rn blot检测发现SIRT3的蛋白表达水平在HBV稳定复制细胞系 H印G2. 2. 15显著低于对照细胞H印G2(如图IA所示），同时我们也检测了SIRT3在另一个 KW稳定复制细胞系HepAD38(四环素处理时HBV不复制）中的表达水平，western blot 分析证实SIRT3在四环素未处理的H印AD38细胞中的表达水平显著低于四环素处理的 HepAD38细胞（如图IB所示）。表明SIRT3在HBV复制细胞系中的表达水平显著降低。
[0072] 2.过表达SIRT3对HBV复制的影响
[0073] 首先，为了验证过表达SIRT3对HBV复制的影响，我们分别将25XIO4的 H印G2. 2. 15细胞和20XIO4的H印AD38细胞接种于六孔板，24h后分别转染SIRT3过表达质 粒（Addgene,货号#13814)和空白对照质粒，5d后裂解细胞，提取细胞蛋白，westernblot 证实SIRT3成功过表达（如图2所示）；同时，提取HBV复制中间体，通过real-timePCR 检测发现在SIRT3过表达后H印G2. 2. 15细胞中HBV复制中间体的表达水平下降了约75% (如图3A所示），HepAD38细胞中HBV复制中间体的表达水平下降了约55 % (如图3B所 示），southernblot检测进一步证实过表达SIRT3显著抑制了HBV复制中间体的表达（图 4)〇
[0074] 其次，我们也检测了过表达SIRT3对HBV蛋白表达的影响，westernblot检测发 现SIRT3显著抑制了H印G2. 2. 15和H印AD38细胞中HBVcore(HBc)蛋白的表达（如图5 所示），ELISA分析发现SIRT3也明显抑制了HBsAg和HBeAg的分泌，抑制率分别约为25% 和26% (如图6所示）。
[0075] 再次，我们也检测了过表达SIRT3对HBV复制的模板HBV3. 5kbmRNA表达的影 响，RT-PCR分析证实SIRT3显著抑制了H印G2. 2. 15和H印AD38细胞中HBV3. 5kbmRNA的 表达水平，抑制率分别约为80%和70% (如图7所示）。
[0076] 最后，我们也检测了过表达SIRT3对外源性HBV复制的影响，我们将16X IO4的 Huh-7细胞接种于六孔板，24h后共转染环化HBV和SIRT3表达质粒及对照质粒，3d后提取 HBV复制中间体，real-time PCR分析发现SIRT3过表达后，环化的HBV的复制水平下降了 约45%(如图8A所示），southern blot进一步证实过表达SIRT3抑制HBV的复制（如图 8B所示）。
[0077] 3. SIRT3沉默对HBV复制的影响
[0078] 首先，我们分别将25X104的H印G2. 2. 15细胞和20X104的H印AD38细胞接种于 六孔板，24h后分别转染靶向沉默SIRT3的siSIRT3-l、siSIRT3-2和siCont，si-SIRT3-l: GCCCGACAUUGUGUUCUUUTT(SEQ ID NO. 5)；
[0079]si-SIRT3-2:CCAGUGGCAUUCCAGACUUTT(SEQIDNO. 6)〇
[0080] 5d后提取细胞总蛋白，westernblot验证SIRT3在两个细胞系中的沉默是有 效的（如图9所示）；同时，我们提取了HBV复制中间体，通过real-timePCR检测发现 H印G2. 2. 15细胞在转染siSIRT3-l和siSIRT3-2后，HBV复制中间体的表达水平分别升高 约 75%和 130% (如图IOA所示），IfepAD38 细胞在转染siSIRT3-l和siSIRT3-2 后，HBV 复制中间体的表达水平分别升高约50%和95% (如图IOB所示），southernblot检测进 一步证实SIRT3沉默显著促进了HBV复制中间体的表达（如图11所示）。
[0081] 其次，我们也检测了SIRT3沉默对HBV蛋白表达的影响，westernblot检测发 现SIRT3沉默明显促进了H印G2. 2. 15和HepAD38细胞中HBc蛋白的表达（如图12所 示），ELISA分析发现SIRT3沉默也明显促进了HBsAg和HBeAg的分泌（如图13A所示）， siSIRT3-l和siSIRT3-2转染后HBsAg的分泌分别增加约30%和35%，HBeAg的分泌分别 增加约35%和40% (如图13B所示）。
[0082] 再次，我们也检测了SIRT3沉默对HBV3. 5kbmRNA表达的影响，RT-PCR分析证实 SIRT3沉默明显促进了HBV3. 5kbmRNA的表达，在H印G2. 2. 15细胞中转染siSIRT3-l和 siSIRT3-2转染后HBV3. 5kbmRNA的表达分别升高约85%和115% (如图14A所示），在 IfepAD38细胞中转染siSIRT3-l和siSIRT3-2转染后HBV3. 5kbmRNA的表达分别升高约 70%和90% (如图14B所示）。
[0083] 最后，我们也检测了SIRT3沉默对环化HBV复制的影响，在Huh-7细胞中分别共转 染环化HBV和siSIRT3-l，siSIRT3-2 及siCont, 3d后提取HBV复制中间体，real-timePCR 分析发现8丨31訂3-1和以31訂3-2转染后，环化的耶￥的复制水平分别升高了约100%和 65% (如图15A所示），southernblot进一步证实SIRT3沉默促进了HBV的复制（如图 15B所示）。
