用于鉴定广金钱草类型的引物组、试剂盒以及鉴定广金钱草类型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及用于鉴定广金钱草类型的引物组、用于 鉴定广金钱草类型的试剂盒以及鉴定广金钱草类型的方法。
【背景技术】
[0002] 广金钱草，中药名，为豆科植物广金钱草的干燥地上部分。其功效为利湿退黄，利 尿通淋，主治黄疸尿赤，热淋，石淋，小便涩病，水肿尿少。分布于福建、湖南、广西和广东等 省区。
[0003] 然而，目前对于广金钱草的鉴定仍有待改进。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于 提出一种用于鉴定广金钱草类型的引物组、一种用于鉴定广金钱草类型的试剂盒以及一种 鉴定广金钱草类型的方法。利用用于鉴定广金钱草类型的引物组、用于鉴定广金钱草类型 的试剂盒以及鉴定广金钱草类型的方法可以客观、准确或者稳定地鉴定出广金钱草的类 型。
[0005] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0006] 经过文献调查、市场调查以及实地调查等多种途径对广金钱草药用植物野生资源 和栽培资源进行考察，发现广金钱草野生资源分布稀疏且数量较少，栽培资源成为市场主 要流通商品。此外，野生药材与栽培药材、不同产区栽培药材之间存在有效成分含量差异大 等质量差异，而药材的良莠对产品的质量具有重要影响，在生产过程中必须对其进行严格 控制。根据其外部形态、断面等特征进行性状鉴别，具有一定的主观性，对鉴别者专业知识 及经验要求很高，且该技术仅能鉴别广金钱草的真伪，无法判断其分布区域，现已经不能满 足市场的需求。
[0007] 本发明的发明人经过大量实验发现，分别采集不同区域的广金钱草作为样本，分 别提取DNA，利用引物对DNA片段进行扩增，然后将扩增的产物进行凝胶电泳，并对电泳结 果进行分析，鉴定出广金钱草类型。
[0008] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于鉴定广金钱草类型的引物组。根据 本发明的实施例，该用于鉴定广金钱草类型的引物组由下列构成：第一引物至第七引物，其 中，所述第一引物至第七引物分别具有SEQIDNO:1~7所示的核苷酸序列。该引物用于 扩增广金钱草基因组DNA上的片段，通过对扩增产物分析，以进一步鉴定广金钱草的类型。 由此，最终得到的用于鉴定广金钱草类型的引物具有下列优点的至少之一：通用性强、利用 该引物鉴定广金钱草类型的准确性高、客观性强以及稳定性高。
[0009] 根据本发明的实施例，上述用于鉴定广金钱草类型的引物组还可以具有下列附加 技术特征至少之一：
[0010] 根据本发明的一个实施例，所述第一引物至第七引物具有相同的摩尔含量。本发 明限定第一引物至第七引物需具有相同的摩尔含量，目的是消除引物的浓度对扩增条带清 晰度或者特异性等扩增效率的影响。由此，根据本发明实施例的用于鉴定广金钱草类型的 引物可以进一步具有较强的通用性、利用该引物鉴定广金钱草类型的较强准确性、较强客 观性或者较高稳定性。
[0011] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于鉴定广金钱草类型的试剂盒。如前 所述，根据本发明的实施例，包括：前面所述的用于鉴定广金钱草类型的引物组。因此，最终 得到的用于鉴定广金钱草类型的试剂盒具有下列优点的至少之一：使用简便、通用性强、利 用该试剂盒鉴定广金钱草类型的准确性高、客观性强以及稳定性高。
[0012] 在本发明的第三方面，本发明提出了一种鉴定广金钱草类型的方法。如前所述，根 据本发明的实施例，包括：（1)对核酸样品进行PCR扩增，以便获得扩增产物，其中，所述核 酸样品含有来自待鉴定广金钱草样本的基因组DNA，所述PCR扩增采用前面所述的引物组 或者前面所述的试剂盒；以及（2)基于所述扩增产物的构成，确定所述待鉴定广金钱草样 本的类型。由于不同类型的广金钱草，其个体间基因的核苷酸序列存在着差异性，通过对广 金钱草基因组DNA片段进行扩增，对扩增产物的构成进行分析，确定广金钱草样本的类型。 由此，最终得到的鉴定广金钱草类型的方法具有下列优点的至少之一：操作简便、引物通用 性强、准确性高、客观性强以及稳定性高。
[0013] 根据本发明的实施例，上述鉴定广金钱草类型的方法还可以具有下列附加技术特 征至少之一：
