衣原体传染病预防治疗剂的制作方法

本发明涉及以干酪乳杆菌作为有效成分的衣原体传染病预防治疗剂。

背景技术：

衣原体传染病是由于衣原体属的微生物感染咽喉、生殖器而引起的疾病。特别是，在女性感染的情况下，伴随着宫颈炎、骨盆内炎症性疾病等重症的情况下，成为由输卵管障碍导致的不孕的原因。

另外，衣原体传染病有时几乎没有自觉症状，有时也会在没察觉到衣原体传染病的状态下怀孕。该情况下，流产、早产的风险高而成为大的社会问题。另外，推测该衣原体传染病会以年轻人为中心而感染人数增大，然而，几乎没有自觉症状的情况下，没有治疗的患者多且没有察觉到感染的情况下进行性行为，从而扩大了感染而成为大的社会问题。

到目前为止，对于衣原体传染病的预防、治疗方法进行了各种研究，例如，报告了针对衣原体属微生物的抗菌药(专利文献1)。

但是，衣原体属的微生物为细胞内寄生菌，因此存在容易持续感染而抗菌药难以起作用的问题。另外，为了完全消灭衣原体属的微生物，优选长期给药，但通常地抗菌药会产生副作用而不适合长期给药的情况也多。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平9-216824号公报

技术实现要素：

发明要解决的问题

因此，本发明的课题在于提供安全性高、能够长期给药的衣原体传染病预防治疗剂以及起因于衣原体传染病的不孕症的改善剂。

用于解决问题的方案

本发明人等，为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现，通过给予干酪乳杆菌，能够实现衣原体传染病的预防和/或治疗。另外，本发明人等发现，通过给予干酪乳杆菌，也能够改善起因于衣原体传染病的不孕症，至此完成本发明。

即，本发明为以干酪乳杆菌作为有效成分的衣原体传染病预防治疗剂。

另外，本发明为起因于衣原体传染病的不孕症的改善剂，其以干酪乳杆菌作为有效成分。

进而，本发明为用于衣原体传染病预防治疗剂的制造的、干酪乳杆菌的使用；用于衣原体传染病的预防和/或治疗的干酪乳杆菌；或者特征在于给予干酪乳杆菌的衣原体传染病的预防和/或治疗方法。

另外，进一步，本发明为用于起因于衣原体传染病的不孕症的改善剂制造的、干酪乳杆菌的使用；用于改善起因于衣原体传染病的不孕症的干酪乳杆菌；或者特征在于给予干酪乳杆菌的起因于衣原体传染病的不孕症的改善方法。

发明的效果

本发明的衣原体传染病预防治疗剂是以干酪乳杆菌作为有效成分的、能够通过经口给药或对感染部位直接给药来进行衣原体传染病的预防和/或治疗的优异的物质。

另外，本发明的起因于衣原体的不孕症的改善剂以干酪乳杆菌作为有效成分、通过经口给药或对感染部位的直接给药来改善起因于衣原体的不孕症。本发明中不孕症包括：尽管希望妊娠且进行了一定期间的性生活但未妊娠的状态；以及、即便妊娠也会因为流产、早产而导致胎儿至生育为止保不住的状态两者。因此，本发明的不孕症改善剂能够使雌性个体的生育率提高。需要说明的是，本发明中生育率是指多个与雄性个体交配的雌性个体中正常生育的雌性个体的比例。

附图说明

图1是表示实施例1中测定的阴道内的衣原体的菌数的图。

图2是表示实施例2中算出的小鼠的生育率的图。

具体实施方式

本发明的衣原体传染病预防治疗剂以及不孕症的改善剂(以下，也称为“本发明预防治疗剂”)的有效成分的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)只要是该分类的菌株则没有特别限定，可以使用市售的菌株、保藏于ATCC等保藏机构的菌株、新发现的菌株、或者它们的变异株等。作为这样的干酪乳杆菌，可列举出例如：干酪乳杆菌YIT9018、干酪乳杆菌YIT9029等。这些干酪乳杆菌中，优选干酪乳杆菌YIT9029。需要说明的是，上述干酪乳杆菌没有过氧化氢的产生能力、安全性高。

