诊断睾丸精原细胞瘤的方法

专利名称：诊断睾丸精原细胞瘤的方法
技术领域：
本发明涉及诊断睾丸精原细胞瘤的方法。
优先权信息
本申请要求2002年9月30日申请的美国临时申请系列号60/414,677的优先权。
背景技术：
尽管睾丸生殖细胞肿瘤(TGCTs)占男性所有癌症的1-2％，但是它们是在年龄从20到40岁的男性群体中发现的最常见的癌症(1)，且在过去几十年中发病率显著递增(2，3)。TGCTs分成两种主要地组织学类型，即精原细胞瘤，类似于未分化的生殖细胞，和非精原细胞瘤，类似于胚胎和胚外两种组织，因为它们具有沿两者中任一途径分化的能力(7)。精原细胞瘤是TGCTs中最常见的组织学睾丸肿瘤且占所有TGCTs的大约60％到65％(8)。目前，甲胎蛋白(AFP)，人绒毛膜促性腺激素β-亚基(HCG)和乳酸脱氢酶(LDH)用作TGCTs的诊断肿瘤标记(9)。然而，尚未鉴定出无合胞体滋养层巨细胞的精原细胞瘤特异性肿瘤标记。
cDNA微阵列技术能够获得正常和恶性细胞的全面(comprehensive)基因表达谱，且能够比较在恶性和相应正常细胞中的基因表达(Okabe et al.，Cancer Res 612129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 627012-7(2002))。该方法能够揭示癌症细胞的复杂特性，和帮助了解癌发生的机理。鉴定肿瘤中去调节的基因可导致更准确和精确地诊断个体癌症，和开发新的治疗靶(Bienz and Clevers，Cell 103311-20(2000))。为了从基因组揭示肿瘤的机理，即普遍性观点，和探索用于诊断和新治疗性药品开发的靶分子，本发明人使用23040个基因的cDNA微阵列分析了肿瘤细胞的表达谱(Okabeet al.，Cancer Res 612129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res627012-7(2002))。
设计用于揭示癌发生机理的实验已经帮助鉴定了抗肿瘤剂的分子靶。例如，最初开发用于抑制与Ras相关的生长-信号传导途径的，其活化依赖于翻译后的法尼基化的法尼基转移酶(FTIs)的抑制剂，在动物模型中治疗Ras-依赖型肿瘤有效(He et al.，Cell 99335-45(1999))。使用组合或抗癌药物与抗-HER2单克隆抗体，即trastuzumab对人体进行了临床试验以拮抗原癌基因受体HER2/neu；且成功改善了乳腺癌患者的临床反应和总体存活率(Lin et al.，Cancer Res 616345-9(2001))。已经开发了选择性灭活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂，即STI-571，用于治疗bcr-abl酪氨酸激酶的组成型活化在白细胞转化中起决定性作用的慢性骨髓性白血病。这些类型的试剂设计成抑制特定基因产物的致癌活性(Fujita et al.，Cancer Res 617722-6(2001))。因此，在癌细胞中通常上调的基因产物可用作开发新抗癌剂的潜在靶。
已证实CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)识别在MHC I型分子上呈递的肿瘤相关性抗原(TAAs)产生的表位肽，并裂解肿瘤细胞。自从发现MAGE家族是TAAs的第一个例子后，使用免疫学方法发现了许多其它的TAAs(Boon，Int J Cancer 54177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J ExpMed 183725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 2541643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180347-52(1994))。一些发现的TAAs现在处于作为免疫疗法靶的临床开发阶段。至今发现的TAAs包括MAGE(van der Bruggen et al.，Science 2541643-7(1991))，gp100(Kawakami et al.，J Exp Med 180347-52(1994))，SART(Shichijo et al.，J Exp Med 187277-88(1998))，和NY-ESO-1(Chen et al.，ProcNatl Acad Sci USA 941914-8(1997))。另一方面，已证实在肿瘤细胞中特异性过量表达的基因产物显示出作为诱导细胞免疫反应的靶。该基因产物包括p53(Umano et al.，Brit J Cancer 841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka et al.，Brit J Cancer 8494-9(2001))，CEA(Nukaya et al.，Int J Cancer 8092-7(1999))，等等。
尽管在涉及TAAs的基础和临床研究中取得了重要进展(Rosenbeg et al.，Nature Med 4321-7(1998)；Mukherji et al.，Proe Natl Acad Sci USA 928078-82(1995)；Hu et al.，Cancer Res 562479-83(1996))，但是仅有有限数量的候选TAAs可用于治疗腺癌，包括结肠直肠癌。在癌细胞中大量表达且同时其表达局限于癌细胞的TAAs是作为免疫治疗靶的有前景的候选物。另外，对诱导潜在和特异性抗肿瘤免疫反应的新TAAs的鉴定预期可支持在各种癌症类型中临床使用肽接种方法(Boon and can der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 2541643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180347-52(1994)；Shichijo et al.，J Exp Med 187277-88(1998)；Chen et al.，Proc Natl Acad SciUSA 941914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 881442-5(1996)；Butterfield et al.，Cancer Res 593134-42(1999)；Vissers et al.，Cancer Res 595554-9(1999)；van der Burg et al.，J Immunol 1563308-14(1996)；Tanaka et al.，Cancer Res 574465-8(1997)；Fujie et al.，Int J Cancer 80169-72(1999)；Kikuchi et al.，Int J Cancer 81459-66(1999)；Oiso et al.，Int J Cancer 81387-94(1999))。
已经反复报导了来自某些健康供体的肽刺激的外周血单核细胞(PBMCs)与该肽应答产生明显水平的IFN-，但在51Cr-释放试验中很少以HLA-A24或-A0201限制性方式发挥对肿瘤细胞的细胞毒性(Kawano et al.，Cance Res 603550-8(2000)；Nishizaka et al.，Cancer Res 604830-7(2000)；Tamura et al.，Jpn J Cancer Res 92762-7(2001))。然而，HLA-A24和HLA-A0201都是在日本人以及高加索人中常见的HLA等位基因之一(Date etal.，Tissue Antigens 4793-101(1996)；Kondo et al.，J Immunol 1554307-12(1995)；Kubo et al.，J Immunol 1523913-24(1994)；Imanishi et al.，Proceedingof the eleventh International Hictocompatibility Workshop and ConferenceOxford University Ptess，Oxford，1065(1992)；Williams et al.，Tissue Antigen 49129(1997))。因此，由这些HLAs呈递的癌抗原肽对于治疗曰本人和高加索人中的癌症特别有用。另外，已知低亲和性CTL的体外诱导通常由使用高浓度的肽引起，在抗原呈递细胞(APCs)上产生高水平的特异性肽/MHC复合物，它会有效激活这些CTL(Alexander-Miller et al.，Proc Natl Acad Sci USA 934102-7(1996))。
含有PYRIN的Apaf-1-样蛋白质(PYPAFs)是最近鉴定的蛋白质(37)。已有报导在人类(Homo sapiens)中存在14个PYPAFs基因(38)。据认为含有富含亮氨酸的重复区，PYRIN，NACHT和NACHT-相关性结构域的所有PYPAF蛋白在凋亡和炎症信号传导途径中起作用。据报道N末端的PYRIN结构域与蛋白-蛋白相互作用相关(38)。另外，NACHT结构域与凋亡蛋白酶激活因子-1(APAF-1)的核苷酸结合基序具有序列同源性，且预期结合ATP(37)。然而，含有PYRIN的Apaf-1-样蛋白质从未与肿瘤发生相联系。

发明内容
本发明以发现与睾丸精原细胞瘤(TS)相关的基因表达谱为基础。在TS中差异表达的基因本文统称为“TS核酸”或“TS多核苷酸”且相应编码的多肽称为“TS多肽”或“TS蛋白质”。
因此，本发明的特征在于通过测定诸如组织样品的患者生物学样品中TS-相关性基因的表达水平来诊断或确定受试者的TS易感性(predisposition)的方法。TS相关性基因是指其特征在于与正常细胞相比在从睾丸生殖细胞肿瘤细胞获得的细胞中表达水平存在差异的基因。正常细胞是从睾丸组织获得的细胞。TS-相关性基因是TS 1-939中的一种或多种。与该基因的正常对照水平相比基因表达水平的改变，例如升高或降低，表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。
正常对照水平是指在正常健康个体或已知没有患TS的个体的群体中检测的基因表达水平。对照水平是来自单个参照群体或来自多个表达谱的单个表达谱。例如，对照水平可以是来自以前检测的细胞的表达谱数据。正常个体是无TS临床症状且无TS家族史的个体。
与正常对照水平相比在试验样品中检测到TS 1-346水平升高表明该受试者(从他们获得样品)患有TS或者存在形成TS的风险。相反，与正常对照水平相比在试验样品中检测到TS 347-939水平降低表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。
作为选择，可比较在该样品中一组TS-相关性基因的表达与同一组基因的TS对照水平。TS对照水平是指在患有TS的群体中发现的TS-相关性基因的表达谱。
基因表达比对照水平升高或降低10％，25％，50％。或者，基因表达比对照水平升高或降低0.1，0.2，1，2，5，10或更多倍。表达可通过检测例如，阵列上TS-相关性基因探针与患者组织样品的基因转录子的杂交来测定。
患者组织样品可以是来自试验受试者，例如已知或怀疑患有TS的患者的任何组织。例如，该组织含有睾丸生殖细胞肿瘤细胞。例如，该组织是来自睾丸的细胞。
本发明还提供了TS 1-346中的两个或多个基因表达水平的TS参照表达谱。另外，本发明提供了TS 1-346或TS 347-939中的两个或多个的表达水平的TS参照表达谱。
本发明还提供了通过将表达TS相关性基因的试验细胞与试剂接触并测定TS相关性基因的表达水平来鉴定可抑制或增强诸如TS 1-939的TS-相关性基因的表达或活性的试剂。该试验细胞是睾丸细胞，例如，来自睾丸生殖细胞肿瘤的睾丸细胞。与该基因的正常对照水平相比水平降低表明该试剂是TS-相关性基因的抑制剂且减少TS的症状。另外，与该基因的正常对照水平或活性相比水平或活性升高表明该试剂是TS相关性基因的表达或功能的增强剂且减少TS的症状，例如，TS 347-939。