[0084] 4.SIRT3 对HBVcccDNA表达的影响
[0085]HBVcccDNA作为HBV3. 5kbmRNA转录的模板，是HBV复制最原始的模板，我们也 检测了SIRT3对HBVcccDNA表达的影响。在H印AD38细胞中过表达SIRT3后，Hirt法提取 HBVcccDNA，TaqMan探针real-timePCR分析发现HBVcccDNA的表达水平下降了约50% (图16)。为进一步确定SIRT3对HBVcccDNA表达的影响，我们用siSIRT3-l和siSIRT3-2 沉默SIRT3表达后，TaqMan探针real-timePCR分析证实HBVcccDNA的表达水平分别升 高约70%和105% (如图17所示），表明SIRT3明显抑制HBVcccDNA的表达。
[0086] 以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限 制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围 和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体 优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。 事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括 在本发明的范围内。
【主权项】
1. 分离的SIRT3基因在筛选乙型肝炎治疗药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，将分离的SIRT3基因用于筛选乙型肝炎治 疗药物，是指将SIRT3基因作为药物或制剂针对乙型肝炎病毒的作用靶标应用于筛选乙型 肝炎治疗药物或制剂。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述将SIRT3基因作为药物或制剂针对乙 型肝炎病毒的作用靶标应用于筛选乙型肝炎治疗药物或制剂具体是指：将SIRT3基因作为 作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以提高或促进SIRT3基因表达的药物作为乙 型肝炎治疗备选药物。4. 一种筛选乙型肝炎治疗药物的方法，包括步骤： (1) 将待测物质加入表达SIRT3基因的体系中； (2) 检测所述体系中SIRT3基因的转录或表达水平，其中，与未加入待测物质的实验相 比，若所述待测物质能够促进或提高SIRT3基因的表达或提高SIRT3蛋白酶活性，则表明该 待测物质可作为候选乙型肝炎治疗药物。5. 分离的SIRT3基因/蛋白在制备或筛选乙型肝炎诊断试剂中的用途。6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述SIRT3基因/蛋白作为生物标志物。7. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于，将SIRT3基因/蛋白作为生物标志物用于 制备乙型诊断试剂，是指将SIRT3基因/蛋白作为基于检测SIRT3基因/蛋白含量的乙型 肝炎诊断试剂的标准品或阳性对照，用于样本血清中的SIRT3基因/蛋白的检测。8. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于，将SIRT3基因/蛋白作为生物标志物用于 筛选乙型肝炎诊断试剂，是指将SIRT3基因/蛋白作为靶标应用于乙型肝炎诊断试剂的筛 选。9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于，可以基于所述的SIRT3基因的序列，筛 选特异性扩增SIRT3基因转录本的引物从而作为检测乙型肝炎的试剂，来检测样本血清中 SIRT3基因水平；或者，可以基于所述SIRT3蛋白，筛选特异性针对SIRT3蛋白的抗体，来检 测样本血清中SIRT3蛋白水平。10. -种乙型肝炎诊断试剂盒，包括特异性扩增SIRT3基因转录本的引物或特异性抗 SIRT3蛋白的抗体。
【专利摘要】本发明涉及药物研发领域，具体公开了SIRT3基因的用途及其相关药物。本发明首次发现，SIRT3在HBV复制细胞系中的显著低表达。过表达SIRT3能够显著抑制HBV复制。沉默SIRT3能够显著促进HBV复制。基于上述研究成果，本发明首次提供了分离的SIRT3基因在筛选乙型肝炎治疗药物以及在制备或筛选乙型肝炎诊断试剂中的用途，并提供了一种筛选乙型肝炎治疗药物的方法，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】G01N33/573, G01N33/96, C12Q1/68
【公开号】CN105087811
【申请号】CN201510593924
【发明人】陈娟, 黄爱龙, 周莉
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月18日