上述干酪乳杆菌中，干酪乳杆菌YIT9029是本申请人于1987年5月18日、在通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(需要说明的是，前述微生物工业技术研究所现在成为独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心，转移至新地址〒292-0818千叶县木更津市上总镰足2丁目5番地8120号室。)以FERM BP-1366进行了保藏。

另外，对于干酪乳杆菌YIT9018，本申请人已经于1984年11月14日在通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(需要说明的是，前述微生物工业技术研究所现在成为独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心，转移至新地址〒292-0818千叶县木更津市上总镰足2丁目5番地8 120号室。)以FERM BP-665进行了保藏。

对于本发明预防治疗剂中的上述干酪乳杆菌的形态没有特别的限定，可以例示出菌体或菌体破碎物等。另外，为菌体的情况下，可以为活菌、死菌的任一者。本发明预防治疗剂中的干酪乳杆菌的含量，没有特别的限定，只要是与后述的剂型相匹配的量即可，例如，以活菌计，可列举出1×10⁷～1×10¹³CFU。另外，为死菌的情况下，可以为将活菌数1×10⁷～1×10¹³CFU的物质用加热等死菌化即可。另外，对于其给药时间，没有特别的限定，可以在感染前以预防为目的进行给药；也可以在感染后以治疗为目的进行给药，但在感染衣原体后妊娠的情况下，流产/早产的风险变高，因此优选在妊娠前并且在感染前以预防为目的给予本发明的预防治疗剂。对于其给药时间没有特别的限定，但以预防为目的的情况下，优选在早于感染7天前持续地进行给药。另外，以治疗为目的的情况下，优选在感染后持续给药3天以上。对于给药时间的上限，没有特别的限定，可例示出1～2周的持续给药；对于每1天的给药次数，也没有特别的限定，可例示出1天1次～1天3次。另外，以不孕症的改善剂形式给药的情况下，也可以以上述的预防治疗为目的的情况同样地进行给药。

本发明预防治疗剂含有上述干酪乳杆菌作为有效成分即可，所以可以仅由干酪乳杆菌构成，也可以以与药学允许的载体相组合而构成。

作为药学上允许的载体，可列举出例如：葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖、环糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理盐水等。另外，也可以根据需要，适宜添加稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘结剂、等渗剂、赋型剂等常用的添加剂。

本发明预防治疗剂的剂型没有特别的限定，例如：液剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、栓剂、外用剂等。另外，这些剂型的本发明预防治疗剂可以根据使用了乳酸菌的公知制剂的调制法进行调制。

这样得到的本发明预防治疗剂可以用于由沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鼠嗜衣原体(Chlamydia muridarum)等衣原体属的微生物引起的衣原体传染病的预防和/或治疗。

进而，本发明的不孕症的改善剂改善起因于衣原体传染病的不孕症而提高生育率。

需要说明的是，本发明预防治疗剂无论是经口给药还是经阴道给药等非经口给药都有效果，对于给药方法没有特别的限定，由于给药容易且适合于长期给药，因此优选经口给药。

另外，通过使食品含有规定量干酪乳杆菌，能够制造表现出衣原体传染病预防治疗作用的食品。即，作为对最终产品附加衣原体传染病预防治疗作用而使用的食品添加物(原料)而使用干酪乳杆菌的、含有干酪乳杆菌的用于衣原体传染病的预防和/或治疗的食品添加用组合物。对于本发明的食品添加用组合物中的上述干酪乳杆菌的形态，没有特别的限定，可例示出菌体或菌体破碎物等。另外，为菌体的情况下，可以为活菌、死菌的任一者。对于本发明的添加了食品添加用组合物的最终产品中的干酪乳杆菌的含量，没有特别的限定，可列举出例如以活菌计为1×10⁷～1×10¹³CFU。另外，为死菌的情况下，可以为将活菌数1×10⁷～1×10¹³CFU的物质用加热等死菌化即可。