本发明还提供了具有与两个或多个TS核酸序列结合或者与该核酸序列编码的基因产物结合的检测试剂的试剂盒。还提供了与两个或多个TS核酸结合的核酸阵列。
治疗方法包括通过给受试者施用反义组合物治疗或预防受试者TS的方法。反义组合物降低特异性靶基因的表达，例如，该反义组合物含有与选自TS 1-346的序列互补的核苷酸。另一方法包括给受试者施用短干扰RNA(siRNA)组合物的步骤。siRNA组合物降低选自TS 1-346的核酸的表达。我们证实了PYPAF3在睾丸精原细胞瘤中普遍上调且通过小干扰RNA(siRNA)敲除PYPAF3转录子抑制睾丸生殖细胞肿瘤细胞的细胞生长。
在另一方法中，治疗或预防受试者TS通过给受试者施用核酶组合物来实现。核酸特异性核酶组合物降低选自TS 1-346的核酸的表达。其它治疗方法包括给受试者施用增加TS 347-939的表达或TS 347-939编码的多肽活性的化合物的那些方法。另外，通过施用TS 347-939编码的蛋白质可治疗TS。该蛋白质可直接施用给患者，或者作为选择，可通过例如，施用携带下调目的标记基因的表达载体或宿主细胞导入患者后体内表达。用于体内表达目的基因的合适机理是本领域已知的。
本发明还包括疫苗和接种方法。例如，治疗或预防受试者TS的方法可通过给受试者施用含有选自TS 1-346的核酸编码的多肽或者该多肽的免疫学活性片段的疫苗来实现。免疫学活性片段是长度比全长天然存在的蛋白质要短且诱导免疫反应的多肽。例如，免疫活性片段至少有8个残基长且刺激诸如T细胞或B细胞的免疫细胞。免疫细胞刺激可通过检测细胞增殖，细胞因子(例如，IL-2)的作用，或抗体的产生来测量。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管与本文所述相似或相当的方法和材料可用于实施或试验本发明，但是下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物，专利申请，专利，和其它参考文献以其整体引用以供参考。如有冲突，以本说明书，包括定义为准。另外，材料，方法，和实施例仅仅是例证性的而不是限制性的。
本文所述方法的一个优势在于在检测到明显的临床症状之前就可鉴定该疾病。本发明的其它特征和优势从下面的详细描述和权利要求书将是显而易见的。


图1表示DNA琼脂糖凝胶的照片，显示了使用扩增RNA制备的cDNA通过半定量RT-PCR检查的代表性28个基因和TUBA的表达。前11个泳道显示了不同TS患者中这些基因的表达水平。最后一条泳道显示了正常个体睾丸中各基因的表达水平。基因代号表示这些基因。
图2A显示了在8个睾丸精原细胞瘤临床样品(编号1，2，7，8，9，10，11和13)，正常人睾丸(TES)，心脏(HER)，肺(LUN)，肝脏(LIV)，肾(KID)，脑(BRA)和骨髓(BM)中通过半定量RT-PCR检查的PYPAF3表达。TUBA3的表达用作内部对照。图2B显示了使用PYPAF3 cDNA片段作为探针的多组织印迹的northern分析。
图3显示了myc-标记的PYPAF3蛋白质的亚细胞定位。用pcDNA3.1-myc/His-PYPAF3质粒转染的COS-7细胞的提取物中Myc-标记的PYPAF3蛋白。用小鼠抗-myc单克隆抗体染色转染细胞并通过FITC-偶连的抗小鼠IgG第二抗体观察。细胞核用DAPI复染。
图4显示经设计用于减少睾丸生殖细胞肿瘤系Tera-2中PYPAF3表达的小干扰RNAs(siRNA)的生长-抑制效果。(A)半定量RT-PCR表明在两周时抑制睾丸生殖细胞肿瘤系Tera-2中PYPAF3的内源性表达的抑制(siRNAs导入睾丸生殖细胞肿瘤系Tera-2细胞后在含有新霉素的选择培养基中培养。β2-微球蛋白(β2MG)用作内部对照。(B)集落形成试验证实了在两周时与作为对照的psiU6BX-EGFP(siEGFP)，psiU6BX-Luciferase(siLuc)相比，在睾丸生殖细胞肿瘤系Tera-2细胞中敲除PYPAF3(Si1，Si2，Si3，Si4，和Si5)的集落的数目减少。(C)在1周时使用细胞计数试剂盒-8对psiU6BX-PYPAF3(Si1，Si2，Si3，Si4，和Si5)，psiU6BX-EGFP(siEGFP)，psiU6BX-Luciferase(siLuc)之一所处理的睾丸生殖细胞肿瘤系Tera-2细胞进行MTT测定。这些实验也进行三次。
详细描述
本发明部分以发现TS患者睾丸细胞中多个核酸序列表达谱的改变为基础。使用全面(comprehensive)cDNA微阵列系统鉴定基因表达的差异。
使用含有23,040个基因的cDNA微阵列，构建了13个患者的全面基因表达谱。某些基因在TS患者中低或高水平表达。在选择具有检测患者血清或唾液中癌症相关性蛋白的潜力的候选分子标记的过程中，发现了在人睾丸癌症中形成信号抑制策略的一些潜在靶。
本文鉴定的差异表达基因作为TS标记和基因靶用于诊断目的，改变其表达以治疗或减轻TS症状。
在TS患者中其表达水平调整(即，增加或降低)的基因在表3，4中概括且本文统称为“TS-相关性基因”，“TS核酸”或“TS多核苷酸”，且相应编码的多肽称为“TS多肽”或“TS蛋白质”。除非另有说明，“TS”是指本文公开的任一序列。(例如，TS 1-939)。该基因以前已有描述且与数据库登录号一起提供。
通过测量细胞样品中各种基因的表达，可诊断TS。同样，通过测量与各种试剂反应这些基因的表达，可鉴定治疗TS的试剂。
本发明涉及测定(例如，测量)至少一个到多达全部的表3，4所列TS序列的表达。使用GeneBankTM数据库登录项提供的已知序列的序列信息，可使用本领域的普通技术人员熟知的技术检测和测量该TS相关性基因。例如，相应于TS序列的序列数据库登录项中的序列可用于构建探针以便在例如，northern印迹杂交分析中检测TS RNA序列。探针包括参照序列的至少10，20，50，100，200个核苷酸。作为另一例子，该序列可用于构建特异性扩增该TS序列的引物，例如，在基于扩增的检测方法中，例如基于逆转录的聚合酶链式反应。
然后比较试验细胞群体，例如患者组织样品中一或多个该TS序列的表达水平与参照群体中相同序列的表达水平。参照细胞群体包括其比较参数已知的一种或多种细胞，即，TS细胞或非TS细胞。
与参照细胞群体相比试验细胞群体中的基因表达谱是否表明为TS或对其易感依赖于参照细胞群体的组成。例如，如果参照细胞群体由非-TS细胞组成，则试验细胞群体与参照细胞群体中基因表达谱相似表明该试验细胞群体是非-TS。相反，如果参照细胞群体由TS细胞构成，则试验细胞群体与参照细胞群体之间基因表达谱相似表明该试验细胞群体包括TS细胞。
如果其表达水平相对于参照细胞群体的改变超过参照细胞群体中相应TS序列表达水平的1.0，1.5，2.0，5.0，10.0或更多倍，则在试验细胞群体中TS标记基因的表达水平认为在表达水平上有改变。
试验细胞群体与参照细胞群体之间的差异基因表达相对于对照核酸，例如管家基因正态化。例如，对照核酸是依赖于该细胞的子宫内膜异位(endometriotic)或非子宫内膜异位(non-endometriotic)状态已知无区别的核酸。试验中的对照核酸和参照核酸的表达水平可用于正态化所比较群体中的信号水平。对照基因包括β-肌动蛋白，甘油醛3-磷酸脱氢酶或核糖体蛋白P1。
将试验细胞群体与多种参照细胞群体进行比较。多种参照细胞群体中每一种的已知参数可能有差异。因此，可将试验细胞群体与已知含有，例如，TS细胞的第二种参照细胞群体，以及已知含有，例如，非-TS细胞(正常细胞)的第二种参照群体进行比较。试验细胞包含在已知含有，或者怀疑含有TS细胞的受试者的组织类型或细胞样品中。
试验细胞从身体组织或体液，例如，生物学液体(例如血液或尿)中获得。例如，试验细胞从组织中纯化。优选的是，试验细胞群体含有上皮细胞。上皮细胞来源于已知或怀疑是TS的组织。
参照细胞群体中的细胞来自于与试验细胞相似的组织类型。任选的是，参照细胞群体是细胞系，例如TS细胞系(阳性对照)或正常非-TS细胞系(阴性对照)。作为选择，对照细胞群体可来源于其测定参数或条件已知的细胞的分子信息数据库。
受试者优选是哺乳动物。该哺乳动物可以是，例如，人，非人灵长类，小鼠，大鼠，狗，猫，马，或奶牛。
使用本领域已知的方法在蛋白质或核酸水平上测定本文公开的基因的表达。例如，使用特异性识别一或多个该序列的探针进行的Northern杂交分析可用于测定基因表达。作为选择，使用基于逆转录的PCR测定法，例如使用对差异表达序列特异性的引物可测量表达。也可以在蛋白质水平上测定表达，即，通过测量本文所述的基因产物编码的多肽的水平，或其生物学活性。该方法是本领域熟知的且包括，例如，以抗该基因编码的蛋白质的抗体为基础的免疫测定法。该基因编码的蛋白质的生物学活性也是熟知的。
诊断TS
通过测量试验细胞群体，(即，患者生物学样品)中一种或多种TS核酸序列的表达水平可诊断TS。优选的是，该试验细胞群体含有上皮细胞，例如，从睾丸组织获得的细胞。基因表达也可从血液或诸如尿的其它体液中测量。其它生物学样品可用于测量蛋白质水平。例如，来自待诊断的受试者的血液，或血清中的蛋白质水平可通过免疫测定法或生物学测定法测量。
测定试验细胞或生物学样品中一种或多种TS-相关性基因，例如TS1-939的表达并与正常对照水平的表达进行比较。正常对照水平是在已知没有患TS的群体中发现的典型TS-相关性基因的表达谱。患者组织样品中TS相关性基因的表达水平升高或降低表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。例如，与正常对照水平相比在试验群体中TS 1-346的表达增加表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。相反，与正常对照水平相比在试验群体中TS 347-939的表达降低表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。
与正常对照水平相比，在试验群体中一或多个TS-相关性基因改变表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。例如，一组TS-相关性基因(TS1-346，TS 347-939，或TS 1-939)改变至少1％，5％，25％，50％，60％，80％，90％或更多。
鉴定抑制或增强TS-相关性基因表达的试剂
通过将表达TS相关性上调基因的试验细胞群体与试剂接触并测定该TS相关性基因的表达水平可鉴定抑制TS-相关性基因的表达或活性的试剂。与正常对照水平相比(或与没有该试剂时的水平相比)在该试剂存在时的表达下降表明该试剂是TS相关性上调基因的抑制剂且可用于抑制TS。
作为选择，通过将表达TS相关性基因的试验细胞群体与试剂接触并测定该TS相关性下调基因的表达水平或活性可鉴定增强TS下调相关性基因的表达或活性的试剂。与TS相关性基因的正常对照表达水平或活性相比表达或活性增加表明该试剂增加下调的TS相关性基因的表达或活性。
试验细胞群体可以是任何表达TS-相关性基因的细胞。例如，该试验细胞群体含有上皮细胞，例如，该细胞是或者来源于睾丸。例如，该试验细胞是来源于睾丸生殖细胞肿瘤的永生化细胞系。作为选择，该试验细胞是用TS-相关性基因转染的细胞或者是用与报道基因可操作地连接的TS相关性基因的调控序列(例如，启动子序列)转染的细胞。
评估受试者中TS的治疗效果
本文鉴定的差异表达的TS序列还允许用于监测TS的治疗过程。在该方法中，试验细胞群体由进行TS治疗的受试者提供。如果需要，可在治疗前，治疗期间或治疗后的各个时间点从受试者获得试验细胞群体。然后测定细胞群体中一或多个TS序列的表达并与包括其TS状况已知的细胞的参照细胞群体进行比较。该参照细胞未接受治疗。
如果参照细胞群体不含TS细胞，在试验细胞群体和参照细胞群体中TS序列之间表达的相似性表明该治疗是有效的。然而，在试验群体和正常对照参照细胞群体中TS序列之间表达的差异表明临床效果或预后不佳。