[0014] 根据本发明的实施例，基于20iiL的反应体系，所述PCR扩增条件为：甲酰胺 0.5yL;10XTaqbuffer2yL;Mg2+2.OyL;模板DNAl.OyL;dNTP1.5yL;引物l.OyL; Taq酶LOiiL;以及余量的ddH20。发明人经过大量实验优化得到PCR扩增条件。添加甲酰 胺能够加强PCR序列分析，防止出现背景强、特异序列分析阶梯弱、模棱两可的信号和过早 的终止等现象。当模板DNA添加量过高，点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景，反之模 板DNA过低，扩增产物强度相应减弱，无扩增产物。当模板DNA浓度为I. 0yL时，扩增产物 基本稳定、条带清晰、稳定且分辨率高。Mg2+为聚合酶的金属辅因子，对影响聚合酶的活性 具有较强的影响。当引物添加量为LOyL时，扩增结果基本一致，但随着引物浓度的逐渐 增加，开始出现弥散背景增强的趋势，并且有些扩增带发生减弱或缺失。由此，根据本发明 实施例的鉴定广金钱草的方法可以进一步具有更简便的操作、较强的引物通用性、较高的 准确性、较强的客观性或者较高的稳定性。
[0015] 根据本发明的实施例，步骤（2)包括：（2-1)对所述扩增产物进行凝胶电泳；以及 (2-2)基于所述凝胶电泳在预定长度区域是否出现条带，确定所述待鉴定广金钱草样本的 类型。对至少两个广金钱草核酸样本进行PCR扩增，随后进行凝胶电泳，预定长度区域出现 条带的样本和未出现条带的样本具有差异性，根据此差异确定广金钱草的类型。由此，根据 本发明实施例的鉴定广金钱草的方法可以进一步具有更简便的操作、较强的引物通用性、 较高的准确性、较强的客观性或者较高的稳定性。
[0016] 根据本发明的实施例，在步骤（2-1)中，所述凝胶电泳的条件为：1. 5%琼脂糖凝 胶，电泳电压为llOV/cm，电泳时间90分钟。发明人经过大量实验，琼脂糖凝胶浓度、电泳 电压及电泳时间对能否得到清晰条带至关重要。发明人经过条件筛选，意外地发现，当琼脂 糖凝胶的浓度为I. 5%，电泳电压为110V/cm，电泳时间为90分钟时，能够有效地对扩增产 物DNA样本进行区分，发明人发现，当琼脂糖凝胶的浓度超过1. 5%时，DNA分子在琼脂糖凝 胶中的移动速度非常缓慢，造成所有的条带都集中在一个较小的区域中，难以区分，造成电 泳时间长，琼脂糖凝胶发热严重，容易融化。如果琼脂糖凝胶的浓度低于1. 5%时，会造成 DNA分子在琼脂糖凝胶中的移动速度非常快，同样会导致所有的条带都集中在一个较小的 区域中，难以区分，甚至会脱离琼脂糖凝胶进入电解液中，造成电解液污染。另外，发明人发 现，如果电泳时间超过90分钟，会使得待测样品条带和Marker可能脱离凝胶，造成电解液 污染，如果电泳时间低于90分钟，则会造成待测样品条带无法与其他DNA分子有效地区分 开。如果电泳电压超过llOV/cm，则会造成DNA分子在琼脂糖凝胶中的移动速度过快，所有 的DNA分子均集中在较小的区域内，从而难以区分，同时在高电压下凝胶会发热较快而导 致胶融化。如果电压过低，则会造成DNA分子在琼脂糖凝胶中的移动速度非常缓慢，造成所 有的条带都集中在一个较小的区域中，难以区分。由此，根据本发明实施例的鉴定广金钱草 的方法可以进一步具有更简便的操作、较强的引物通用性、较高的准确性、较强的客观性或 者车父尚的稳定性。
[0017] 根据本发明的实施例，所述预定长度区域是基于已知类型的广金钱草样本确定 的。由此，根据本发明实施例的鉴定广金钱草的方法可以进一步具有更简便的操作、较强的 引物通用性、较高的准确性、较强的客观性或者较高的稳定性。
[0018] 根据本发明的实施例，所述已知来源的广金钱草样本来自于下列产地至少之一： 桂林市临桂区中庸乡仓库岭村；柳州市融安县泗顶镇三坡村；梧州市苍梧县新地镇都梅 村；来宾市兴宾区桥巩乡吉林村；桂林市临桂县五通镇东岭村；桂林市临桂县宛田镇；桂林 市临桂区中庸乡中庸村；湛江市遂溪县乌塘镇；湛江市遂溪县城月镇实荣村；惠州市博罗 县罗阳镇光头村；汕尾市海丰县梅龙镇银液九径村；湛江市遂溪县乌塘镇；惠州市博罗县 罗阳镇巷口村；紫金县蓝塘镇市北村；以及化州市河西长堤路。广金钱草主要分布于福建、 湖南、广西和广东等省区，所以在上述地区进行样本采集。由此，根据本发明实施例的鉴定 广金钱草的方法可以进一步具有更简便的操作、较强的引物通用性、较高的准确性、较强的 客观性或者较高的稳定性。
[0019] 在本发明的第四方面，本发明提出了一种鉴定广金钱草类型的方法。根据本发明 的实施例，所述方法包括：
[0020] (3-1)广金钱草植物基因组DNA的提取
[0021] 采集到的新鲜广金钱草叶片经变色硅胶吸水干燥后用无水乙醇洗净叶片表面，待 无水乙醇挥干后用剪刀剪成细小的碎片，加入液氮后迅速用球磨仪研磨成粉末。
[0022] 将磨好的叶片粉末（约30mg)迅速加入到800yL预热到65°C的DNA提取缓冲液 (预先加入RNase50yg)中65°C水浴25分钟，每5分钟将EP管颠倒数次，防止叶片粉末 结块。取出EP管，置于冰上，加入等体积的Tris-饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1)，充分摇 勾后放入离心机，20°C下1000 Orpm离心lOmin，取600yL上清液。向上清液中加入等体积 氯仿：异戊醇（24:1)，摇匀后放入离心机中，20°C下1000 Orpm离心lOmi