实施例

以下，基于实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不仅限定于这些实施例。

制造例1

干酪乳杆菌菌液的制作：

在10ml的MRS培养基中在37℃下培养干酪乳杆菌YIT9029(以下，称为“LcS”)24小时，然后在4℃、5000g、5分钟的条件下用蔗糖-磷酸盐谷氨酸缓冲液(sucrose-phosphate gultamate buffer)(以下，称为“SPG缓冲液”：蔗糖75g/L、L-谷氨酸0.72g/L、磷酸氢二钠12H₂O 6.148g/L、磷酸二氢钾0.247g/L、蒸馏水、pH7.0)离心2次进行洗涤。去除上清，用1ml和10ml的SPG缓冲液进行再悬浮，制作LcS菌液。将1ml的SPG缓冲液中再悬浮而成的物质用于经阴道给药(LcS活菌数：1×10¹⁰CFU/ml)；将10ml的SPG缓冲液中再悬浮而成的物质设为经口给药用(LcS活菌数：1×10⁹CFU/ml)。另外，将经阴道给药用和经口给药用的LcS菌液在100℃加热30分钟而制成加热死菌液。

参考制造例1

约氏乳杆菌的菌液的制作

将LcS替换为约氏乳杆菌YIT0219^T(Lactobacillus johnsonii标准株：以下，称为“Lj”)，除此以外，与制造例1同样地制作Lj菌液。

实施例1

通过给予LcS的衣原体传染病的预防·治疗：

(1)感染菌的调制

将用添加了10％胎牛血清的DMEM培养基培养的McCoy细胞(4×10⁵细胞/ml)的悬浮液分别注入24孔板中各1ml，在CO₂培养箱内、37℃下培养24小时。使每1ml培养细胞感染1×10⁵细胞的鼠嗜衣原体(C.muridarum)ATCC VR123^T(以下，称为“MoPn”)之后，进行离心分离而去除上清之后，以成为1μg/ml的方式添加加入了环己酰亚胺(cycloheximide)的DMEM培养基，在CO₂培养箱内、37℃下进行72小时培养。将剥离MoPn感染细胞进行离心分离而得到的沉淀悬浮于SPG缓冲液。对于MoPn感染细胞进行超声波处理(28kHz、5秒、10次)、离心分离，分取上清。将上清中的MoPn在4℃、15000g、1小时的条件下用SPG缓冲液离心2次进行洗涤之后，用SPG缓冲液悬浮而制成感染液(1×10⁸细胞/ml)。

(2)对小鼠感染MoPn

为了调节雌性小鼠的性周期，对于每1只小鼠皮下注射2.5mg的黄体酮(黄体酮注射液：ASKA Pharmaceutical Co.,Ltd.)。对该调节了性周期的小鼠按照常规方法用Somnopentyl进行了麻醉。对该麻醉下的每1只小鼠向阴道内注入10μl(MoPn菌数：1×10⁶细胞)的感染液，使小鼠感染MoPn。

(3)菌液的给予(各组6只)

[LcS活菌经阴道给药组]

在戊巴比妥(Somnopentyl)麻醉下，对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次向阴道内给予制造例1中制造的经阴道给药用的LcS菌液10μl(1×10⁸CFU)。

[LcS死菌经阴道给药组]

在戊巴比妥麻醉下，对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次向阴道内给予制造例1中制造的经阴道给药用的LcS加热死菌液10μl。LcS加热死菌液10μl在加热前的LcS活菌数为1×10⁸CFU。

[Lj活菌经阴道给药组]

在戊巴比妥麻醉下，对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次对阴道内给予参考制造例1中制造的经阴道给药用的Lj菌液10μl(1×10⁸CFU)。

[对照经阴道给药组]

在戊巴比妥麻醉下，对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经阴道给予10μl的SPG缓冲液。

[LcS活菌经口给药组]

对用手指固定的小鼠，使用灌胃器对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经口给予制造例1中制造的经口给药用的LcS菌液100μl(1×10⁸CFU)。

[LcS死菌经口给药组]

