基于fshr基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物分子育种领域，尤其涉及一种基于FSHR基因的猪繁殖性状相关 的分子标记及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 分子标记辅助选择是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，利用与育种性 状相关的各种标记代替以表型为基础的选择，从分子水平上分析个体的遗传组成，从而实 现对基因型的直接选择，可克服直接选择的弊端，提高选择的准确性和缩短世代间隔。
[0003] 总产仔数、产活仔数等猪的繁殖性状是重要的经济性状，直接关系到养猪业的经 济效益。
[0004] 促卵泡素（FSH)是由垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白激素，在卵巢卵泡的 生长、发育、分化、成熟和排卵过程中起重要作用。由于FSH是一种生物大分子，不能透过细 胞膜，只有通过位于靶细胞膜上促卵泡素受体（FSHR)的介导，将信息传递到靶细胞膜内， 从而发挥其生物学功能。FSHR基因的多态性研究报道主要集中在人、牛、绵羊、山羊上，目前 未见FSHR基因与猪繁殖性状之间关系的研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种基于FSHR基因的猪繁殖 性状相关的分子标记。本发明还提供了该分子标记的检测方法和应用。
[0006] 为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的：
[0007] 本发明所述的基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记，它为猪FSHR基因片 段，所述的猪FSHR基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点为如SEQ ID NO. 1所示序 列中第1166位，所述的多态性位点具有C/T碱基的变异。
[0008] 序列表中SEQ ID NO. 1所示的序列为猪FSHR mRNA序列，其第1166位为多态性位 点，与猪总产仔数、产活仔数紧密相关，可利用该位点开发与猪繁殖性状相关的分子标记。
[0009] 本发明所述的猪FSHR基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示；或所述的猪 FSHR基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。当然，本发明所述的猪FSHR基因片段也 可以为包含如SEQIDNO. 2所示核苷酸序列的DNA片段。根据检测方法，可以选择合适长 度的能够包含多态性位点的DNA片段。
[0010] 本发明还提供了所述的分子标记的检测方法，包括：
[0011] (1)根据所述的分子标记的核苷酸序列设计引物；
[0012] (2)以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
[0013] (3)判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。
[0014] 步骤（3)中，可对PCR产物进行测序或电泳分析，判断多态性位点的碱基类型。
[0015] 优选的，步骤（1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 10所示，下游引物的核 苷酸序列如SEQIDNO. 11所示。利用该引物，可采用PCR-SSCP的方法准确方便的检测多 态性位点的类型。
[0016] 作为另一种可选择的，步骤（1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0017] 本发明还提供了所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。
[0018] 具体的，猪可以为小梅山猪、楓泾猪或大白猪。繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0020] 本发明研究发现，猪FSHR基因第10外显子存在一个突变位点（即多态性位点）， 该位点位于如SEQIDNO. 1所示序列的第1166位，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产 仔数或产活仔数相关，且容易检测，从而本发明根据该突变位点提供了一种基于FSHR基因 的猪繁殖性状相关的分子标记，并提供了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的 应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。
【附图说明】
[0021] 图1为实施例1猪FSHR基因第10外显子SNPs筛选结果；
[0022] 图2为实施例1猪FSHR基因第10外显子SNPs上氨基酸序列比对结果；
[0023] 图3为实施例1猪FSHR基因第10外显子Cl 166T的PCR-SSCP检测部分样本的电 泳结果；
[0024] 图4为实施例1基因型分型检测中AA基因型个体的测序结果；
[0025] 图5为实施例1基因型分型检测中BB基因型个体的测序结果。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价 形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0027] 实施例1
[0028] 2013年采集106头小梅山猪、42头楓泾猪和70头大白猪的耳样；同时整理了江苏 农林职业技术学院小梅山猪育种中心2004年~2012年期间上述106头小梅山母猪的生产 档案，共有698窝仔猪记录，主要收集产仔年份、胎次、TNB、NBA等指标。耳样（约0. 15g) 用耳号钳采集，_20°C冻存。用常规的酚氯仿抽提法提取猪耳样的基因组DNA，对基因组DNA 进行OD值测定，计算其浓度，并用CldH2O稀释至终浓度为IOOng/ yL，原液-20°C保存，稀释 液4°C保存。
[0029]第一步：获取猪FSHR基因外显子序列。
[0030] 根据GenBank公布的人FSHR基因全序列（登录号：NG_008146)和猪FSHRmRNA序 列（登录号：NM_214386,核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示），比对两者的蛋白质序列，确定 猪FSHR基因的所有外显子区域。猪FSHR基因共10个外显子，除外显子1、9、10外，其余外 显子大小均低于l〇〇bp，不能有效扩增，并会影响测序结果的判读。
[0031] 第二步：应用生物软件设计引物，引物扩增覆盖外显子区域。
[0032] 采用Primer5. 0软件设计3对引物，扩增猪FSHR基因第10外显子区域。3对引物 分别为：FSHR-10. 1、FSHR-10. 2和FSHR-10. 3。引物基本信息见表1。
[0033] 表1猪FSHR基因引物序列
[0034]
[0035] 注：F代表上游引物，R代表下游引物。
[0036] 第三步：PCR扩增和产物测序。
[0037] 将每个个体基因组DNA样本吸取5 y L进行混合，形成DNA池，混合后分别采用上 述3对引物进行PCR扩增，扩增产物直接送上海生工生物公司进行测序。FSHR-10. 1扩增靶 向序列如SEQ ID NO. 3所示）。
[0038] PCR扩增反应体系为 20yL，包括：10XBuffer2. 0yL、25mMMg2+2. 2yUlOmM dNTPs0? 8yL、10yM上、下游引物各IyL、DNA模板IyL(IOOng)、5U?yL1Taq酶 0? 2yL、 ddH20 11.8yL〇
[0039]PCR扩增反应程序：94°C预变性5min;31个循环（94°C变性lmin，60°C~63°C退 火30s，72°C延伸Imin);最后72°C延伸10min，4°C保存产物。退火温度根据表1中的引物 进行选择。
[0040] 对不同基因型个体的PCR扩增产物进行测序分析。
[0041] 第四步：序列比对，寻