“有效”是指治疗导致病理性上调基因的表达减少，病理性下调基因的表达增加或受试者睾丸肿瘤的大小，流行，或转移潜力减小。当治疗用于预防性时，“有效”是指治疗延缓或防止TS形成或延缓，防止，或减轻临床TS的症状。使用标准临床方法进行睾丸肿瘤的评估。
有效性可与用于诊断或治疗TS的任何已知方法联合来测定。例如，通过鉴定症状异常，例如睾丸的无痛肿大，可诊断TS。
选择适合于特定个体的治疗TS的治疗剂
个体遗传组成的差异可导致在其代谢各种药物的相对能力上存在差异。在受试者中代谢充当抗-TS剂的试剂可通过诱导受试者细胞从TS状态特征性的基因表达谱改变成非-TS状态特征性的基因表达谱来自我证实。因此，本文公开的差异表达的TS序列允许在来源于选定受试者的试验细胞群体中检测TS的推定治疗性或预防性抑制剂以便确定该试剂是否是受试者中合适的TS抑制剂。
为了鉴定适合于特定受试者的TS抑制剂或增强剂，可将受试者的试验细胞群体与治疗剂接触，并测定一或多个TS 1-939序列的表达。
试验细胞群体含有表达TS相关性基因的TS细胞。优选的是，该试验细胞是上皮细胞。例如，在候选试剂存在下培养试验细胞群体，测量该试验样品的基因表达谱并与一或多个参照谱，例如，TS参照表达谱或非-TS参照表达谱进行比较。
相对于含有TS的参照细胞群体在试验细胞群体中一或多个序列TS1-346表达的减少或者一或多个序列TS 347-939表达的增加表明该试剂是治疗剂。
该试剂可以是任何化合物或组合物。例如，该试剂是免疫调节剂。
鉴定治疗剂的筛选试验
本文公开的差异表达序列也可用于鉴定治疗TS的候选治疗剂。该方法基于筛选候选治疗剂以确定其是否能将TS症状特征性的TS 1-939序列的表达谱转变成非-TS症状的指标谱。
在该方法中，将细胞与试剂或联合试剂(依次或随后)接触并测量细胞中一或多个TS 1-939序列的表达。将试验群体中TS序列的表达谱与未接触该试剂的参照细胞群体中TS序列的表达水平进行比较。
有效刺激表达不足的基因表达，或者抑制过度表达的基因表达的试剂相信会产生临床效益，可进一步试验该化合物防止动物或试验受试者中子宫内膜囊肿生长，例如子宫内膜腺体和/或基质生长的能力。
在另一实施方案中，本发明提供了筛选候选试剂的方法，该试剂是TS治疗中的潜在目标。正如上文的详细描述，通过控制标记基因的表达水平或活性，可控制TS的发作和进行。因此，通过使用标记基因的表达水平和活性作为指标的筛选可鉴定作为TS治疗的潜在目标的候选试剂。在本发明内容中，该筛选可包括，例如，下列步骤
a)将试验化合物与TS 1-939编码的多肽接触；
b)检测该多肽与试验化合物之间的结合活性；和
c)选择与该多肽结合的化合物。
作为选择，本发明的筛选方法可包含下列步骤
a)将候选化合物与表达一种或多种标记基因的细胞接触，其中一或多个标记基因选自TS 1-939；和
b)选择降低选自TS 1-346的一或多个标记基因的表达水平，或者升高选自TS 347-939的一或多个标记基因的表达水平的化合物。
表达标记基因的细胞包括，例如，从TS建立的细胞系；该细胞可用于本发明的上述筛选。
作为选择，本发明的筛选方法可包括下列步骤
a)将试验化合物与选自TS 1-939编码的多肽接触；
b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；和
c)选择与不存在该试验化合物时检测的生物学活性相比抑制TS 1-346编码的多肽的生物学活性，或者与不存在该试验化合物时检测的生物学活性相比增强TS 347-939编码的多肽的生物学活性的化合物。
筛选所需的蛋白质可使用该标记基因的核苷酸序列作为重组蛋白获得。根据该标记基因的信息，本领域的技术人员可选择该蛋白质的任一生物学活性作为基于选定生物学活性的筛选和测量方法的指标。
作为选择，本发明的筛选方法可包括下列步骤
a)将候选化合物与细胞接触，该细胞导入了含有一或多个标记基因的转录调控区和在该转录调控区控制下表达的报道基因的载体，其中一或多个标记基因选自TS 1-939
b)测量所述报道基因的活性；和
c)选择与对照相比，当所述标记基因是选自TS 1-346的上调标记基因时降低所述报道基因的表达水平或者当所述标记基因是选自TS 347-939的下调标记基因时增强所述报道基因的表达水平的化合物。
合适的报道基因和宿主细胞是本领域熟知的。筛选所需的报道基因构建体可通过使用标记基因的转录调控区来制备。当标记基因的转录调控区是本领域的技术人员已知的时，报道基因构建体可使用现有的序列信息来制备。当标记基因的转录调控区尚未鉴定时，可根据该标记基因的核苷酸序列信息从基因组文库分离含有该转录调控区的核苷酸片段。
通过筛选分离的化合物是抑制标记基因编码的蛋白质的活性且可用于治疗或预防TS的药物的候选物。
另外，通过本发明的筛选方法可获得的化合物也包括这样的化合物，即通过添加，缺失和/或取代改变了可抑制标记基因编码的蛋白质的活性的该化合物的部分结构。
当作为人类和其它哺乳动物，例如小鼠，大鼠，豚鼠，兔，猫，狗，绵羊，猪，牛，猴，狒狒，和黑猩猩的药物施用以本发明的方法分离的化合物时，该分离的化合物可直接给药或者可使用已知的药品制备方法配制成剂型。例如，根据需要，该药品可作为糖衣片剂，胶囊，酏剂和微胶囊口服，或者以含有水或任何其它可药用液体的无菌溶液或悬液的注射剂形式非口服。例如，该化合物可与可药用载体或介质，特别是无菌水，生理盐水，植物油，乳化剂，悬浮剂，表面活性剂，稳定剂，调味剂，赋形剂，载体，防腐剂，结合剂等以普遍接受的药品添加所需的单位剂量形式混合。在这些制品中活性成份的量使得可获得所需范围内的合适剂量。
可混合成片剂和胶囊的添加剂的例子是诸如明胶，玉米淀粉，黄芪胶和阿拉伯树胶的结合剂；诸如晶状纤维素的赋形剂；诸如玉米淀粉，明胶和海藻酸的膨胀剂；诸如硬脂酸镁的润滑剂；诸如蔗糖，乳糖或糖精的甜味剂；和诸如薄荷，Gaultheria adenothrix油和樱桃的调味剂。当单位剂量形式是胶囊时，在上述成份中也可进一步包含诸如油类的液体载体。注射用无菌混合物可在正常的药品添加后使用诸如注射用蒸馏水的载体配制。
生理盐水，葡萄糖，和包括诸如D-山梨醇，D-甘露糖，D-甘露醇，和氯化钠的佐剂的其它等渗液可用作注射用水溶液。它们可与诸如醇的合适增溶剂，特别是乙醇，诸如丙二醇和聚乙二醇的多元醇，诸如吐温80(TM)和HCO-50的非离子表面活性剂结合使用。
芝麻油或大豆油可用作油质液体且可与作为增溶剂的苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)或苯甲醇结合使用且可用诸如磷酸盐缓冲液和醋酸钠缓冲液的缓冲液；诸如盐酸普鲁卡因的止痛剂；诸如苯甲醇和苯酚的稳定剂；和抗氧化剂配制。制备的注射剂可装入合适的安瓿中。
可使用本领域的技术人员熟知的方法给患者施用本发明的药物组合物，例如作为动脉内，静脉内，或皮下注射剂且也可作为鼻内，经支气管，肌肉内或口服给药。给药的剂量和方法根据患者的体重和年龄和给药方法而变化；然而，本领域的技术人员可按常规选择合适的给药方法。如果所述的化合物可由DNA编码，则可将该DNA插入用于基因治疗的载体中并将该载体施用给患者进行治疗。给药的剂量和方法可根据体重，年龄，和患者的症状而变化，但本领域的技术人员可合适地选择它们。
例如，尽管与本发明的蛋白质结合并调节其活性的化合物的剂量取决于该症状，但是当给正常成年人(体重60kg)口服给药时，该剂量是每天大约0.1mg到大约100mg，优选每天大约1.0mg到大约50mg且更优选每天大约1.0mg到大约20mg。
当给正常成年人(体重60kg)不经肠道，以注射形式给药时，尽管根据患者，靶器官，症状和给药方法有一些区别，但是合适的是以每天大约0.01mg到大约30mg的剂量，优选每天大约0.1到大约20mg且更优选每天大约0.1到大约10mg的剂量静脉内注射。另外，对于其它动物，可相对于60kgs体重换算出一个给药量。
评估患有TS的受试者的预后
通过比较试验细胞群体中一或多个TS序列的表达与超过发病期表达谱的来自患者的参照细胞群体中该序列的表达还提供了评估患有TS的受试者的预后的方法。通过比较试验细胞群体和参照细胞群体中一或多个TS序列的基因表达，或者通过比较来自受试者的试验细胞群体在一段时间中的基因表达谱，可评估该受试者的预后。
与正常对照相比一或多个序列TS 347-939表达的降低或与正常对照相比一或多个序列TS 1-346表达的增加表明预后不佳。一或多个序列TS347-939表达的增加表明预后良好，序列TS 1-346表达降低也表明受试者预后良好。
试剂盒
本发明还包括TS-检测试剂，例如，特异性结合或鉴定一或多个TS核酸的核酸，例如与TS核酸的一部分互补的寡核苷酸序列或者与TS核酸编码的蛋白质结合的抗体。该试剂可以试剂盒的形式包装在一起。该试剂可包装在分开的容器中，例如，核酸或抗体(与固体基质结合或者与将它们结合到基质上的试剂分开包装)，对照试剂(阳性和/或阴性)，和/或检测标记。该试剂盒中可包括进行该试验的说明书(例如，书面，磁带，VCR，CD-ROM，等)。该试剂盒的测定形式是本领域已知的Northern杂交或夹心ELISA。
例如，可将TS检测试剂固定在诸如多孔条的固体基质上以形成至少一个TS检测位点。该多孔条的测量或检测区可包括多个含有核酸的位点。试验条也可含有阴性和/或阳性对照的位点。另外，对照位点可位于与试验条分开的条上。任选的是，不同检测位点可含有不同量的固定核酸，即第一个检测位点的量更高且随后位点的量更低。加入试验样品时，显示有可检测信号的位点数目提供了样品中存在的TS量的定量指标。该检测位点可构成任何合适的可检测形状且一般是横跨试验条宽度的条或点状。
作为选择，该试剂盒可含有核酸底物阵列，该阵列含有一或多个核酸序列。阵列上的核酸可特异性鉴定TS 1-939所示的一或多个核酸序列。根据与阵列试验条或芯片结合的水平可鉴定TS 1-939所示的2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，40或50或更多个序列的表达。底物阵列可以在例如，固体基质，例如美国专利号5,744,305所述的“芯片”上。
阵列和多个的情况
本发明还包括核酸底物阵列，该阵列含有一或多个核酸序列。阵列上的核酸特异性相应于TS 1-939所示的一或多个核酸序列。通过检测与该阵列结合的核酸来鉴定TS 1-939所示的2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，40或50或更多个序列的表达水平。
本发明还包括分离的多个核酸序列(即，两个或多个核酸的混合物)。该核酸序列存在于液相或固相中，例如，固定在诸如硝酸纤维素膜的固相支持物上。多个的情况包括TS 1-939所示的一或多个核酸序列。在各种实施方案中，多个的情况包括TS 1-939所示的2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，40或50或更多个序列。
抑制TS的方法
技术领域：
本发明提供了通过降低TS 1-346的表达或活性或者增加TS 347-939的表达或活性来治疗或减轻受试者TS症状的方法。给患有TS或者具有形成TS风险(或对TS易感)的受试者预防性或治疗性施用治疗化合物。使用标准临床方法或通过检测(例如，TS 1-939)的异常表达或活性水平可鉴定该受试者。治疗剂包括细胞周期调控，细胞增殖，和蛋白激酶活性的抑制剂。
治疗方法包括增加相对于产生TS的相同组织类型中的正常细胞在TS细胞中其表达减少的基因(“表达不足的基因”)中一或多个基因产物的表达或功能或者两者。在这些方法中，可用有效量的化合物治疗该受试者，该化合物可增加受试者中一或多个表达不足的基因的量。给药可以是系统的或者局部的。治疗性化合物包括表达不足的基因的多肽产物，或其生物学活性片段，编码该表达不足的基因且具有允许在TS细胞中表达的表达调控元件的核酸；例如可增加TS细胞中内源性的该基因的表达水平(即，上调该表达不足的基因的表达)的试剂。施用该化合物可抵抗受试者睾丸细胞中该基因异常性表达不足的影响并改善受试者的临床症状。
