RepeatsFinder)，对处理后的序列进行微卫星位点的筛选，获得含有微卫星位点的丝栗栲 DNA序列。
[0058] 3?引物设计
[0059] 用批量引物设计软件Primer3. 0设计DNA聚合酶链式反应扩增引物，引物大小在 18-22个碱基，扩增片段长度在400个碱基以内，两条引物退火温度相差不超过4°C。当一 条DNA序列中含有两个微卫星位点，且两个微卫星位点相距100个碱基以上时，对两个微卫 星位点分别设计引物；当两个微卫星位点在同一序列中相距100个碱基以内时，引物设计 时放弃将两个位点放在一对引物的扩增范围内。
[0060] 4.丝栗栲微卫星标记特异性引物的获得
[0061] (I)DNA聚合酶链式反应扩增
[0062] 通过PCR方法用设计好的微卫星标记引物扩增丝栗栲基因组DNA，扩增体系和 条件如下：反应体系为l〇yl，其中包括=IOXbUfferlyl，MgCl2(25mmol/L)0.6yl， dNTP(lOmmol/L) 0? 6yI，DNA聚合酶（5U/yI) 0?IyI，DNA模板 50-100ng，两引物（25mmol/ L)F和R各0. 5yl，用双蒸水定容至10yl。聚合酶链式反应程序为：94°C预变性5min，34 个循环（94°C变性40sec，各微卫星引物对退火温度下复性60sec，72°C延伸60sec)，最后 70°C延伸5min后4°C保存，从而获得扩增产物。
[0063] (2)电泳分离和银染检测
[0064] 扩增产物中加变性缓冲液（包含98%甲酰胺，lOmmol/LpH8. 0的EDTA，0. 25%溴 酚蓝和0.2%二甲苯氰），用8% (质量含量）变性聚丙烯酰胺凝胶（厚度I.O毫米左右） 和IXTBE电泳缓冲液，上样20ng，恒压120V电泳90min后银染检测。银染方法主要过程 如下：电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盆中；加入固定液（含10%无 水乙醇和0. 5%的乙酸），在摇床上轻微震荡15min进行固定，然后去离子水漂洗2次，每次 2min;放入0. 1 %硝酸银染色液中摇床上轻微震荡IOmin染色，然后用去离子水漂洗2次， 每次5sec;将凝胶置入显色液中（含有1.5%氢氧化钠，0.014%的四硼酸钠），在摇床上轻 微震荡直至条带清晰且条带数不再增加为止；加入固定液，终止显色反应，用蒸馏水漂洗几 分钟；去除凝胶和玻璃板上的水珠。放在白光灯下观察并用数码相机拍照。
[0065] 5.微卫星分子标记在丝栗栲群体遗传多样性检测中的应用
[0066] 将引物对Slk4-2(F和R)、Slk5-1(F和R)、Slk8-1(F和R)、Slk9-1(F和R)、 Slkl〇-2(F和R)、Slkll-l(F和R)、Slkl2-2(F和R)和Slkl3-1(F和R)分别按照上述步骤 4的DNA聚合酶链式反应扩增、电泳分离和银染检测的方法，对20个丝栗栲个体基因组DNA 进行遗传多样性检测。各引物的序列如SEQIDNO. 1-16所示，退火温度详见表1。
[0067] 表1丝栗栲微卫星分子标记DNA聚合酶链式反应扩增引物及其退火温度
[0068]
[0069]米用NTSYS_pcversion2. 11 软件处理数据，米用PopgeneI. 32(YehandBoyle， 1997)分析基因型数据及基因频率，计算丝栗栲观测杂合度和期望杂合度，并进行哈迪-温 伯格（Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)及连锁不平衡检验，以此来描述8个丝栗栲DNA 多态位点的特征。本发明用上述方法获得8个微卫星标记，特异性引物Slk4-2来源于微 卫星标记序列如SEQIDNO. 17所示，特异性引物Slk5-1来源于微卫星标记序列如SEQID NO. 18所示，特异性引物SlkS-I来源于微卫星标记序列如SEQIDNO. 19所示，特异性引 物Slk9-1来源于微卫星标记序列如SEQIDNO. 20所示，特异性引物Slkl〇-2来源于微卫 星标记序列如SEQIDNO. 21所示，特异性引物Slkll-I来源于微卫星标记序列如SEQID NO. 22所示，特异性引物Slkl2-2来源于微卫星标记序列如SEQIDNO. 23所示，特异性引物 Slkl3-1来源于微卫星标记序列如SEQIDNO. 24所示。各微卫星位点的遗传学参数如表2 所示，扩增检测结果分别如图1-8所示，上述的8个微卫星标记在供试的20个丝栗栲个体 中都表现出多态性，并且都符合哈迪-温伯格平衡（P>〇. 05)。结合后续分析结果表明，上述 的8个引物对能用于分析丝栗栲的遗传多样性和遗传结构，是一种有效可靠的丝栗栲微卫 星标记特异性引物。
