛选乙型肝炎治疗药物的方法，包括步骤：
[0017] (1)将待测物质加入表达SIRT3基因的体系中；
[0018] (2)检测所述体系中SIRT3基因的转录或表达水平，其中，与未加入待测物质的实 验相比，若所述待测物质能够促进或提高SIRT3基因的转录或表达，则表明该待测物质可 作为候选乙型肝炎治疗药物。
[0019] 本发明的第三方面，提供了一种分离的SIRT3基因/蛋白在制备或筛选乙型肝炎 诊断试剂中的用途。
[0020] 优选地，所述SIRT3基因/蛋白作为生物标志物。更优选地，所述SIRT3基因基因 /蛋白作为血清生物标志物。
[0021] 优选地，所述乙型肝炎诊断试剂用于乙型肝炎的判断、治疗方案的选择、和/或预 后评估。
[0022] 将SIRT3基因/蛋白作为生物标志物用于制备乙型诊断试剂，是指将SIRT3基因/ 蛋白作为基于检测SIRT3基因/蛋白含量的乙型肝炎诊断试剂的标准品或阳性对照，用于 样本血清中的SIRT3基因/蛋白的检测。
[0023] 将SIRT3基因/蛋白作为生物标志物用于筛选乙型肝炎诊断试剂，是指将SIRT3 基因/蛋白作为靶标应用于乙型肝炎诊断试剂的筛选。具体地，可以基于所述的SIRT3基 因的序列，筛选特异性扩增SIRT3基因转录本的引物从而作为检测乙型肝炎的试剂，来检 测样本血清中SIRT3基因水平。或者，可以基于所述SIRT3蛋白，筛选特异性针对SIRT3蛋 白的抗体，来检测样本血清中SIRT3蛋白水平。
[0024] 本发明的第四方面，提供了一种乙型肝炎诊断试剂盒，包括特异性扩增SIRT3基 因转录本的引物或特异性抗SIRT3蛋白的抗体。
[0025] 本发明的第五方面，提供了一种诊断乙型肝炎的方法，包括步骤：检测样本血清中 SIRT3基因或蛋白的水平。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0027] 本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，SIRT3在HBV复制细胞系中的显著低表 达。并且，过表达SIRT3能够显著抑制HBV复制中间体的表达；过表达SIRT3能够显著抑 制HBV core (HBc)蛋白的表达；过表达SIRT3能够显著抑制HBsAg和HBeAg的分泌；过表达 SIRT3能够显著抑制HBV复制的模板HBV 3. 5kb mRNA表达。综上所述，过表达SIRT3能够 显著抑制HBV复制。
[0028] 此外，本发明还首次发现，沉默SIRT3能够显著促进HBV复制中间体的表达；沉默 SIRT3能够显著促进HBV core (HBc)蛋白的表达；沉默SIRT3能够显著促进HBsAg和HBeAg 的分泌；沉默SIRT3能够明显促进HBV 3.5kbmRNA的表达。综上所述，沉默SIRT3能够显 著促进KW复制。
[0029] 基于上述研究成果，本发明首次提供了分离的SIRT3基因在在筛选乙型肝炎治疗 药物以及在制备或筛选乙型肝炎诊断试剂中的用途，并提供了一种筛选乙型肝炎治疗药物 的方法，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0030] 图I:Westernblot检测SIRT3在HBV复制细胞系中的表达；其中，图IA表示通过 weaternblot检测发现SIRT3的蛋白表达水平在HBV稳定复制细胞系H印G2. 2. 15显著低 于对照细胞H印G2 ;图IB表示SIRT3在四环素未处理的H印AD38细胞中的表达水平显著低 于四环素处理的H印AD38细胞。
[0031]图 2:western blot验证SIRT3 过表达。
[0032] 图3 :Real-time PCR检测SIRT3对HBV复制中间体表达的影响；其中，图3A表示 通过real-time PCR检测发现在SIRT3过表达后H印G2. 2. 15细胞中HBV复制中间体的表 达水平下降了约75%;图3B表示SIRT3过表达后H印AD38细胞中HBV复制中间体的表达 水平下降了约55%。
[0033] 图4:Southernblot检测过表达SIRT3对HBV复制中间体表达的影响，M:marker; rcDNA:不饱和双链DNA;dsDNA:双链线性DNA;ssDNA:单链线性DNA。
[0034] 图5 :Western blot检测过表达SIRT3对病毒蛋白HBc表达的影响。
[0035] 图6 :ELISA分析过表达SIRT3对HBV抗原分泌的影响。
[0036] 图7 :RT-PCR检测过表达SIRT3对HBV3. 5kbmRNA表达的影响。
[0037] 图8 :Real_time PCR和southern blot检测过表达SIRT3对环化HBV复制的影 响；其中图8A表示real-time PCR分析发现SIRT3过表达后，环化的HBV的复制水平下降 了约45% ;图8B表示southern blot进一步证实过表达SIRT3抑制HBV的复制。
[0038] 图9Westernblot检测SIRT3基因沉默效果。
[0039] 图10 :Real-time PCR验证SIRT3基因沉默对HBV复制中间体表达的影响；图10A 表示通过real-time PCR检测发现H印G2. 2. 15细胞在转染siSIRT3-l和siSIRT3-2后， HBV复制中间体的表达水平分别升高约75%和130% ;图10B表示H印AD38细胞在转染 siSIRT3-l和siSIRT3-2后，HBV复制中间体的表达水平分别升高约50%和95%。
[0040] 图11 :Southern blot检测SIRT3基因沉默对HBV复制中间体表达的影响。
[0041] 图12:Westernblot检测SIRT3基因沉默对HBc表达的影响。
[0042] 图13 :ELISA分析SIRT3基因沉默