该方法还包括减少睾丸细胞中其表达异常性增加的基因(“过度表达基因”)中的一或多个基因产物的表达，或功能或两者。以本领域已知的任一方式可抑制表达。例如，通过给受试者施用抑制，或拮抗该过度表达基因的表达的核酸，例如破坏该过度表达基因的表达的反义寡核苷酸或小干扰RNA可抑制表达。
如上所述，可使用相应于TS 1-346的核苷酸序列的反义核酸降低TS1-346的表达水平。相应于在TS中上调的TS 1-346的反义核酸可用于治疗TS。具体地说，本发明的反义核酸可通过结合TS 1-346或与其相应的mRNAs，从而抑制该基因的转录或翻译，促进mRNAs的降解，和/或抑制TS 1-346编码的蛋白质的表达，最终抑制该蛋白质的功能来起作用。本文使用的术语“反义核酸”包含与靶序列完全互补的多核苷酸和具有一或多个核苷酸错配，只要该反义核酸可与靶序列特异性杂交的那些多核苷酸。例如，本发明的反义核酸包括在至少15个连续核苷酸的范围内具有至少70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高的同源性的多核苷酸。可使用本领域已知的算法测定同源性。
本发明的反义核酸衍生物在可产生由标记基因编码的蛋白质的细胞中通过结合编码该蛋白质的DNAs或mRNAs，抑制其转录或翻译，促进mRNAs的降解，和抑制该蛋白质的表达，从而导致抑制该蛋白质的功能来起作用。
本发明的反义核酸衍生物可通过与对该衍生物无活性的合适基质材料混合制成外用制品，例如擦剂或敷剂。
同样，如果需要，该衍生物可通过添加赋形剂，等渗剂，增溶剂，稳定剂，防腐剂，止痛剂等配制成片剂，粉剂，粒剂，胶囊，脂质体胶囊，注射剂，溶液，滴鼻剂和冻干剂。可按已知的方法制备它们。
通过直接施用到患病位点或者通过注射进血管使其到达患病位点可给予患者该反义核酸衍生物。也可使用封固有反义物的介质以增加持久性和膜渗透性。例子有脂质体，多聚-L-赖氨酸，脂类，胆固醇，脂转染剂或它们的衍生物。
本发明的反义核酸衍生物的剂量可根据患者的状况适当调节且按需要量使用。例如，给药的剂量范围为0.1至100mg/kg，优选0.1至50mg/kg。
本发明的反义核酸可抑制本发明的蛋白质的表达且因此可用于抑制本发明的蛋白质的生物学活性。另外，可使用含有本发明的反义核酸的表达抑制剂，因为它们可抑制本发明的蛋白质的生物学活性。
本发明的反义核酸包括修饰的寡核苷酸。例如，可使用硫化(thioated)核苷酸给寡核苷酸提供核酸酶抗性。
另外，可使用抗标记基因的siRNA减少该标记基因的表达水平。术语“siRNA”是指防止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可使用标准技术将siRNA导入细胞，包括其中DNA是从其转录RNA的模板的那些方法。在本发明的内容中，siRNA包含针对上调标记基因，例如TS 1-346的有义核酸序列和反义核酸序列。构建siRNA以便单个转录子同时具有靶基因的有义和互补反义序列，例如发夹结构。
该方法可用于改变例如，由于细胞恶性转化而上调的细胞中的表达。siRNA与相应于靶细胞中TS 1-346之一的转录子结合导致细胞中该蛋白质的产量减少。该寡核苷酸的长度是至少10个核苷酸且可与天然存在的该转录子一样长。优选的是，该寡核苷酸是19-25个核苷酸长。最优选的是，该寡核苷酸不超过75，50，25个核苷酸长。例如，含有作为靶序列的SEQ ID NO85或86的核苷酸序列的PYPAF3的siRNAs可抑制TS的细胞增殖。
siRNAs的核苷酸序列可使用可从Ambion网址(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)获得的siRNA设计计算机程序来设计。该计算机程序根据下列方法选择用于siRNA合成的核苷酸序列。
siRNA靶位点的选择
1.从目标转录子的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA双核苷酸序列。记录各AA的出现并将3’相邻的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl等建议针对5′和3′非翻译区(UTRs)和靠近起始密码子(75个碱基之内)的区域设计siRNA，因为这些区域的调控性蛋白结合位点更丰富。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干涉siRNA核酸内切酶复合物的结合。
2.比较潜在的靶位点与人基因组数据库并排除与其它编码序列具有明显同源性的任何靶序列的因素。同源性检索可使用BLAST进行，BLAST可在NCBI服务器上以www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/找到。
3.选择限定的靶序列用于合成。在Ambion上，可沿该基因长度选择一些优选的靶序列用于评估。
本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明的多肽的表达，因此可用于抑制本发明的多肽的生物学活性。另外，表达抑制剂，包括本发明的反义寡核苷酸或siRNA也是有用的，因为它们可抑制本发明的多肽的生物学活性。因此，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗TS。
作为选择，通过施用与该基因产物结合或者抑制该基因产物的功能的化合物可抑制过度表达基因中一或多个基因产物的功能。例如，该化合物是结合该过度表达基因产物的抗体。
本发明涉及使用抗体，特别是抗上调标记基因编码的蛋白质的抗体，或该抗体的片段。本文所用的术语“抗体”是指具有仅与用于合成该抗体的抗原(即，上调标记基因产物)或与其近亲的抗原相互作用(即，结合)的特异性结构的免疫球蛋白分子。另外，抗体可以是抗体的片段或修饰抗体，前提是它能结合一或多个标记基因编码的蛋白质。例如，该抗体片段可以是Fab，F(ab’)2，Fv，或单链Fv(scFv)，其中来自H和L链的Fv片段通过合适的接头连接(Huston J.S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855879-5883(1988))。更具体地说，通过用诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶处理抗体可产生抗体片段。作为选择，可构建编码该抗体片段的基因，插入表达载体中，并在合适的宿主细胞中表达(参见，例如，Co M.S.et al.J.Immunol.1522968-2976(1994)；Better M.and Horwitz A.H.Methods Enzymol.178476-496(1989)；Pluckthun A.and Skerra A.Methods Enzymol.178497-515(1989)；Lamoyi E.Methods Enzymol.121652-663(1986)；Rousseaux J.et al.Methods Enzymol.121663-669(1986)；Bird R.E.and Walker B.W.Trends Biotechnol.9132-137(1991))。
通过与诸如聚乙二醇(PEG)的各种分子连接可修饰抗体。本发明提供了该修饰的抗体。该修饰的抗体可通过化学修饰抗体获得。这些修饰方法是本领域常规的。
作为选择，抗体可作为来自非人抗体的可变区和来自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体，或者作为含有来自非人抗体的互补决定区(CDR)，来自人抗体的构架区(FR)，和恒定区的人源化抗体获得。可使用已知技术制备这些抗体。
通过抗癌药的临床开发和控制批准已经验证了针对在癌症细胞中出现的特定分子改变的癌症疗法，例如用于治疗晚期乳腺癌的trastuzumab(Herceptin)，用于慢性骨髓性白血病的imatinib methylate(Gleevec)，用于非小细胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)，和用于B-细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤的rituximab(anti-CD20 mAb)(Ciardiello F，Tortora G.一种治疗癌症的新方法靶向表皮生长因子受体。Clin Cancer Res.2001 Oct；7(10)2958-70。Review.；Slamon DJ，Leyland-Jones B，Shak S，Fuchs H，Paton V，Bajamonde A，Fleming T，Eiermann W，Wolter J，Pegram M，Baselga J，Norton L.使用化疗加抗HER2的单克隆抗体用于过度表达HER2的转移乳腺癌。N Engl J Med.2001 Mar 15；344(11)783-92.；Rehwald U，Schulz H，Reiser M，Sieber M，StaakJO，Morschhauser F，Driessen C，Rudiger T，Muller-Hermelink K，Diehl V，Engert A.用单克隆抗体治疗复发性CD20+Hodgkin淋巴瘤有效且耐受性好德国Hodgkin淋巴瘤研究小组的2期试验。Blood.2003 Jan15；101(2)420-424.；Fang G，Kim CN，Perkins CL，Ramadevi N，Winton E，Wittmann S and Bhalla KN.(2000).Blood，96，2246-2253.)。这些药物在临床上有效且比传统抗癌剂具有更好的耐受性，因为它们仅靶向转化细胞。因此，这些药物不仅提高了癌症患者的存活率和生活质量，而且证实了分子靶向性癌症疗法的观念。此外，当联合使用时靶向药物可增强标准化疗的效力(Gianni L.(2002).Oncology，63 Suppl 1，47-56.；Klejman A，Rushen L，Morrione A，Slupianek A and Skorski T.(2002).Oncogene，21，5868-5876.)。因此，将来的癌症治疗很可能包含联合常规药物与针对诸如血管发生和侵入性的肿瘤细胞区别特征的靶特异性试剂。
这些调节方法可离体或体外(例如，通过用该试剂培养细胞)或者，作为选择，在体内(例如，通过给受试者施用该试剂)进行。该方法包含施用蛋白质或蛋白质的组合或核酸分子或核酸分子的组合作为抵消差异表达基因的异常表达或活性的疗法。
其特征在于该基因的水平或生物学活性增加(相对于没有患该疾病或紊乱的受试者)的疾病和紊乱可用拮抗(即，减小或抑制)该过度表达基因的活性的治疗剂进行治疗。拮抗活性的治疗剂可治疗性或预防性给药。
可利用的治疗剂包括，例如，(i)表达不足的序列的多肽，或类似物，衍生物，片段或其同源物；(ii)抗过度表达序列的抗体；(iii)编码表达不足序列的核酸；(iv)反义核酸或“机能障碍性”核酸(即，由于在一或多个过度表达序列的编码序列内有异源性插入)；(v)小干扰RNA(siRNA)；或(vi)调节物(即，改变过度表达/表达不足的多肽与其结合配偶体之间的相互作用的抑制剂，促效剂和拮抗剂。该机能障碍性反义分子用于通过同源重组“敲除”多肽的内源性功能(参见，例如，Capecchi，Science 2441288-1292 1989)。
其特征在于降低了(相对于没有患该疾病或紊乱的受试者)水平或生物学活性的疾病和紊乱可用增加活性的治疗剂(即，促效剂)进行治疗。上调活性的治疗剂可以治疗性或预防性方式给药。可利用的治疗剂包括，但不限于，多肽(或其类似物，衍生物，片段或同源物)或增加生物利用率的促效剂。
通过获取患者组织样品(例如，从活检组织)并体外测定其中的RNA或肽水平，表达肽(或其表达改变的基因的mRNAs)的结构和/或活性来定量肽和/或RNA可容易地检测增加或降低的水平。本领域熟知的方法包括，但不限于，免疫测定法(例如，通过Western印迹分析，免疫沉淀之后的十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫细胞化学，等)和/或检测mRNAs表达的杂交试验(例如，Northern试验，斑点印迹，原位杂交，等)。
