确定空气中微生物种类及致病微生物污染状况的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中确定空气中微生物种类及致病微生物污染状况的方 法。
【背景技术】
[0002] 空气中悬浮的颗粒物粒径范围通常在IOnm至100ym之间。由于大气颗粒物 的形状并不规则，因此按照空气动力学直径的大小，大气颗粒物通常被分为TSP(Total suspendedparticulate，空气动力学直径<IOOym)，PMlO(粗颗粒物，空气动力学直径 彡10ym)，PM2.5(细颗粒物，空气动力学直径彡2.5ym)以及PM0. 1 (超细颗粒物，空气 动力学直径彡0.Iym)等。国际社会对PMlO与PM2. 5这两种粒径范围的颗粒物的广泛关 注，主要源于两个方面的原因：一、从悬浮颗粒物的粒径分布范围的角度来看，IOym左右 粒径范围的颗粒物处于粗颗粒物相对丰度分布的峰值，是粗颗粒物的重要组成；同时粒径 2. 5ym左右的颗粒物一般处于粗、细颗粒物两个模态之间的峰谷，是大气颗粒物中粒径较 小的一部分，并且也是由人类活动排放的污染物主要存在的粒径区间。二、以健康效应作为 考量因素，由于人体生理结构的原因，对PMlO与PM2. 5大小的颗粒物没有完全的过滤和阻 拦能力：一般空气动力学直径小于10ym的颗粒物可进入人的上呼吸道，小于2. 5ym的颗 粒物可进入支气管或支气管末端，在Iym以下的颗粒物可以达到肺泡，而小于0.Iym的时 候甚至可以穿透肺泡进入人体血液循环。因此PMlO亦被称为"可吸入颗粒物"，PM2. 5亦被 称为"入肺颗粒物"。PM2. 5由于其粒径小，更易进入人体，并且比表面积较大，易富集空气 中各种有毒重金属、酸性化合物、有机污染物以及细菌和病毒等微生物，对人体产生的潜在 健康危害更大，PM2. 5对人体健康的影响主要包括：对呼吸系统的损害、对心血管系统的影 响、对神经系统的影响、对免疫系统的影响，同时与癌症和出生缺陷也有一定的关系。
[0003] 作为在大气颗粒物形成过程中起到重要作用，并在可吸入颗粒物中占比可达 4% -80%的微生物成分，在以前的研究中鲜有涉及，这主要是源于生物组分的鉴定没有化 学组分的分析快速或技术成熟，这直接导致人们对于可吸入颗粒物中微生物物种的认知非 常有限。但显然的是，由于细菌的大小一般在0. 2ym-10ym之间，理论上来说大多应聚集 在可吸入颗粒物的粒径范围中，同时因为其具有生物活性并且部分具有潜在的传染致病 性，了解它们的组成分布对理解可吸入颗粒物对人类健康的影响是非常必要的。在美国，每 年的医院内感染有130万起，9. 9万人会因此而丧命。而在我国，目前的几项大规模的研究 报道指出，类似肿瘤医院院内感染约为2 % -3 %，而漏报约2 %。除此之外，其他特定环境例 如家居、医院、食品厂、药厂、大型公共生活、娱乐场也易发生感染。良好的环境空气微生物 检测手段例如特定环境空气中的微生物种类、环境污染状况的检测至关重要，然而，现阶段 此类研究仍有待加强。
[0004] 目前的空气微生物物种鉴定方法主要包括培养与DNA序列比对。通过培养的方法 鉴别颗粒物中的物种一般不受颗粒粒径的影响，但由于环境微生物大部分都不可在实验室 条件下培养，因此可鉴定物种的数量非常有限（包括有限的细菌和真菌）；并且由培养出的 单位菌落数推算空气中实际的微生物浓度并不准确。由DNA序列鉴定微生物种类的方法主 要是通过扩增细菌的16SrRNA序列（或真菌的18SrRNA序列），经微阵列芯片或测序获得 碱基组成信息并与数据库中已知种类的序列进行比对。但因为可吸入颗粒物的粒径与TSP 相比小了一个数量级，其中的生物组分或可提取的DNA量相对较少，所以目前绝大部分空 气微生物的研究仍基于TSP进行。
[0005] 但16SrRNA扩增技术使得细菌种类的鉴别只能局限在"属"或"属"以上水平，由 于细菌的致病能力在"种"或"株"之间相差都很大，因此对致病菌的理解不够充分；并且指 数扩增带来的误差使得菌群相对丰度的计算并不准确。同时，对样本的一次处理（比如只 做16SrRNA扩增）只能获得细菌的序列信息，如需了解真菌的组成还需再次进行18SrRNA 序列扩增，二次操作使得计算细菌和真菌的相对含量误差加大。另外，一般使用的扩增引物 为16S通用引物，但实际上通用引物是基于有限数量的已知序列设计的，并不一定对所有 的物种都"通用"，可能在某些物种序列的扩增上效率较低，同样带来扩增误差。考虑到空气 传播的微生物对人的健康影响，病毒也是不可忽略的病原体，但也会被16SrRNA扩增检测 所忽略。