对用手指固定的小鼠，使用灌胃器对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经口给予制造例1中制造的经口给药用的LcS加热死菌液100μl。LcS加热死菌液100μl在加热前的LcS活菌数为1×10⁸CFU。

[Lj活菌经口给药组]

对用手指固定的小鼠，使用灌胃器对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经口给予参考制造例1中制造的经口给药用的Lj菌液100μl(1×10⁸CFU)。

[对照经口给药组]

对用手指固定的小鼠，使用灌胃器对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经口给予SPG缓冲液100μl。

(4)MoPn的菌数的测定

在感染MoPn后第3天，按照常规方法，从在戊巴比妥麻醉下出血死的小鼠无菌地采集阴道组织，使之悬浮在SPG缓冲液中，之后在-80℃下进行冷冻保存。将其在室温下溶解，均质化之后，将其破碎液200μl用400μl的加入了RNA保护液(RNAprotect)的离心管(定量的RT-PCR用：Qiagen)分取，进行RNA抽提。之后，使用Qiagen Onestep RT-PCR kit以及沙眼衣原体和鼠嗜衣原体特异性引物、通过定量的RT-PCR法进行测定。更详细地，在50℃、30分钟；95℃、15分钟下进行逆转录反应，将94℃、20秒；55℃、20秒；72℃、50秒作为1个循环，进行45个循环。另外，沙眼衣原体和鼠嗜衣原体特异性引物的碱基序列为：正向引物：TGCATAGATAATTTGTCCTTAACTTG(序列号1)；反向引物：CGAGATTTGACAACTAACTTACCT(序列号2)。

(5)统计学分析

计算出各组的MoPn菌数的平均值和标准偏差，用非参数曼-惠特尼U检验(non-parametric Mann-Whitney′s U test)检验给药组相对于对照组的统计学的显著性；用多重比较法(Bonferroni)检验各组的统计学差异。需要说明的是，作为统计学软件，使用SPSS Ver.11(SPSS株式会社)，在所有的检验中，显著水平在双侧检验中为5％。

(6)结果

将测定了阴道内的MoPn菌数的结果示于图1。

LcS活菌经阴道给药组中，与对照经阴道给药组比较，阴道内的MoPn菌数为显著的低值(P＜0.01)。在LcS死菌经阴道给药组中，确认到了与LcS活菌经阴道给药组相同程度的显著的感染防御作用(P＜0.01)。另一方面，Lj活菌经阴道给药组中，没有确认到对于MoPn阴道内感染的感染防御作用。图1中的**表示P＜0.01。

在LcS活菌经口给药组中，与对照经口给药组比较，阴道内的MoPn菌数为显著的低值(P＜0.05)；确认到了对于MoPn阴道内感染的感染防御作用。进一步，对于LcS死菌经口给药组，也确认到了与LcS活菌经口给药组相同程度的显著的感染防御作用(P＜0.05)。另一方面，Lj活菌经口给药组中，没有确认到对于MoPn阴道内感染的感染防御作用。图1中的*表示P＜0.05。

实施例2

通过LcS的给予带来的小鼠生育率的改善：

(1)对小鼠感染MoPn

为了调节雌性小鼠的性周期，对于每1只小鼠皮下注射2.5mg的黄体酮(黄体酮注射液：ASKA Pharmaceutical Co.,Ltd.)。对该调节了性周期的小鼠按照常规方法用戊巴比妥进行了麻醉。对该麻醉下的每1只小鼠，向阴道内注入10μl(MoPn菌数：1×10⁶细胞)的实施例1中调制的感染液，使小鼠感染MoPn。

(2)菌液的给予(各组20只)

[LcS活菌经阴道给药组]

在戊巴比妥麻醉下，对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次向阴道内给予制造例1中制造的经阴道给药用的LcS菌液10μl(1×10⁸CFU)。

[对照经阴道给药组]

在戊巴比妥麻醉下，对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经阴道给予10μl的SPG缓冲液。

[LcS活菌经口给药组]