预防性给药在表现出疾病的明显临床症状之前进行，以便在其进程上防止或者延迟疾病或紊乱。
治疗性方法包括将细胞与可调节差异表达基因的基因产物的一种或多种活性的试剂接触。调节蛋白质活性的试剂包括核酸或蛋白质，这些蛋白质的天然存在的同类配体，肽，肽模拟物，或其它小分子。例如，该试剂刺激一或多个差异表达不足基因的一种或多种蛋白质活性。
本发明还涉及治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用含有选自TS 1-346的核酸编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或者编码该多肽或其片段的多核苷酸的疫苗。施用该多肽可诱导受试者的抗肿瘤免疫性。为了诱导抗肿瘤免疫性，可施用选自TS 1-346的核酸编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段，或编码该多肽的多核苷酸。该多肽或其免疫活性片段可用作抗TS的疫苗。在某些情况下，该蛋白质或其片段可与T细胞受体(TCR)结合或者由诸如巨噬细胞，树突细胞(DC)，或B-细胞的抗原呈递细胞(APC)呈递的形式给药。由于DC的优良抗原呈递能力，在APCs中使用DC是最优选的。
在本发明中，抗TS的疫苗是指当给动物接种时具有诱导抗肿瘤免疫性功能的物质。根据本发明，TS 1-346编码的多肽或其片段建议是可诱导针对表达TS 1-346的TS细胞的有效和特异性免疫反应的HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽。因此，本发明还包含使用该多肽诱导抗肿瘤免疫性的方法。一般来说，抗肿瘤免疫性包括如下的免疫反应
-诱导抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，
-诱导识别肿瘤的抗体，和
-诱导抗肿瘤细胞因子的产生。
因此，当某一蛋白质接种进动物后诱导这些免疫反应中任一项时，该蛋白质确定为具有抗肿瘤免疫性诱导效力。蛋白质诱导的抗肿瘤免疫性可通过体内或体外观察宿主免疫系统对该蛋白质的应答来检测。
例如，检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是熟知的。进入活体的外源物质通过抗原呈递细胞(APCs)的作用呈递给T细胞和B细胞。由于该抗原的刺激T细胞与APC呈递的抗原反应以抗原特异性方式分化成细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTLs)，然后增殖(这称为T细胞的活化)。因此，通过APC将该肽呈递给T细胞，并检测CTL的诱导可评估某一蛋白质的CTL诱导。另外，APC具有激活CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，嗜曙红细胞，和NK细胞的效力。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤免疫性中也是重要的，因此使用这些细胞的激活效力作为指标可评估该肽的抗肿瘤免疫性诱导作用。
使用树突细胞(DCs)作为APC评估CTL的诱导作用的方法是本领域熟知的。DC是APCs中具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在该方法中，待测多肽最初与DC接触，然后该DC与T细胞接触。检测与DC接触后对目的细胞具有细胞毒性效力的T细胞表明该待测多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。可检测CTL的抗肿瘤活性，例如，使用51Cr-标记的肿瘤细胞的裂解作为指示剂。作为选择，使用3H-胸苷吸收活性或LDH(乳糖脱氢酶)-释放作为指示剂评估肿瘤细胞损伤程度的方法也是熟知的。
除了DC外，外周血单核细胞(PBMCs)也可用作APC。据报道通过在GM-CSF和IL-4存在下培养PBMC可增强CTL的诱导。同样，已表明通过在匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)和IL-7存在下培养PBMC可诱导CTL。
通过这些方法证实具有CTL诱导活性的待测多肽是具有DC活化效力和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导抗肿瘤细胞的CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。另外，通过与该多肽接触获得诱导抗肿瘤的CTL的能力的APC可用作抗肿瘤疫苗。另外，由于APC呈递该多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗肿瘤疫苗。这种使用APC和CTL产生的抗肿瘤免疫性治疗肿瘤的方法称为细胞免疫疗法。
一般来说，当使用多肽用于细胞免疫治疗时，已知通过联合具有不同结构的多种多肽并将它们与DC接触可增加CTL-诱导的效力。因此，当用蛋白质片段刺激DC时，使用多种类型的片段混合物是有利的。
作为选择，通过观察诱导抗肿瘤的抗体产生可证实该多肽诱导的抗肿瘤免疫性。例如，当在用该多肽免疫的实验动物中可诱导抗多肽的抗体，且当这些抗体可抑制肿瘤细胞的生长时，该多肽可测定为具有诱导抗肿瘤免疫性的能力。
通过施用本发明的疫苗可诱导抗肿瘤免疫性，且抗肿瘤免疫性的诱导可治疗和预防TS。抗癌疗法或癌症发作的预防包括诸如抑制癌细胞生长，癌症退化，和抑制癌症发生的任一步骤。癌症的治疗或预防也包括患有癌症的个体死亡率的减少，血液中肿瘤标记的减少，伴随癌症的可检测症状的减轻等。该治疗性和预防性效果优选是统计学上显著的。例如，在观察中，疫苗抗细胞增殖疾病的治疗性或预防性效果与没用疫苗给药的对照相比时，显著性水平为5％或更低。例如，可使用Student’s t-检验，Mann-WhitneyU-检验，或ANOVA进行统计学分析。
上述具有免疫学活性的蛋白质或编码该蛋白质的载体可与佐剂结合。佐剂是指当与具有免疫活性的蛋白质一起(或连续)给药时可增强对该蛋白质的免疫反应的化合物。佐剂的例子包括霍乱毒素，沙门氏菌毒素，明矾等等，但不限于此。此外，本发明的疫苗可与可药用载体适当结合。该载体的例子有无菌水，生理盐水，磷酸盐缓冲液，培养液，等等。另外，该疫苗可按需要含有稳定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂，等等。该疫苗可系统或局部给药。可通过单次给药，或通过多次给药加强来进行疫苗给药。
当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，例如，可通过离体方法治疗或预防肿瘤。更具体地说，收集接受治疗或预防的受试者的PBMCs，将该细胞与该多肽离体接触，并在诱导APC或CTL之后，给受试者施用该细胞。通过将编码该多肽的载体离体导入PBMCs中也可诱导APC。体外诱导的APC或CTL可在给药前进行克隆。通过克隆和生长具有高活性的损伤靶细胞的细胞，可更有效地进行细胞免疫疗法。另外，以该方式分离的APC和CTL可用于不仅针对产生该细胞的个体，而且针对来自其它个体的相似类型肿瘤的细胞免疫疗法。
另外，提供了含有药用有效量的本发明多肽的药用组合物用于治疗或预防诸如癌症的细胞增殖性疾病。该药用组合物可用于产生抗肿瘤免疫性。
抑制TS的药用组合物
药用配制品包括适合于口服，直肠，鼻，局部(包括口腔和舌下)，阴道或肠胃外(包括肌肉内，皮下和静脉内)给药，或者通过吸入或吹入给药的那些配制品。优选的是，通过静脉内给药。该配制品任选以分开的剂量单位包装。
适合于口服给药的药用配制品包括分别含有预定量活性成份的胶囊，扁囊剂或片剂。配制品还包括粉剂，粒剂或溶液，悬液或乳剂。该活性成份任选作为丸状干药糖剂(bolus electuary)或糊剂给药。用于口服给药的片剂和胶囊可含有常规赋形剂，例如结合剂，填充剂，润滑剂，分解剂或润湿剂。片剂可通过压紧或模压制备，任选含有一种或多种配方成份。压紧的片剂可通过在合适的机器中压缩诸如粉末或颗粒的自由流动形式的活性成份来制备，任选与结合剂，润滑剂，惰性稀释剂，润滑剂，表面活性剂或分散剂混合。模压片剂可通过在合适的机器中模压用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备。片剂可按照本领域熟知的方法包衣。口服液体制品可以是例如，含水或含油悬液，溶液，乳剂，糖浆或酏剂，或者可作为干燥产品提供，在使用前与水或其它合适的载体进行配制。该液体制品可含有常规添加剂，例如悬浮剂，乳化剂，非水载体(可包括食用油)，或防腐剂。任选可配制该片剂以便提供缓释或控制释放其中的活性成份。一个片剂包装可含有一片到每月服用的片数。
用于肠胃外给药的配制品包括可含有抗氧化剂，缓冲剂，制菌剂和导致该配制品与所需接受者血液等渗的溶质的含水和无水无菌注射溶液；和可包含悬浮剂和增稠剂的含水和无水无菌悬液。该配制品在单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中提供，且可在冷冻干燥(冻干)的条件下贮存，仅需要在使用前直接加入诸如盐水，注射用水的无菌液体载体。作为选择，可提供该配制品用于连续输注。可从前面所述类型的无菌粉剂，粒剂和片剂制备临时注射溶液和悬液。
用于直肠给药的配制品包括含有诸如椰子油或聚乙二醇的标准载体的栓剂。用于在口腔局部给药，例如颊部或舌下给药的配制品包括在诸如蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶的香味基质中含有该活性成份的锭剂，和在诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的基质中含有该活性成份的锭剂。对于鼻内给药，本发明的化合物可作为液体喷雾剂或可分散的粉剂或以滴剂的形式使用。滴剂可用含水或无水基质配制，可还含有一种或多种分散剂，增溶剂或悬浮剂。
对于通过吸入给药，该化合物可从吹入器，喷雾器，增压包或气溶胶喷雾剂给药的其它合适的工具中方便地给药。增压包可含有合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。对于增压气溶胶，该剂量单位可通过提供一个阀门以释放标明的量来确定。
作为选择，对于吸入或吹入给药，该化合物可采用干粉组合物的形式，例如该化合物与诸如乳糖或淀粉的合适粉状基质的粉状混合物。该粉状组合物可在单位剂量形式，例如，胶囊，药筒，明胶或泡状包(blister packs)中提供，从其中借助于吸入器或吹入器施用该粉末。
其它配制品包括释放治疗剂的可植入装置和粘贴膏药。
如果需要，可使用上述配制品调整为持续释放该活性成份。该药用组合物也可含有诸如抗微生物剂，免疫抑制剂或防腐剂的其它活性成份。
应明白除了上文具体提及的成份外，本发明的配制品可包含对于所述配制品类型本领域常规的其它试剂，例如，适合于口服给药的那些配制品可包含香味剂。
优选的单位剂量配制品是含有如下所述的有效剂量，或其合适部分的活性成份的那些配制品。
对于上述每一种情况，该组合物，例如多肽和有机化合物可按从每天大约0.1到大约250mg/kg的剂量口服或通过注射给药。成人的剂量范围一般从大约5mg到大约17.5g/天，优选大约5mg到大约10g/天，最优选大约100mg到大约3g/天。以分散单位提供的片剂或其它单位剂量形式可方便地含有在该剂量或者多个该剂量下有效的量，例如，含有大约5mg大约500mg的单位，通常从大约100mg到大约500mg的单位。
使用的剂量依赖于许多因素，包括受试者的年龄和性别，治疗的确切疾病，及其严重性。给药途径也依赖于病症及其严重性而变化。
在下面实施例中将进一步描述本发明，该实施例不是对权利要求书所述的本发明的范围的限制。下面实施例举例说明了在TS细胞中差异表达的基因的鉴定和特征描述。
实施例1试验样品的制备
