丝栗栲和米槠微卫星标记的特异性引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因组DNA分子标记技术领域，具体涉及丝栗栲和米槠微卫星标 记的特异性引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 微卫星（microsatellite)，又称简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR)， 是指以1~6个核苷酸为单位，多次串联重复的DNA序列，其普遍存在于真核生物和原核 生物的基因组中，甚至在病毒基因组中亦有存在。SSR分子标记具有以下特点：重复单元和 重复次数高度可变，多态性信息容量高；呈共显性，遵循孟德尔法则遗传；侧翼序列相对保 守；选择中性等。
[0003] 基于以上特点，微卫星分子标记被广泛应用于物种的指纹鉴定、遗传图谱构建、群 体遗传结构分析、比较基因组及进化研究等诸多研究领域。根据建立SSR标记的序列性质 不同，SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR)。随着新一代测序 技术的发展，物种的EST序列增长迅速，基于EST序列来开发植物的SSR分子标记已成为一 种经济有效的途径。
[0004] 丝栗栲（CastanopsisfargesiiFranch)与米槠（Castanopsis carlesii(Hemsl.)Hayata)同属壳斗科（Fagaceae)拷属（苦木拷属）Castanopsis(D.Don) Spach，该属植物种类繁多，且分布较广。丝栗栲又名大丝栗栲、丝栗树，为常绿乔木，具适应 广、萌芽更新容易、生长快、用途广等特点，主要分布在亚洲热带、亚热带地区，是中亚热带 常绿阔叶林中十分重要的群系。中亚热带丝栗栲次生林群落物种组成丰富，生态服务价值 较高，对改善中亚热带用材林的景观结构、提高人工林生境多样性和生态系统稳定性具有 重要意义。而米槠是南方常绿阔叶林重要组成树种之一，也是优良的观赏树种，是当今生态 建设和绿化、美化城乡的主要树种，其涵养水源、保持水土、防灾减灾等生态功能很强，是重 要的工业原料和食用菌生产原料。
[0005] 目前，多采用植物生理学和生态学的方法来研究丝栗栲和米槠等栲属植物，而以 分子标记的手段研究丝栗栲和米槠的群体遗传多样性、遗传分化和结构等研究相对滞后， 严重影响了栲属群体的开发和利用。相对于栲属植物的重要地位来说，栲属中所能使用 的SSR引物至今为止仍然很少，Huang等通过构建富集文库筛选到中华栲（Castanopsis chinensis)的 12 对SSR引物；Shi等获得苦槠栲（C.sclerophylla)的 10 对SSR引物；Ueno 等开发了尖叶栲（C.cuspidata)的13对SSR引物和日本栲（C.sieboldii)的16对SSR引 物。除此之外，对于丝栗栲和米槠的SSR标记开发鲜有报道，徐立安等曾采用通用性检测的 方法开发了适用于栲树群体遗传结构研究的6对SSR引物，而未见丝栗栲和米槠EST-SSR 和基因组SSR的开发报道。因此，需要进行丝栗栲和米槠SSR分子标记的开发，以增加位点 数，更好的为丝栗栲和米槠等栲属植物的群体遗传分化与结构、群体的遗传多样性水平、群 体间的基因流及交配系统等方面的研究服务。此外，米槠及其它部分栲属植物由于EST序 列数量的限制，现阶段难以开发EST-SSR分子标记，因此，需要从同属植物中开发EST-SSR 应用于米槠的遗传多样性检测。
【发明内容】
[0006] 本发明针对目前丝栗栲和米槠SSR标记开发难度大、SSR标记数量少的不足提供 丝栗栲和米槠微卫星标记的特异性引物及检测方法。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种丝栗栲微卫星标记的特异性引物，其特征在于， 所述的微卫星标记的特异性引物如下所示：
[0008]特异性引物Slk4-2:F:TCCTGITCAAGGCCATCT(如SEQIDNO.1所示），R: ATCCACAITTCGGACACC(如SEQIDNO. 2 所示）；
[0009]特异性引物Slk5-1:F:GGTAATCGGITTAGGACA(如SEQIDNO. 3 所示），R: 5'-TAITCCGCTATCGCAGTC(如SEQIDNO. 4 所示）；
[0010] 特异性引物Slk8-1:F:AGITTGCTGCCTGCCACAT(如SEQIDNO. 5 所示），R: 5'-TTTGCCCACTTGCTCCCT(如SEQIDNO. 6 所示）；
[0011] 特异性引物Slk9-1:F:AAATGCTTGGTGGGAGCG(如SEQIDNO. 7 所示），R: GAGAITGGCACGATGGAC(如SEQIDNO. 8 所示）；
[0012] 特异性引物Slkl〇-2:F:AGTCTCAGATAAAATCCCAATA(如SEQIDNO. 9 所示），R: CTTTCCATCACCTTAGTCCA(如SEQIDNO. 10 所示）；
[0013] 特异性引物Slkll-I:F:AGCAAACCAGCCAACAAG(如SEQIDNO. 11 所示），R: GGGCCACAAATGATAACACTAA(如SEQIDNO. 12 所示）；
[0014]特异性引物Slkl2-2:F:ACACTGACAGCCACCACT(如SEQIDNO. 13 所示），R: CTCACGCAACCTTCTTCT(如SEQIDNO. 14 所示）；
[0015]特异性引物Slkl3-1:F:GCCCGTCCCTTTCTTCTC(如SEQIDNO. 15 所示），R: TGGGTGGATCACAGTITT(如SEQIDNO. 16 所示）。
[0016] 本发明丝栗栲微卫星标记的特异性引物，是通过以下方法获得的：
[0017] (1)丝栗栲DNA序列的获得：用丝栗栲的拉丁文学名Castanopsisfargesii作为 关键词，在美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库（GenBank)中检索并下载获得丝栗 栲DNA序列；
[0018] (2)序列处理和含有微卫星DNA序列的筛选：用在线拼接和去冗余程序对下载的 序列进行拼接处理，然后用Perl语言编制的微卫星分析程序和在线微卫星位点分析软件， 对拼接处理后的序列进行微卫星位点的筛选，获得含有微卫星位点的丝栗栲DNA序列；
[0019] (3)引物设计：用批量引物设计软件设计扩增含有微卫星位点的DNA聚合酶链式 反应引物，引物碱基数为18-22个，同一位点的两个引物退火温度差小于4°C，扩增得到的 DNA片段大小在400个碱基以内；
[0020] (4)引物筛选：以丝栗栲基因组DNA为模板，利用上述设计的引物分别进行DNA聚 合酶链式反应扩增，得到的PCR扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、显色后拍照，根据谱 带信息进行分析，筛选得到丝栗栲卫星标记的特异性引物。