[0070] 表2微卫星位点在丝栗栲群体中的遗传学参数
[0071]
[0072] 6.微卫星分子标记在米槠中的通用性检测
[0073] 将上述获得的8个丝栗栲微卫星标记的特异性引物对参照上述丝栗栲群体遗传 多样性检测方法，对20个米槠个体基因组DNA进行遗传多样性检测，检测其在米槠中的通 用性。丝栗栲微卫星标记的特异性引物对Slk4-2 (F和R)、Slk5-l(F和R)、Slk8-l(F和R)、 Slk9-1(F和R)、Slkl〇-2(F和R)、Slkll-l(F和R)、Slkl2-2(F和R)和Slkl3-1(F和R)扩 增米槠基因组DNA的检测结果分别如图9-16所示，各微卫星位点在米槠群体中的遗传学参 数如表3所示，由图9-16和表3可以看出，在供试的20个米槠个体中8个微卫星序列的长 度均表现出多样性，并且都符合哈迪-温伯格平衡（P>〇. 05)，由此可见，上述的8个微卫星 标记在米槠中通用，也能用于分析米槠的遗传多样性和遗传结构，具有很高的重复性。
[0074] 表3微卫星位点在米槠群体中的遗传学参数
[0075]
【主权项】
1. 一种丝栗栲微卫星标记的特异性引物，其特征在于，所述的微卫星标记的特异性引 物如下所示： 特异性引物 Slk4-2 :F:TCCTGITCAAGGCCATCT，R:ATCCACAITTCGGACACC ; 特异性引物Slk5-1 :F :GGTAATCGGITTAGGACA，R :5' -TAITCCGCTATCGCAGTC ; 特异性引物 Slk8-1 :F:AGITTGCTGCCTGCCACAT，R :5'-ITTGCCCACTTGCTCCCT ; 特异性引物 Slk9-1 :F:AAATGCTTGGTGGGAGCG，R:GAGAITGGCACGATGGAC ; 特异性引物 Slkl〇-2 :F:AGTCTCAGATAAAATCCCAATA，R:CTTTCCATCACCTTAGTCCA ; 特异性引物Slkll-I :F :AGCAAACCAGCCAACAAG，R :GGGCCACAAATGATAACACTAA ; 特异性引物 Slkl2-2 :F:ACACTGACAGCCACCACT，R:CTCACGCAACCTTCTTCT ; 特异性引物Slkl3-1 :F :GCCCGTCCCTTTCTTCTC，R :TGGGTGGATCACAGITIT。2. -种丝栗栲微卫星标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取丝栗栲基因组DNA ; (2) 以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的丝栗栲微卫星标记的 特异性引物中的每个引物对分别进行PCR扩增； (3) 利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分型。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2)中的PCR扩增的体系 为：10XbufTer Iy l，25mmol/L MgCl2 0.6 yl，10mmol/L dNTP 0.6 yl，5U/yl DNA聚合酶 0? I y I，DNA 模板 50-100ng，25mmol/L 引物 F 和 R 各 0? 5 y I，双蒸水定容至 10 y 1。4. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2)中的PCR扩增，其扩 增反应程序为：94°C预变性5min ;94°C变性40sec，各微卫星引物对退火温度下复性60sec， 72°C延伸60sec，34个循环；最后70°C延伸5min，4°C保存；丝栗栲微卫星标记的特异性引 物的退火温度分别为：Slk4-2 :55°C ;Slk5-l :54°C ;Slk8-l :54°C ;Slk9-l :57°C ;Slkl〇-2 : 54°C ;Slkll-l :55°C ;Slkl2-2 :57°C ;Slkl3-l :56°C。5. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（3)中的变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳使用8%的凝胶浓度。