评估从患病组织(例如，来自睾丸生殖细胞肿瘤的睾丸细胞)和正常组织获得的组织以鉴定差异表达的基因或疾病状态，例如，TS。按如下进行该试验。
患者，组织样品，和激光获取的显微解剖(LCM)
TGCT样品从进行睾丸切除术的13个患者获得。这些患者的临床特征在表1中概括。使用了诊断为精原细胞瘤的12个样品和同时为精原细胞瘤和卵黄囊肿瘤的1个样品。
所有样品在-80℃下冷冻，然后包埋于TissueTek OCT培养基(Sakura)中。冷冻标本用恒冷切片机(Sakura)以8-μm切片进行连续切片并用苏木精和曙红染色以明确分析区域。然后，使用PixCell II LCM System(ArcturusEngineering)按照带有一些修改的厂商方案(21)从各染色组织选择性显微分离精原细胞瘤细胞。
表1. 13个睾丸精原细胞瘤的临床特征
提取和纯化RNA和基于T7的RNA扩增
从放入350μl RLT裂解缓冲液(QIAGEN)中的获取的细胞提取总RNAs。提取的RNAs在室温下用30个单位的DNase I(QIAGEN)处理15分钟。使用Ampliscribe T7转录试剂盒(Epicentre Technologies)(20)对所有DNase I处理的RNAs进行基于T7的扩增。对每个组织进行两轮扩增产生30-238μg的扩增RNA(aRNA)。对于对照探针，通过基于T7的扩增对正常人poly(A)+RNA(Clontech)进行两轮扩增。来自各癌症组织和对照的2.5μg的aRNAs等分试样分别在Cy5-dCTP和Cy3-dCTP存在下进行逆转录(22)。
制备cDNA微阵列
建立了“全基因组(genome-wide)”cDNA微阵列系统，它含有选自国家生物技术信息中心(NCBI)UniGene数据库(build#131)的23,040个cDNAs。简单的说，使用从各种人器官分离的poly(A)+RNA作为模板通过RT-PCR扩增cDNAs；扩增子的长度范围不包括重复或poly(A)序列为从200到1,100bp。使用第III代微阵列点样器(Amersham Biosciences)在7型玻璃片上点样PCR产物；在单个玻璃片上以一式两份点样4608个基因。制备5组不同的玻璃片(即，总共23,040个基因)，每组上还点样相同的52个管家基因和两个阴性对照基因(23)。
杂交和数据的获取
除了所有的过程都用自动玻璃片处理器(Amersham Biosciences)进行外按照以前所述的方法进行杂交和洗涤。通过ArrayVision计算机程序(Amersham Biosciences)以光学测定法计算各杂交信号的强度并扣除背景强度。使用52个管家基因的平均信号进行各Cy3-和Cy5-信号强度的正态化。根据背景波动自动计算各表达水平的临界(cut-off)值。计算Cy5/Cy3作为相对表达比率。当Cy3和Cy5信号强度都低于临界值时，根据以前的报道(23)将该样品中相应基因的表达评估为无。对于其它基因，使用各样品的原始数据计算Cy5/Cy3比率。
实施例2鉴定TS-相关性基因
鉴定对TS共有的上调或下调基因时，根据下列标准分析该基因。选择其相对表达水平在超过50％的病例中能够计算且在超过70％的病例中其表达上调或下调的起始基因。另外，如果在35到50％的病例中能够计算相对表达比率，也评估该基因上调或下调的所有病例。各基因的相对表达比率(Cy5/Cy3强度比率)分成如下四类之一(1)上调(表达比率超过5.0)；(2)下调(表达比率低于0.2)；(3)表达无改变(表达比率在0.2和5.0之间)；和(4)不表达(或微弱表达但在检测临界值之下)。这些类型用于检测其表达比率的改变在样品中是共有的以及是某一亚群特异性的一组基因。为了检测在精原细胞瘤细胞中通常上调或下调的候选基因，筛选23,040个基因的全面表达谱以选择表达比率超过5.0或低于0.2的基因。
鉴定具有TS细胞临床相关性表达谱的基因
为了阐明TGCTs形成和进行潜在的遗传事件，我们借助于全基因组的cDNA微阵列分析了临床材料中的基因表达。微阵列技术使得可以在单次实验中分析几千个基因的表达，并获得对癌症分子机制的新认识。预期该数据有助于改善临床管理，从而给癌症患者提供更好的生活质量。
一组研究者使用定制的位于第17号染色体上的基因的cDNA微阵列分析了基因表达谱(13)，因为第17号染色体长臂在TGCTs中通常过量出现。然而在该研究中仅分析了第17号染色体上的636个基因和基因组中其它处的512个基因。根据我们的了解，我们首次对TGCTs进行了“全基因组”cDNA微阵列分析。
我们特别针对TS，使用含有23,040个基因的全面cDNA微阵列系统检查了以LCM纯化的精原细胞瘤细胞群体。以该方法选择的癌细胞比例通过显微镜检测定估计达到几乎100％。
鉴定了其表达比率超过5.0的346个上调基因(表3)，同时鉴定了其表达比率低于0.2的593个下调基因(表4)。此外，特别是鉴定了其表达比率超过10.0的213个高度上调基因(数据未显示)。另一方面，鉴定了其表达比率低于0.1的376个下调基因(数据未显示)。
它们中的一些可能提供了新治疗剂的潜在分子靶，和/或用作诊断性肿瘤标记。表3列出的基因包括CCND2(1)，POV1(24)，PIM2(25)，JUP(26)，和MYCN(14)，即已知与TS的癌发生或细胞增殖相关的基因。例如CCND2，它调节RB蛋白的磷酸化并控制G1-S细胞周期关卡，在TS中通常高表达；通过过量表达D-型细胞周期蛋白破坏该关卡是人类肿瘤形成的主要途径之一(1)。POV1首先鉴定为在前列腺癌中过量表达的基因(24)，后来表明在所有TS以及睾丸原位癌中高度表达(13)。该基因编码具有12个跨膜结构域的膜转运蛋白且可运输细胞生长必需的营养物和/或代谢产物(27)。因此，其产物可以是治疗TS和前列腺癌的抗癌药物的潜在分子靶。PIM2，即编码丝氨酸苏氨酸激酶的原癌基因，以前报道在造血干细胞，白血病和淋巴瘤细胞系，和TS中高度表达；其产物在造血和致癌性转化中似乎具有决定性作用(25)。JUP也称为γ-连环蛋白，在细胞粘着和Wnt信号传导途径中起重要作用；JUP受到APC肿瘤抑制基因的调控，据认为其在结肠癌中的致癌活性不同于β-连环蛋白(26)。在各种人类肿瘤，最常见的是成神经细胞瘤中已经观察到MYCN基因的扩增，且在精原细胞瘤和非-精原细胞瘤中都报道了其过量表达(14)。因此，抑制这些致癌性功能可能是治疗TS的一种新方法。另外，这些上调元件包括与信号转导途径，癌基因，细胞周期，和细胞粘着及细胞骨架相关的重要基因(表5)。
除了已知与睾丸癌有一些相关性的基因外，我们注意到包括PIM-1，RET和VAV2的其它癌基因的过量表达。PIM-1编码丝氨酸/苏氨酸激酶(28)，它在我们的微阵列检查的所有11个提供信息的精原细胞瘤中都过量表达。RET在所有6个提供信息的精原细胞瘤中也过量表达。RET基因编码受体酪氨酸激酶，它是转导细胞生长和分化信号的细胞表面分子；RET基因的种系突变引起两种遗传性癌综合征，即多发性内分泌腺瘤形成2A和2B型(29)。VAV2，即VAV癌基因家族的一个成员，在我们的微阵列检测的12个提供信息的精原细胞瘤病例中有11个过量表达。VAV蛋白与细胞转化和癌发生相关；它似乎增强转化细胞的转移特性或用作引起诸如Ras的癌蛋白的转化活性的辅助因子(30)。
在另一方面，我们列出的下调基因包括至少一个已知的肿瘤抑制基因，即WT1，其失活引起Wilms肿瘤和WAGR综合征，其特征在于易感Wilms肿瘤，无虹膜，泌尿生殖异常，和智力迟钝(31)。在睾丸生殖细胞肿瘤中通常观察到含有WT1的染色体区域丧失杂合性(32)。另外，Wilms肿瘤1-缔合蛋白(KIAA0105，WTAP)，即WT1-结合配偶体，在我们的研究中也下调。由于WT1与泌尿生殖系统的正常发育相关，因此其产物可以是与睾丸癌发生相关的一个候选物，尽管其分子机制仍不清楚。
最近通过使用分子靶向药物实现的临床改善强调了发现新分子靶在开发治疗特异性癌症的药物中的重要性。例如，抗-HER2单克隆抗体，即trastuzumab，与抗癌药物联合可拮抗原癌基因受体HER2/neu并导致临床反应的改善和一些乳腺癌患者的存活(33)。STI-571，即酪氨酸激酶抑制剂靶向性bcr-abl，它是现在治疗慢性骨髓性白血病的首选药物(34)，表皮生长因子受体抑制剂，即gefitinib，用于治疗非小细胞肺癌(35)。抗-CD20单克隆抗体，即rituximab，可提高B-细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤患者的完全缓解率和总体存活率(36)。因此，本文鉴定的且与细胞增殖相关的上调基因产物可以是用于设计新型TS治疗剂的有希望的潜在靶。具体地说，在自分泌细胞生长途径中起作用的分泌蛋白质应当是药物开发中的优良候选物且可成为该癌症类型的新诊断标记。
在本研究分析的13例中有11例按临床病理学分类为I期。因此，在我们的微阵列上普遍上调或下调的基因很可能与相对早期的癌发生相关。因此，我们的数据不仅提供了关于癌症相关性基因的新信息而且提供了已知基因与癌发生的新关联。然而，在本文中描述的信息揭示了TS形成期间遗传活性改变的高度复杂性；该结果以这一类型癌症的潜在治疗靶和/或生物学标记的一个长表提供。
表3 在睾丸精原细胞瘤中普遍上调5倍或更多的346个基因
表4 在睾丸精原细胞瘤中普遍下调0.2倍或更低的593个基因
表5 在睾丸精原细胞瘤中具有已知功能的代表性上调基因
半定量RT-PCR
选择29个上调基因并通过应用半定量RT-PCR实验检查其表达水平。使用随机引物(Roche)和Superscript II(Life Technologies，Inc.)从各样品aRNA的3-μg等分试样逆转录单链cDNAs。稀释各cDNA混合物用于随后使用制备靶DNA-或α-tublin-特异性反应的相同引物组进行PCR扩增。引物序列在表2中列出。α-tublin的表达用作内部对照。对PCR反应进行多轮优化以确保产物强度在扩增的线性期内。比较在几乎所有提供信息的病例中其表达为过量表达的29个上调基因(CCND2，GIP，H1F2，NMA，PIM2，POV1，PRDM4，PTMS，RAI3，PYPAF3，T1A-2，TCOF1，TGIF2，FLJ10713，FLJ20069，KIAA0456，KIAA1198，DKFZp434K0621，EST(270)，FLJ13352，FLJ12195，EST(285)，NCOA6IP，EST(295)，PLXNA2，EST(311)，EST(320)，LOC152217，EST(341))的表达水平的比率，结果与在绝大多数试验病例的微阵列分析的结果高度相似(图1，图2A)。
表2RT-PCR的引物序列
实施例3设计成减少PYPAF3表达的SIRNA的生长抑制效应
通过cDNA微阵列分析全基因组的表达谱，我们分离了用于诊断性肿瘤标记，睾丸生殖细胞肿瘤的治疗和预防的新分子靶。在睾丸精原细胞瘤中普遍上调的基因中，我们注意到含有PYRIN的Apaf-1-样蛋白3(PYPAF3(NM 139176))，通过半定量RT-PCR分析与包括睾丸，心脏，肺，肝脏，肾，脑和骨髓的正常人器官相比，在具有睾丸精原细胞瘤的8个病例中有7个其显著上调。尽管目前我们将PYPAF3鉴定为睾丸精原细胞瘤中的上调基因(bulid#160)，但是我们最初使用代表从国家生物技术信息中心的Unigene数据库(build#131)检索的23,040个基因的cDNA微阵列通过表达谱将该基因列为RMPRMB5-介导的蛋白质。
使用PYPAF3 cDNA片段作为探针进行的多组织Northern印迹分析揭示了仅在睾丸中表达的大约3.3kb的转录子。免疫细胞化学试验揭示了PYPAF3蛋白质存在于整个细胞质中。转染PYPAF3的小干扰RNA(siRNA)可抑制PYPAF3的mRNA表达和睾丸生殖细胞肿瘤细胞的细胞生长。这些发现表明PYPAF3可能与睾丸精原细胞瘤的肿瘤发生相关，并提供了用于睾丸生殖细胞肿瘤的靶向治疗开发的有希望的候选物。
细胞系和组织样品
