找突变位点。
[0042] 测序结果与GenBank公布的序列进行比对，寻找突变位点。猪FSHR基因第10外 显子中检测到3个5陬，分别为(：11661\1'1491(：、1'1977(：(图1)。
[0043] 第五步：对突变位点进行氨基酸比对分析和酶切位点分析。
[0044] 利用DNAMAN软件将SNPs所在的外显子核苷酸翻译为氨基酸序列，对突变前后的 氨基酸序列进行比对，结果表明C1166T导致苏氨酸（Thr)变为异亮氨酸（lie)，即T377I， 其余突变均未能引起氨基酸的改变，属于同义突变（图2);酶切位点分析结果表明，C1166T 未能产生新的酶切位点或丧失某个酶切位点。
[0045] 第六步：突变位点的分型检测。
[0046] 利用PCR-SSCP技术对小梅山猪、楓泾猪和大白猪三个猪群体的FSHR基因突变位 点C1166T进行分型检测。采用的引物为FSHR-10. 4,引物信息见表1。引物FSHR-10. 4所 针对的靶向序列如SEQIDNO. 2所示。
[0047]PCR-SSCP检测中，
[0048] PCR扩增反应体系为20 y L，包括：10XBuffer 2. 0 y L、25mM Mg2+2. 2 y UlOmM dNTPs 0? 8 y L、10 y M上、下游引物各I y L、DNA模板I y L (IOOng)、5U?y L 1Taq酶0? 2 y L、 ddH20 11.8 y L〇
[0049]PCR扩增反应程序：94°C预变性5min;31个循环（94°C变性lmin，60°C退火30s， 72°C延伸lmin);最后72°C延伸10min，4°C保存产物。
[0050] SSCP检测程序为：2.5yL PCR产物和7.5yL上样缓冲液混匀，98°C变性lOmin， 然后冰浴lOmin。变性后的PCR产物用10%的聚丙烯酰胺凝胶120V电泳12h，银染，拍照保 存。选取不同的基因型交由上海生物工程有限公司进行测序。
[0051]结果表明，Cl166T上检测到3种基因型，分别为AA、AB、BB，泳道1、2、5、6、9的基因 型为AA，泳道3、4、7的基因型为AB，泳道8、10~14的基因型为BB(图3)，测序结果表明， 基因型AA个体在1166bp的碱基为C(野生型），基因型BB个体为T(突变型）（图4,图5)。
[0052] 第七步：分析该位点C1166T在不同猪群中的分布情况。
[0053] 在PCR-SSCP方法进行分型检测后，利用Excel软件计算3个猪群体C1166T位点 基因型频率、等位基因频率、x2和P值。
[0054] 如表2,C1166T位点上，3个猪群中共检测到3种基因型与2个等位基因；小梅山 猪和楓泾猪2个群体中，等位基因A为优势基因，基因频率分别为0.759、0.690,大白猪群体 中，未能检测到AA型个体，等位基因B的频率达到0. 964 ;经X2检验，3个猪群在C1166T 位点上均处于哈代-温伯格平衡状态（P值分别为0. 997、0. 780、0. 953)。
[0055] 表2 3个猪群FSHR基因C1166T位点的基因型频率与等位基因型频率
[0056]
[0057] 注：括号内数字为猪群头数。
[0058] 第八步：关联分析该突变位点与繁殖性状间的关系。
[0059] 应用SPSS(VersionK). 0)软件的GLM程序分析突变位点不同基因型与猪总产仔数 和产活仔数等繁殖性状间的关系。
[0060] C1166T位点上（表3)，1~2胎小梅山母猪中，AA型个体的TNB、NBA均高于BB型 个体，但差异不显著（P>〇. 05) ;2胎以上小梅山母猪中，AA型个体的TNB、NBA最高，分别为 12. 88头、12. 13头，与AB、BB型个体比较，差异达到极显著水平（P〈0. 01)，但AB、BB型个体 间差异不显著（P>〇. 05);所有胎次的小梅山母猪中，AA型个体的TNB比AB、BB型个体分别 高 0? 91 头（P〈0. 01)、L56 头（P〈0. 01)，AA型个体的NBA分别高 0? 83 头（P〈0. 01)、L30 头 (P〈0. 01) ;3个阶段中，3种基因型个体的TNB与NBA均表现出相同的趋势：AA>AB>BB。
[0061] 表3FSHR基因Cl166T位点与小梅山猪繁殖性状的关联分析
[0062]
[0063] 注：N为窝数；TNB为总产仔数；NBA为产活仔数。
[0064] 因此，在猪FSHR基因第10外显子错义突变C1166T位点上，等位基因A是在小梅 山猪和楓泾猪中优势基因，基因型AA是有利基因型，能显著或极显著提高猪的总产仔数或 产活仔数；同时该位点在上个群体中均处于基因平衡状态，表明该位点之前未受到自然选 择压或常规选种选育压力的影响，今后该位点提升的空间较大，可以作为影响猪繁殖性状 的一个重要标记。
【主权项】
1. 一种基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记，其特征在于，它为猪FSHR基因片 段，所述的猪FSHR基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点为如SEQ ID NO. 1所示序 列中第1166位，所述的多态性位点具有C/T碱基的变异。2. 如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的猪FSHR基因片段包含如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。3. 如权利要求2所述的分子标记，其特征在于，所述的猪FSHR基因片段的核苷酸序列 如SEQ ID NO. 2所示；或所述的猪FSHR基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。4. 一种如权利要求1~3任一项所述的基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记 的检测方法，其特征在于，包括： (1) 根据权利要求1~3任一项所述的分子标记的核苷酸序列设计引物； (2) 以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增； (3) 判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。5. 如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（1)中，上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示。6. -种如权利要求1~3任一项所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，猪为小梅山猪、楓泾猪或大白猪。8. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
【专利摘要】本发明公开了一种基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用。所述的分子标记为猪FSHR基因片段，所述的猪FSHR基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点为如SEQ？ID？NO.1所示序列中第1166位，所述的多态性位点具有C/T碱基的变异。所述的检测方法，包括：根据所述的分子标记的核苷酸序列设计引物；以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。本发明还公开了所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。本发明根据FSHR基因突变位点提供了基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105087820
【申请号】CN201510621805
【发明人】吴井生, 陈超, 郭苹, 陈永霞
【申请人】江苏农林职业技术学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月25日