6. -种米槠微卫星标记的特异性引物，其特征在于，所述的微卫星标记的特异性引物 如下所示： 特异性引物 Slk4-2 :F:TCCTGITCAAGGCCATCT，R:ATCCACAITTCGGACACC ; 特异性引物Slk5-1 :F :GGTAATCGGITTAGGACA，R :5' -TAITCCGCTATCGCAGTC ; 特异性引物 Slk8-1 :F:AGITTGCTGCCTGCCACAT，R :5'-ITTGCCCACTTGCTCCCT ; 特异性引物 Slk9-1 :F:AAATGCTTGGTGGGAGCG，R:GAGAITGGCACGATGGAC ; 特异性引物 Slkl〇-2 :F:AGTCTCAGATAAAATCCCAATA，R:CTTTCCATCACCTTAGTCCA ; 特异性引物Slkll-I :F :AGCAAACCAGCCAACAAG，R :GGGCCACAAATGATAACACTAA ; 特异性引物 Slkl2-2 :F:ACACTGACAGCCACCACT，R:CTCACGCAACCTTCTTCT ; 特异性引物Slkl3-1 :F :GCCCGTCCCTTTCTTCTC，R :TGGGTGGATCACAGITIT。7. -种米槠微卫星标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取米槠基因组DNA ; (2) 以步骤⑴提取的基因组DNA为模板，利用权利要求6所述的米槠微卫星标记的特 异性引物中的每个引物对分别进行PCR扩增； (3)利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分型。8. 根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2)中的PCR扩增的体系 为：10XbufTer Iy l，25mmol/L MgCl2 0.6 yl，10mmol/L dNTP 0.6 yl，5U/yl DNA聚合酶 0? I y I，DNA 模板 50-100ng，25mmol/L 引物 F 和 R 各 0? 5 y I，双蒸水定容至 10 y 1。9. 根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2)中的PCR扩增，其扩 增反应程序为：94°C预变性5min ;94°C变性40sec，各微卫星引物对退火温度下复性60sec， 72°C延伸60sec，34个循环；最后70°C延伸5min，4°C保存；米槠微卫星标记的特异性引物 的退火温度分别为：Slk4-2 :55°C ;Slk5-l :54°C ;Slk8-l :54°C ;Slk9-l :57°C ;Slkl〇-2 : 54°C ;Slkll-l :55°C ;Slkl2-2 :57°C ;Slkl3-l :56°C。10. 根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（3)中的变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳使用8%的凝胶浓度。
【专利摘要】本发明公开了丝栗栲和米槠微卫星标记的特异性引物及检测方法。本发明通过利用公共数据库中现有的丝栗栲核苷酸序列，应用生物信息学方法并进行实验验证，开发出8对适用于米槠的丝栗栲微卫星分子标记的特异性引物，其碱基序列如SEQ？ID？NO.1-16所示。本发明还提供了丝栗栲和米槠的EST-SSR分子标记的检测方法，具有快速、简单、稳定和低成本的优点，为其它栲属植物EST-SSR分子标记的开发提供了参考，本发明的特异性引物及微卫星标记检测方法为丝栗栲和米槠等栲属植物的群体遗传分化与结构、群体的遗传多样性水平、群体间的基因流及交配系统等研究以及栲属植物的分子辅助育种研究提供了新的工具。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105087801
【申请号】CN201510527157
【发明人】肖复明, 伍艳芳, 徐海宁, 邱凤英, 江香梅, 王建, 汪信东
【申请人】江西省林业科学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月25日