对用手指固定的小鼠，使用灌胃器对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经口给予制造例1中制造的经口给药用的LcS菌液100μl(1×10⁸CFU)。

[对照经口给药组]

对用手指固定的小鼠，使用灌胃器对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经口给予100μl的SPG缓冲液。

(3)小鼠的交配

将MoPn感染第3天的小鼠雄性1：雌性1，在同一笼子内饲养5天，使雌性小鼠与非感染的雄性小鼠交配。从交配第二天起至交配结束为止，每天早晚实施作为妊娠指标的栓状物(附着于雌性的阴道口的白色蜡状物质)的确认。将确认到栓状物的个体分离雌雄，在每1笼子饲养1只的条件下，观察至感染第32天为止雌性小鼠有无生育。

(4)统计学分析

生育率利用Fisher精确检验(Fisher′s exact test)来测定。需要说明的是，作为统计学软件使用SPSS Ver.11(SPSS株式会社)，显著水平在双侧检验中为5％。

(5)结果

由小鼠是否生育算出的生育率示于图2。感染对照组的生育率为20％(20只中4只)。另一方面，LcS经阴道给药组的生育率为75％(20例中15例)，确认到了对于MoPn感染小鼠的不孕症的显著的改善作用(P＝0.0012)。另外，对于LcS经口给药组，确认到了对于MoPn感染小鼠的不孕症的显著的改善作用(生育率55％[20例中11例]、P＝0.0483)。

实施例3

伴随着LcS给药的衣原体菌数的推移：

(1)对小鼠感染MoPn

为了调节雌性小鼠的性周期，对于每1只小鼠皮下注射2.5mg的黄体酮(黄体酮注射液：ASKA Pharmaceutical Co.,Ltd.)。对该调节了性周期的小鼠按照常规方法用戊巴比妥进行了麻醉。对该麻醉下的每1只小鼠，向阴道内注入10μl(MoPn菌数：1×10⁶细胞)的实施例1中调制的感染液，使小鼠感染MoPn。

(2)菌液的给予(各组6只)

[LcS活菌经阴道给药组]

在戊巴比妥麻醉下，对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次向阴道内给予制造例1中制造的经阴道给药用的LcS菌液10μl(1×10⁸CFU)。

[对照经阴道给药组]

在戊巴比妥麻醉下，对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经阴道给予10μl的SPG缓冲液。

[LcS活菌经口给药组]

对用手指固定的小鼠，使用灌胃器对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经口给予制造例1中制造的经口给药用的LcS菌液100μl(1×10⁸CFU)。

[对照经口给药组]

对用手指固定的小鼠，使用灌胃器对于每1只小鼠，从感染7天前至感染后第3天连续地1天1次经口给予100μl的SPG缓冲液。

(3)MoPn的菌数的测定

用与实施例1同样的方法，在MoPn感染后第21天采集小鼠的阴道组织，测定阴道内的MoPn菌数。

(4)结果

对照经阴道给药组中，在感染后第21天，由6只中3只检测出1×10⁵细胞/g的MoPn。另一方面，LcS活菌经阴道给药组中，LcS菌液的给予尽管至感染后第3天为止，其效果还在持续，在感染后第21天，全部都没有检测到MoPn。

另外，对照经口给药组中，在感染后第21天，由6只中3只检测出1×10⁵细胞/g的MoPn。另一方面，LcS活菌经口给药组中，LcS菌液的给药尽管至感染后3天为止，其效果还在持续，在感染后第21天，6只中5只没有检测到MoPn。

产业上的可利用性

本发明的衣原体传染病预防治疗剂能够进行衣原体传染病的预防和/或治疗。另外，本发明的不孕症的改善剂能够改善起因于衣原体传染病的不孕症，可以提高生育率。

序列表

<110> 株式会社益力多本社(Kabushiki Kaisha Yakult Honsha)

<120> 衣原体传染病预防治疗剂

<130> PF-150002-WO

<150> JP2014-101200

<151> 2014-05-15

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 1

tgcatagata atttgtcctt aacttg 26

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

cgagatttga caactaactt acct 24

PCT/RO/134表