[0021] 本发明的第二个目的是提供一种丝栗栲微卫星标记的检测方法，其特征在于，包 括以下步骤：
[0022] (1)提取丝栗栲基因组DNA;
[0023] (2)以步骤⑴提取的基因组DNA为模板，利用所述的丝栗栲微卫星标记的特异性 引物中的每个引物对分别进行PCR扩增；
[0024] (3)利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分型。
[0025] 所述步骤（2)中的PCR扩增，其扩增体系优选为：10Xbufferlyl，25mmol/L MgCl2O. 6y1，lOmmol/LdNTP0? 6y1，DNA聚合酶（5U/yL)0.Iy1，DNA模板 50-100ng，弓I 物（25mmol/L)F和R各0? 5y1，双蒸水定容至10y1。
[0026] 所述步骤（2)中的PCR扩增，其扩增反应程序优选为：94°C预变性5min;94°C变 性40sec，各微卫星引物对退火温度下复性60sec，72°C延伸60sec，34个循环；最后70°C 延伸5min，4°C保存；丝栗栲微卫星标记的特异性引物的退火温度分别为：Slk4-2 :55°C; Slk5-1 ：54〇C；Slk8-l：54〇C；Slk9-l：57〇C；Slkl〇-2 ：54〇C；Slkll-l：55〇C；Slkl2-2 ：57〇C； Slkl3-1 :56°C〇
[0027] 所述步骤（3)中的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳优选使用8%的凝胶浓度。
[0028] 本发明的第三个目的是提供一种米槠微卫星标记的特异性引物，其特征在于，其 序列与上述的丝栗栲微卫星标记的特异性引物序列相同。
[0029] 本发明的第四个目的是提供一种米槠微卫星标记的检测方法，其特征在于，是将 上述的检测方法中的丝栗栲基因组DNA替换为米槠基因组DNA，其余步骤均相同。
[0030] 本发明利用公共数据库中现有的丝栗栲核苷酸序列，应用生物信息学方法，开发 出适用于米槠的丝栗栲微卫星分子标记，并应用于丝栗栲和米槠的遗传多样性检测。
[0031] 本发明的有益效果是：
[0032] 1.本发明建立了丝栗栲和米槠的EST-SSR分子标记开发方法，相对于其它丝栗栲 和米槠微卫星的开发方法，本方法具有快速、简单、稳定和低成本的优点，对栲属植物的分 子标记开发具有重要的实用价值。
[0033] 2.米槠及其它部分栲属植物由于EST序列数量的限制，现阶段难以开发EST-SSR 分子标记，本发明开发的丝栗栲SSR分子标记适用于米槠的遗传多样性检测，解决了米槠 的这一问题，为米槠开发了新一批的EST-SSR分子标记的同时，也为其它栲属植物EST-SSR 分子标记的开发提供参考。
[0034] 3.本发明开发的丝栗栲微卫星分子标记，可应用于丝栗栲和米槠的群体遗传多样 性检测，为栲属植物提供了新一批的微卫星分子标记，增加了位点数，也为丝栗栲和米槠等 栲属植物的群体遗传分化与结构、群体的遗传多样性水平、群体间的基因流及交配系统等 研究提供了新的工具。
【附图说明】
[0035] 图1是引物Slk4_2在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0036] 图2是引物Slk5_l在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0037] 图3是引物Slk8_l在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0038] 图4是引物Slk9_l在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0039] 图5是引物Slkl〇-2在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0040] 图6是引物Slkll-I在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0041] 图7是引物Slkl2-2在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0042] 图8是引物Slkl3_l在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0043] 图9是引物Slk4_2在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0044] 图10是引物Slk5_l在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0045] 图11是引物Slk8_l在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0046] 图12是引物Slk9_l在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0047] 图13是引物Slkl〇-2在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0048] 图14是引物Slkll-I在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0049] 图15是引物Slkl2_2在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
[0050] 图16是引物Slkl3_l在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。
【具体实施方式】
[0051] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0052] 实施例1
[0053] 本发明丝栗栲微卫星分子标记的开发及其应用经过下列步骤：
[0054] 1.丝栗栲DNA序列的获得
[0055] 用丝栗栲的拉丁文学名（Castanopsisfargesii)作为关键词，在美国国立卫生研 究院维护的基因序列数据库（GenBank:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行检索，下载 已登录的丝栗栲核苷酸序列，并以fasta文件形式进行保存。
[0056] 2.丝栗栲DNA序列处理和含有微卫星DNA序列的筛选
[0057] 用在线拼接（CAP3)和去冗余程序（CD-HIT)对下载的序列进行拼接处理，然后 用Perl语言编制的微卫星分析程序（MISA)和在线微卫星位点分析软件（Microsatellite