羊衣原体lamp检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种羊衣原体LAMP检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]羊衣原体病是由婴4鹉热衣原体(C./wiiiaci)和反当动物衣原体(C.p ecorum)引起的一种传染病。鹦鹉热衣原体临床上以发热、流产和产弱羔为特征，反刍动物衣原体引起羊多发性关节炎、结膜炎和肠炎，是危害羊的主要疾病之一。该病同样会给养羊业造成重大的经济损失。羊衣原体病在我国一些养羊基地、养羊专业户及农户的羊群中存在，严重危害羊只的健康。现在市场缺少一种能对临床样品的羊衣原体进行简便、快捷、灵敏、易推广的LAMP检测试剂盒。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种羊衣原体LAMP检测试剂盒，它可以快速检测羊衣原体MOMP基因，并且简便、灵敏、准确、特异性强。
[0004]本发明是这样实现的:羊衣原体LAMP检测试剂盒，它包括浓度为0.5 Mmol/L的引物F3 I μ?、浓度为0.5 Mmol/L的引物Β3 I μ?，浓度为I Mmol/L的引物FIP 2 μ?、浓度为I Mmol/L的引物BIP 2 μ?, Bst DNA聚合酶I μ?，LAMP反应缓冲液13μ?，模板1.5μ?,荧光显色液1KL，用ddH20补足至2.5 μ?,石蜡油1.5_2μ?，2 μ L阴性对照以及2 μ L阳性对照；所述的引物F3的序列为:5’ - acaagcctagaggatacaag-3 ;所述的引物B3的序列为:5，_gttgagcgatgcggatagtg_3 ;所述的引物 FIP 的序列为:5，_agtatccgtagcagcctctgtgaacgtccgccaactttcc _3 ;所述的引物 BIP 的序列为 5，- gtctagcactctcttacagatgtgaccagtttacgccaatg -3’。
[0005]阴性对照为衣原体非特异性DNA片段。
[0006]阳性对照为标准衣原体MOMP基因LAMP产物。
[0007]所述的LAMP 缓冲液中，dNTP 为 0.2 mmol、 Mg2+ 为 I mmolNaCl 为 10 mmol、Tris-HCl 为 5mmol，其 PH 值为 pH8.3。
[0008]为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验:
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
衣原体、大肠埃希氏杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、葡萄菌、魏氏梭菌均由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室和贵州省畜禽重大疫病防制重点实验室分离保存。标准衣原体疫苗株由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。
[0009]主要试剂
TIANamp血液和粪便基因组DNA提取试剂盒、环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒购自购自天根生化科技有限公司；Goldview、Tris、EDTA、MarkerDL2000、ProteinaseK、RNaseA、Taq DNA Polymerase (lU/KL)、Bst DNA 聚合酶及相应 10 X Taq Buffer、dNTP (mix)等购自宝生物(大连)工程有限公司。乙酸钠、冰乙酸、乙醇等常用试剂均为国产分析纯。
[0010]采取的主要研究方法
2.1 DNA的提取
方法一:DNA提取参照TIANamp衣原体基因组DNA提取试剂盒说明书进行。挑取少许菌落于1.5ml离心管中加入TE缓冲液稀释至微浊，取Iml装入离心管中9000r/min离心10秒，弃上清，在细菌沉淀管中加入20ulDB液，160ulIysozyme和20ulRNaseA，彻底振荡悬浮，3 7 °C温浴45分钟，期间来回颠倒离心管数次。加入400ulDL和25ul蛋白消化酶K(ProteinaseK)迅速温和地来回颠倒离心管彻底混匀。置65°C温浴45分钟，离心I分钟，取上清液。加入200ul异丙醇，剧烈颠倒离心管使溶液混合后，移取600ul至吸附柱中，离心30秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。将剩余的全部移至吸附柱中，离心30秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。加入500ulWl液，静置一分钟后，离心30秒。将吸附柱放入另外一个收集管中。加入500ulWl液，离心15秒。弃掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。离心I分钟。将吸附柱移入一个干净的1.5ml离心管中。在吸附膜中央加入100 UlTl液，65°C静置5分钟后，离心I分钟。将上清液移入1.5ml离心管(DNA) 4°C保存备用。
[0011]方法二:临床取样0.1g病羊病料加入0.5mL0.lmol/L PBS, _20°C反复冻融3次，研磨制成悬液，然后转移至1.5 mL离心管中。12000 r/ min离心5 min，取上清液用于衣原体DNA的提取。加入80 uLDNA提取液，混匀，沸水浴10分钟，离心2分钟，将上清提取的DNA于-20 °C保存。
[0012]引物设计
根据 GenBank 中的衣原体 MOMP 基因序列(GenBank: L25436.1; G1: 457203)，根据 LAMP引物设计的原则，在这些序列的保守区域设计4条特异性引物，包括外引物和内引物(F3、B3、FIP、BIP)ο External primer F3:5’_ acaagcctag aggatacaag-3;- External primerB3:5’ gttgagcgatgcggatagtg-3 ；FIP:5’ -agtatccgtagcagcctctg gaacgtccg ccaactttcc-3，；BIP:5’ - gtc tagcactctc ttacaga gtgacca gtttacgccaatg -3’。弓I物由大连宝生生物有限公司合成。
[0013]反应条件的优化
LAMP反应在25 PL反应体系中进行，引物F3、B3分别为1.0 μΚ0.5、1、2 Mmol/L)、引物 FIP、BIP 分别为 2PL (1、2、4 Mmol/L)，DNA 聚合酶(0.5、1、2 U)，LAMP 反应缓冲液 13.0KL，模板1.5PL，加入环介导等温扩增法荧光检测试剂盒中荧光显色液I μ?，用ddH20补足至25 μ?ο反应条件分别为:反应温度(59、62、65°0，反应时间(30、45、60 min)，94°C灭活
2min。同时以ddH20作为空白对照。通过对反应条件进行优化，以确定最佳反应条件，扩增产物用肉眼在日光下直接观察，或在紫外光下进行观察。
[0014]特异性试验
以衣原体、大肠埃希氏杆菌、铜绿假单胞菌、葡萄菌、魏氏梭菌DNA为模板分别进行LAMP反应，用ddH20作为空白对照，以确定建立的LAMP反应的特异性。
[0015]敏感性试验
先采用紫外分光光度计测定DNA含量，I个0D260值相当于50 μ g/mLDNA。取4.3X103pg/L的衣原体核酸，经10倍系列稀释应用MOMP基因F3、B3引物进行用于LAMP反应和PCR扩增，以确定建立的LAMP反应的敏感性。
[0016]重复性试验
应用建立LAMP方法，重复检测衣原体DNA 3次以检验结果的可靠性。
[0017]对临床样品的检测
对2013年至2015年贵州省内养羊场和养羊专业户采集的100份可疑病料应用建立的LAMP诊断方法进行检测。
[0018]研究的结果与分析
3.1LAMP检测方法的建立
LAMP检测方法反应在25 μ?反应体系中最佳反应条件为，反应温度62°C，反应45min，94°C灭活 2 min。引物 F3、B3 (0.5 Mmol/L)各 ?μ?，引物 FIP、BIP (I Mmol/L)各 2μ