COS-7细胞和Tera-2细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)获得。所有的细胞系在补充了10％胎牛血清和1％抗生素/抗霉菌溶液(Sigma，St.Louis，MO)的合适培养基中以单层生长，Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(Sigma)用于COS-7 McCoy’s 5A(Invitrogen，Carlsbad CA)，并在37℃下含有5％CO2的潮湿空气中维持。
半定量RT-PCR
正常人睾丸，心脏，肺，肾，肝脏，脑，和骨髓poly(A)+RNA通过Clontech(Palo Alto，CA)获得。来自各样品的扩增RNA的3-μg等分试样使用随机引物(Roche)和Superscript II逆转录酶(Invitrogen)逆转录成单链cDNAs。稀释各单链cDNA用于随后的PCR扩增。在20ml体积的PCR缓冲液(Takara，Kyoto，Japan)中完成标准RT-PCR程序，扩增在94℃变性5分钟，接着进行94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒的22个(对于TUBA3)或31个(对于PYPAF3)循环。引物序列如下对于TUBA3，正向引物5′-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3′(SEQ ID NO59)，反向为5′-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3′(SEQ ID NO60)；对于PYPAF3，正向为5’-TGGGGTTCTAAGACAAAGAACTG-3’(SEQ ID NO19)，反向为5’-GTGAGAAAACCAGTGTCAAATCC-3’(SEQ ID NO20)。
Northern印迹分析
人多组织印迹(Clontech)与作为探针的32P-标记的PYPAF3 cDNA片段进行杂交。按上述通过RT-PCR制备cDNA。按照厂商的建议进行预杂交，杂交和洗涤。印迹用增感屏在-80℃下进行放射自显影7天。
免疫细胞化学染色
使用正向引物5’-CGCGGATCCCACTATGACATCGCCCCAGC-3’(SEQID NO63)和反向引物5’-CCGCTCGAGGCAAAAAAAGTCACAGCACGG-3’(SEQ ID NO64)通过RT-PCR扩增PYPAF3的完整编码区。PCR产物用BamH1和Xhol消化后，将它克隆进质粒载体pcDNA3.1-myc/His(Invitrogen)的合适克隆位点。COS7细胞用与FuGene6转染剂(Roche，Basel，Switzerland)混合的pcDNA3.1(+)-PYPAF3-myc/His转染。COS7-衍生的瞬时转染子用PBS(-)洗涤两次，用4％低聚甲醛溶液在4℃下固定15分钟，用含有0.1％Triton X-100的PBS(-)使其通透2.5分钟。细胞用含有3％BSA的PBS(-)覆盖60分钟以便在与第一抗反应前封闭非特异性抗体结合位点。PYPAF3蛋白质用小鼠抗人c-Myc 9E10抗体(Santa Cruz Biotechnolo gy，Santa Cruz，CA)作为第一抗且山羊抗小鼠FITC(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)作为第二抗进行检测。细胞核用4’，6’-二脒-2’-苯基吲哚二氢氯化物(Vector Laboratories，Burlingame，CA)复染。用Eclipse E800显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)获得荧光图像。
用小干扰RNA(siRNA)处理睾丸生殖细胞肿瘤细胞
通过RNA聚合酶III转录U6RNA基因产生在3′端含尿苷的短转录子。我们使用引物5′-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3′(SEQ ID NO65)，和5′-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3′(SEQ ID NO66)和人胎盘DNA作模板通过PCR扩增了含U6RNA启动子区的基因组片段。纯化该产物并使用TA克隆试剂盒按照厂商方案(Invitrogen)克隆进pCR2.1质粒载体。纯化含有U6RNA的BamHI，XhoI片段并克隆进pcDNA3.1(+)的核苷酸56和1257之间，使用引物5′-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3′(SEQ IDNO67)和5′-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3′(SEQ ID NO68)通过PCR扩增该片段。连接的DNA成为用引物5′-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACA-3′(SEQ ID NO69)和5′-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3′(SEQ ID NO70)进行PCR扩增的模板。用HindIII消化该产物并随后自我连接以产生psiU6BX载体质粒。抗PYPAF3的SiRNA表达载体(psiU6BX-PYPAF3)和对照质粒(psiU6BX-EGFP，psiU6BX-Luciferace)通过将表6的双链寡核苷酸克隆进psiU6BX载体的BbsI位点来制备。各siRNA表达载体用Fugene6(Roche)转染进内源性表达PYPAF3的睾丸生殖细胞肿瘤细胞系Tera-2中。通过Geneticin(Invitrogen)选择后，通过集落形成试验使用吉姆萨染色评估两周后的细胞增殖并通过细胞计数试剂盒-8(Dojindo，Kumamoto，日本)评估一周后的细胞增殖(39)。通过半定量RT-PCR鉴定PYPAF3 mRNA的敲除效应。
通过半定量RT-PCR证实睾丸精原细胞瘤中的PYPAF3表达
我们使用cDNA微阵列分析了13个患者睾丸精原细胞瘤中23,040个基因的基因表达谱(12)。在上调基因中，我们注意到PYPAF3在8个提供信息的病例中有7个过量表达，该基因的信号强度比睾丸精原细胞瘤患者中的临界值更高。另外，我们进行了半定量RT-PCR分析，然后证实了与正常人睾丸，心脏，肺，肝脏，肾，脑和骨髓相比在8例精原细胞瘤中有7例的PYPAF3表达提高(图2A)。
多组织Northern印迹分析和PYPAF3蛋白的亚细胞定位
使用PYPAF3 cDNA片段作为探针的Northern分析(见材料和方法)揭示了一个仅在睾丸中表达的大约3.3kb的转录子(图2B)。另外，为了研究PYPAF3蛋白质在哺乳动物细胞中的作用，我们构建了一个质粒来表达myc-标记的PYPAF3蛋白质(见材料和方法)。当该质粒DNA瞬时转染进COS-7细胞中时，标记的PYPAF3蛋白质存在于转染细胞的整个细胞质中(图3)。
设计成减少PYPAF3表达的小干扰RNA(siRNA)的生长抑制效应
为了评估PYPAF3的生长促进作用，我们借助于以哺乳动物载体为基础的RNA干扰(RNAi)技术敲除睾丸生殖细胞肿瘤细胞系Tera-2细胞中的内源性PYPAF3表达并检查对细胞生长的影响(参见材料和方法)。如图4a所示，导入psiU6BX-PYPAF3(Si 4)清楚地降低了Tera-2细胞系中PYPAF3转录子的表达而用对照质粒(psiU6BX-EGFP和psiU6BX-Luciferase siRNA表达载体)转染的细胞中观察到无影响。为了证实psiU6BX-PYPAF3降低该基因特异性生长，我们对相同的两个细胞系进行了集落形成试验；如图4b和4c所示，导入psiU6BX-PYPAF3(Si4)显著抑制Tera-2细胞的生长，与上述降低表达的结果一致，而导入Si3显著抑制Tera-2细胞的生长，尽管显示PYPAF3转录子水平的敲除几乎无减少。另外，MTT试验还表明使用psiU6BX-PYPAF3(Si3和Si4)抑制PYPAF3表达时显著抑制Tera-2细胞的生长(图4a，b)。每个结果都通过三个独立的实验进行了证实。
表6.PYPAF3的小干扰RNA的寡核苷酸序列
工业实用性
通过结合激光获取解剖和全基因组cDNA微阵列获得的对本文所述的TS的基因表达分析鉴定了作为癌症预防和治疗靶的特异性基因。根据这些差异表达基因的亚组表达，本发明提供了用于鉴定或检测TS的分子诊断标记。
本文所述的方法也用于鉴定其它的分子靶用于预防，诊断和治疗TS。本文报道的数据增加了对TS的全面了解，有利于开发新的诊断策略，并提供了鉴定用于治疗性药物和预防剂的分子靶的线索。该信息有助于更深入地了解睾丸肿瘤发生，并提供了开发用于诊断，治疗，和最终预防TS的新策略的指导。
本文引证的所有专利，专利申请，和出版物以其整体引用以供参考。另外，尽管详细地并以其具体实施方式
描述了本发明，但是对于本领域的技术人员而言显而易见的是可在其中进行各种改变和修饰而不偏离本发明的实质和范围。
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<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
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<400>1
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<213>人工
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<213>人工
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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列
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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列
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<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列
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cgcggatccc actatgacat cgccccagc29
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<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>64
ccgctcgagg caaaaaaagt cacagcacgg 30
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<213>人工
<220>
<223>用于PCR的人工合成的引物序列
<400>65
tggtagccaa gtgcaggtta ta 22
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<220>
<223>用于PCR的人工合成的引物序列
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于PCR的人工合成的引物序列
<400>67
tgcggatcca gagcagat tg tactgagagt 30
<210>68
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于PCR的人工合成的引物序列
<400>68
ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca29