[0006] 随着高通量测序技术的发展和计算能力的提高，宏基因组学（metagenomics)越 来越多的被应用于环境微生物种类鉴定中，包括土壤、海洋、口腔、肠道等复杂环境的微生 物组成均有涉及。宏基因组学的优势在于摒弃了对培养的依赖和对特定DNA片段的预扩 增，直接提取样本的基因组DNA，通过序列比对可以精确至"种"水平，并能够准确的反映出 环境中微生物生存的真实状态。但与已经开展宏基因组学研究的环境相比，大气颗粒物，尤 其是可吸入颗粒物的生物组成，或是DNA含量相对较少，使用传统方法难以获得足够的DNA 量进行测序建库，因此用宏基因组学方法研究大气悬浮颗粒物中的微生物一直是一个技术 难题。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是如何确定空气中的微生物种类及空气的污染状况。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了确定空气中微生物种类的方法。
[0009]本发明所提供的确定空气中微生物种类的方法，包括如下1)-3):
[0010] 1)用采样滤膜采集待测空气中微生物，得到位于所述采样滤膜上的待测空气中微 生物；
[0011] 2)提取所述位于所述采样滤膜上的待测空气中微生物的DNA，得到未纯化的微生 物DNA;用磁珠对所述未纯化的微生物DNA进行纯化，得到空气中微生物DNA;
[0012] 3)对所述空气中微生物DNA进行测序，根据所述空气中微生物DNA的序列确定所 述待测空气中微生物种类。
[0013] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述空气中微生物DNA不经扩增（体外扩 增）直接进行测序。所述方法不包括对所述空气中微生物DNA进行扩增的步骤。
[0014] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述磁珠具体可为贝克曼库尔特有限公司 (BeckmanCoulter,Inc.)产品，型号为AMPureXPcat.no.A6388I0
[0015] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述空气可为特定环境空气。所述特定环 境空气具体可为特定的待测环境空气。所述特定环境空气可以为地球表面的大气层的任一 处的空气，可以为有人类居住的环境的空气，也可以为没有人类居住的环境的空气。所述有 人类居住的环境的空气具体可为人类各种活动场所的室内或室外的空气，如人口密集的公 共场所、家居、医院病房或医院门诊处、食品厂、药厂、大型公共生活、娱乐场所的空气。在本 发明的一个实施例中，所述待测环境空气为医院室外和医院室内。
[0016] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述2)可包括如下21)和22):
[0017] 21)将所述位于所述采样滤膜上的待测空气中微生物用水或PBS从所述采样滤膜 上洗脱下来，得到含有待测空气中微生物的液体；用过滤用膜过滤所述含有待测空气中微 生物的液体，得到位于所述PES膜上的待测空气中微生物；
[0018] 22)提取位于所述PES膜上的待测空气中微生物DNA，得到所述未纯化的微生物 DNA;用所述磁珠对所述未纯化的微生物DNA进行纯化，得到空气中微生物DNA。
[0019] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述过滤用膜的孔径可为0. 01-0. 2微米。
[0020] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述过滤用膜可为PES膜。所述PES膜具体 可为颇尔生命科学（PallLifeSciences)产品，型号为0.2iimSupor200PESmembrane discfilter，cat.no. 66234。