<210>69
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于PCR的人工合成的引物序列
<400>69
tttaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaca 48
<210>70
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于PCR的人工合成的引物序列
<400>70
tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca 34
<210>71
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>71
caccgaggct gatggcaaga aacttcaaga gagtttcttg ccatcagcct c 51
<210>72
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>72
aaaagaggct gatggcaaga aactctcttg aagtttcttg ccatcagcct c 51
<210>73
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>73
caccgagatg aatctcacgg aatttcaaga gaattccgtg agattcatct c 51
<210>74
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>74
aaaagagatg aatctcacgg aattctcttg aaattccgtg agattcatct c 51
<210>75
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>75
caccgtagga cacttcttat tcgttcaaga gacgaataag aagtgtccta c 51
<210>76
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>76
aaaagtagga cacttcttat tcgtctcttg aacgaataag aagtgtccta c 51
<210>77
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>77
caccgtgatg cattgttcct tcattcaaga gatgaaggaa caatgcatca c 51
<210>78
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>78
aaaagtgatg cattgttcct tcatctcttg aatgaaggaa caatgcatca c 51
<210>79
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>79
caccgct tgg ctgtagatat ctcttcaaga gagagatatc tacagccaag c 51
<210>80
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>80
aaaagcttgg ctgtagatat ctctctcttg aagagatatc tacagccaag c 51
<210>81
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>81
caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c 51
<210>82
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>82
aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c 51
<210>83
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>83
caccgtgcgc tgctggtgcc aactctcttg aagttggcac cagcagcgca c 51
<210>84
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸序列
<400>84
aaaagtgcgc tgctggtgcc aacttcaaga gagttggcac cagcagcgca c 51
<210>85
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>siRNA的靶序列
<400>85
gtaggacact tcttattcg 19
<210>86
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>siRNA的靶序列
<400>86
gtgatgcatt gttccttca 19
权利要求
1.一种诊断受试者的TS或对形成TS易感的方法，包括测定患者生物学样品中TS-相关性基因的表达水平，其中与所述基因的正常对照水平相比所述的水平升高或降低表明所述受试者患有TS或者存在形成TS的风险。
2.权利要求1的方法，其中所述的TS-相关性基因选自TS 1-346，其中与正常对照水平相比所述的水平升高表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。
3.权利要求2的方法，其中所述的升高是比所述的正常对照水平高至少10％。
4.权利要求1的方法，其中所述的TS-相关性基因选自TS 347-939，其中与正常对照水平相比所述的水平降低表明该受试者患有TS或者存在形成TS的风险。
5.权利要求4的方法，其中所述的降低是比所述的正常对照水平低至少10％。
6.权利要求1的方法，其中所述的方法还包含测定多个TS-相关性基因的所述表达水平。
7.权利要求1的方法，其中通过选自如下的任一方法测定该表达水平
(a)检测TS-相关性基因的mRNA，
(b)检测TS-相关性基因编码的蛋白质，和
(c)检测TS-相关性基因编码的蛋白质的生物学活性。
8.权利要求1的方法，其中所述的表达水平通过检测TS-相关性基因探针与所述患者生物学样品的基因转录子的杂交来测定。
9.权利要求8的方法，其中所述的杂交步骤在DNA阵列上进行。
10.权利要求1的方法，其中所述的生物学样品包含上皮细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述的生物学样品包含TS细胞。
12.权利要求8的方法，其中所述的生物学样品包含来自TS的上皮细胞。
13.一种TS参照表达谱，它含有选自TS 1-939中的两个或多个基因的基因表达谱。
14.一种TS参照表达谱，它含有选自TS 1-346中的两个或多个基因的基因表达谱。
15.一种TS参照表达谱，它含有选自TS 347-939中的两个或多个基因的基因表达谱。
16.一种筛选用于治疗或预防TS的化合物的方法，所述的方法包括步骤
a)将试验化合物与TS 1-939编码的一种多肽接触；
b)检测该多肽与试验化合物之间的结合活性；和
c)选择与该多肽结合的化合物。
17.一种筛选用于治疗或预防TS的化合物的方法，所述的方法包括步骤
a)将候选化合物与表达一种或多种标记基因的细胞接触，其中一或多种标记基因选自TS 1-939；和
b)选择降低选自TS 1-346的一或多种标记基因的表达水平，或者升高选自TS 347-939的一或多种标记基因的表达水平的化合物。
18.一种筛选用于治疗或预防TS的化合物的方法，所述的方法包括步骤
a)将试验化合物与选自TS 1-939的基因编码的多肽接触；
b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；和
c)选择与不存在该试验化合物时检测的生物学活性相比抑制TS 1-346编码的多肽的生物学活性，或者与不存在该试验化合物时检测的生物学活性相比增强TS 347-939编码的多肽的生物学活性的化合物。
19.权利要求17的方法，其中所述的试验细胞包含睾丸精原细胞瘤细胞。
20.一种筛选用于治疗或预防TS的化合物的方法，所述的方法包括步骤
a)将候选化合物与细胞接触，该细胞导入了含有一或多个标记基因的转录调控区和在该转录调控区控制下表达的报道基因的载体，其中一或多个标记基因选自TS 1-939
b)测量所述报道基因的活性；和
c)选择与对照相比，当所述标记基因是选自TS 1-346的上调标记基因时降低所述报道基因的表达水平或者当所述标记基因是选自TS 347-939的下调标记基因时增强所述报道基因的表达水平的化合物。
21.试剂盒，包含与选自TS 1-939的两个或多个核酸序列结合的检测试剂。
22.阵列，包含与选自TS 1-939的两个或多个核酸序列结合的核酸。
23.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用反义组合物，所述的组合物包含与选自TS 1-346的编码序列互补的核苷酸序列。
24.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用siRNA组合物，其中所述的组合物降低选自TS 1-346的核酸序列的表达。
25.权利要求24的方法，其中所述的siRNA包含作为靶序列的核苷酸序列SEQ ID NO85或86。
26.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用药用有效量的与选自TS 1-346的任一基因编码的蛋白质结合的抗体或其片段。
27.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用一种疫苗，该疫苗含有由选自TS 1-346的一个核酸编码的多肽或所述多肽的免疫学活性片段，或者编码该多肽的多核苷酸。
28.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用增强TS347-939的表达或活性的化合物。
29.一种治疗或预防受试者TS的方法，所述方法包括施用按照权利要求16-20任一项的方法获得的化合物的步骤。
30.一种治疗或预防受试者TS的方法，包括给所述的受试者施用药用有效量的选自TS 347-939的多核苷酸或其编码的多肽。
31.一种用于治疗或预防TS的组合物，所述组合物包含药用有效量的抗选自TS 1-346的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA。
32.权利要求31的组合物，其中所述的小干扰RNA包含作为靶序列的核苷酸序列SEQ ID NO85或86。
33.一种用于治疗或预防TS的组合物，所述组合物包含药用有效量的与选自TS 1-346的任一基因编码的蛋白质结合的抗体或其片段。
34.一种用于治疗或预防TS的组合物，所述组合物包含活性成份和可药用载体，所述活性成分是药用有效量的用权利要求16-20任一项的方法选出的化合物。
35.一种小干扰RNA，其有义链包含核苷酸序列SEQ ID NO85或86。
全文摘要
本文描述了用于检测和诊断睾丸精原细胞瘤(TS)的客观方法。在一个实施方案中，该诊断方法包含测定在TS和正常细胞之间有区别的TS－相关性基因的表达水平。本发明还提供了筛选用于治疗TS的治疗剂的方法，治疗TS的方法和接种受试者抗TS的方法。
文档编号C12Q1/68GK1703522SQ0382537
公开日2005年11月30日 申请日期2003年9月12日 优先权日2002年9月30日
发明者中村佑辅, 片桐丰雅 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司, 国立大学法人东京大学