[0021] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述提取位于所述PES膜上的待测空气中 微生物DNA还可包括将带有所述待测空气中微生物的所述PES膜上进行剪碎。
[0022] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述22)可为：用土壤DNA提取试剂盒提取 所述待测空气中微生物DNA，得到所述未纯化的微生物DNA;用所述磁珠对所述未纯化的微 生物DNA进行纯化，得到空气中微生物DNA。
[0023] 在用所述土壤DNA提取试剂盒提取所述待测空气中微生物DNA时，只需利用所述 土壤DNA提取试剂盒将所述待测空气中微生物的DNA从所述所述待测空气中微生物中释放 出来，不需要用所述土壤DNA提取试剂盒对释放出来的DNA进行纯化，此时得到所述未纯 化的微生物DNA。用所述磁珠对所述未纯化的微生物DNA进行纯化得到所述空气中微生物 DNA0
[0024] 在本发明的一个实施例中，所述土壤DNA提取试剂盒含有纯化DNA的柱子，在用所 述土壤DNA提取试剂盒将所述待测空气中微生物的DNA从所述所述待测空气中微生物中释 放出来后，用所述磁珠替换所述土壤DNA提取试剂盒中的柱子对所述未纯化的微生物DNA 进行纯化，得到所述空气中微生物DNA。
[0025] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述磁珠也可以替换为利用磁珠纯化DNA 的试剂盒，如Agencourt AMPure XP0
[0026] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述土壤DNA提取试剂盒为Mobio公司的 名称为P〇werS〇irDNAIsoIation Kit的试剂盒或Qiagen公司QTAamp?DNAStool Mini Kit〇
[0027] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述采样滤膜的孔径可为0. 01-0. 2微米， 如0. 2微米。
[0028] 所述用采样滤膜采集待测空气中微生物可为用装有所述采样滤膜的可拆卸过滤 器采集待测空气中微生物。所述可拆卸过滤器可装载在空气采样栗中。
[0029] 所述空气采样栗具体可为SKC空气采样栗。所述可拆卸过滤器具体可为Pall公 司的可拆卸过滤器。所述采样滤膜具体可为PTEE滤膜。
[0030] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述用采样滤膜采集待测空气中微生物时 通过所述采样滤膜的空气量可为4L/min。所述采集的时间可为23小时。所述用采样滤膜 采集待测空气中微生物可为不间断地采集所述待测空气中微生物。
[0031] 上述确定空气中微生物种类的方法中，3)所述测序可用高通量测序平台进行。所 述高通量测序平台具体可为Hiseq、Miseq、IonTorrent、Proton、S0LiD、454或单分子测序 装置。
[0032] 上述确定空气中微生物种类的方法中，在对所述空气中微生物DNA进行测序前， 还可包括对所述空气中微生物DNA进行全基因组扩增。
[0033] 上述确定空气中微生物种类的方法中，所述根据所述空气中微生物DNA的序列确 定所述待测空气中微生物种类可为将所述空气中微生物DNA的序列与参考数据库中的微 生物DNA进行比对确定所述待测空气中微生物种类。
[0034] 所述参考数据库可为常见的生物学数据库。所述参考数据库具体可为M5NR数据 库、Nr数据库、Silva数据库、Greengenes数据库、RDP数据库、CARD数据库以及NCBI中所 有医院内感染细菌的全基因组组成的常见院内感染细菌基因组数据库的至少一种。
[0035] 上述确定空气中微生物种类的方法中，在将所述空气中微生物DNA的序列与参考 数据库中的微生物DNA进行比对前还可包括，去除所述空气中微生物DNA的测序结果中的 低质量数据、接头污染和人类污染的序列。
[0036] 所述去除人类污染的序列可通过去除所述测序结果中比对到人类基因组参考序 列Hgl9中的序列而实现。所述比对可利