与人髓细胞白血病相关的基因和多肽的制作方法

专利名称：与人髓细胞白血病相关的基因和多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体地，涉及癌症研究领域。本发明尤其涉及参与细胞曾殖机制的新基因RHBDF1及其编码的多肽。本发明的基因和多肽可用于，例如诊断细胞增生性疾病，并作为研发抗所述疾病的药物的靶分子。
背景技术：
最近的研究证明，cDNA微阵列分析产生的基因表达分布图信息可提供的个体癌症病理性质比传统的组织病理学方法所能提供的更为详尽。这种信息的前景在于其改善治疗肿瘤疾病的临床策略以及发展新药物的可能性(Petricoin等，2002.Nat.基因t.，32Suppl.，474-479.)。微阵列技术的医学应用包括(i)发现对肿瘤形成(tumorigenesis)有贡献的基因，(ii)发现有用的诊断生物标志以及抗癌剂的新分子靶；和(iii)鉴定参与赋予化学敏感性的基因。实际上，根据我们对这些技术的理解，已经开始了多种有效的临床应用。靶向导致癌症发展的分子的新药物已被证实对于一些类型的癌症非常有效。例如，ABL-选择性酪氨酸激酶抑制物Imatinib methylate(Glivec；Novartis，Basel，Switzerland)显著改善慢性期的慢性髓细胞白血病(chronicmyeloid leukemia)(CML)的控制(Druker等，2001.N.Engl.J.Med.，344，1031-1037.)。
为上述目的，我们还应用了由23,040基因组成的人cDNA的微阵列来分析各种组织的肿瘤中的基因表达分布图(Okabe等，2001.Cancer Res.，61，2129-2137.；Kitahara等，2002.Neoplasia，4，295-303.；Lin等，2002.Onco基因，21，4120-4128.；Nagayama等，2002.Cancer Res.，62，5859-5866.；Kaneta等，2002Jpn.J.Cancer Res.，93，849-856.；Okutsu等，2002.Mol.Cancer Ther.，1，1035-1042.；Hasegawa等，2002.Cancer Res.，62，7012-7017.；Kikuchi等，2003Onco基因，22，2192-2205.)。通过这些表达分布图的分析，我们证实了鉴定的VANGL1通常在HCC中上调，并且用反义寡核苷酸抑制VALGL1表达可显著降低HCC细胞的生长并诱导凋亡的细胞死亡(Yagyu等，2002.Int.J.Oncol.，20，1173-1178.)。此外，利用全基因组cDNA微阵列，我们分离了参与肿瘤生成的数种重要基因诸如AF17(Lin等，2001 Cancer Res.61，6345-6349.)，AXUD1(Ishiguro等，2001 Onco基因，20，5062-5066.)，HELAD1(Ishiguro等，2002 Onco基因，21，6387-6394.)，ENC1(Fujita等，2001.CancerRes.，61，7722-7726.)，APCDD1(Takahashi等，2002.Cancer Res.，62，5651-5656.)，其表达与T细胞因子/淋巴样增强子-结合因子(lymphoidenhancer-binding factor)(Tcf-LEF)复合物的转录复合物的活性相关，并且在结肠癌细胞中明显升高。鉴定这些基因提供了意在靶向癌症的药物的新机会。
设计揭示致癌机理的研究已经促进了鉴定抗肿瘤药剂的分子靶。例如，法尼酰转移酶(farnexyltransferase)(FTI)的抑制剂已被有效用于治疗动物模型中的Ras依赖性肿瘤(He等，Cell 99335-45(1999))，所述抑制剂最初被发展用于抑制与Ras相关的生长信号通路，其中Ras的激活依赖翻译后法尼基化(posttranslational farnesylation)。已联合利用抗癌药及抗HER2单克隆抗体trastuzumab对人类进行了临床试验，用以拮抗原癌基因受体HER2/neu；并已获得乳癌患者的临床反应和总生存率的改善(Lin等，Cancer Res616345-9(2001))。选择性灭活bcr-abl融合蛋白质的酪氨酸激酶抑制剂(STI-571)已被发展用于治疗慢性髓细胞性白血病，在该疾病中，bcr-abl酪氨酸激酶的组成型活化(constitutive activation)在白细胞转化中发挥决定性作用。这类药剂被涉及为用来抑制特定基因产物的致癌活性(Fujita等，Cancer Res 617722-6(2001))。因此，在癌性细胞中通常被上调的基因产物可作为发展新抗癌剂的潜在靶点。
已证明CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)识别来自MHCI类分子呈递的肿瘤相关抗原(TAA)的表位肽，并溶解肿瘤细胞。自从发现MAGE家族作为TAA的第一个实例，用免疫学方法已发现了许多其它的TAA(Boon，Int JCancer 54177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，J ExpMed 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))。一些已经发现的TAA目前正处于作为免疫治疗靶点的临床开发阶段。迄今为止已经发现的TAA包括MAGE(van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991))，gp100(Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))，SART(Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998))和NY-ESO-1(Chen等，Proc Natl Acad SciUSA941914-8(1997))。另一方面，已证实的在肿瘤细胞中尤其过表达的基因产物可作为诱导细胞免疫反应的靶点而被识别。这种基因产物包括p53(Umano等，Brit J Cancer 841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka等，Brit JCancer 8494-9(2001))，CEA(Nukaya等，Int J Cancer 8092-7(1999))等等。
尽管在关于TAA的基础和临床研究中取得了重要的进展(Rosenbeg等，Nature Med4321-7(1998)；Mukherji等，Proc Natl Acad Sci USA 928078-82(1995)；Hu等，Cancer Res 562479-83(1996))，只有有限数量的候选TAA能治疗腺癌，包括结肠直肠癌。在癌细胞中大量的表达，同时其表达限制在癌细胞内的TAA是有希望的免疫治疗靶点的候选物(candidate)。此外，对诱导有效且特异性抗肿瘤免疫反应的新型TAA的鉴定被预期能够促进肽接种策略在多种类型癌中的临床使用(Boon and can der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，JExp Med 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994)；Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998)；Chen等，Proc Natl Acad Sci USA941914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 881442-5(1996)；Butterfield等，Cancer Res 593134-42(1999)；Vissers等，Cancer Res 595554-9(1999)；vander Burg等，J Immunol 1563308-14(1996)；Tanaka等，Cancer Res 574465-8(1997)；Fujie等，Int J Cancer 80169-72(1999)；Kikuchi等，Int J Cancer 81459-66(1999)；Oiso等，Int J Cancer 81387-94(1999))。
已有报道重复指出，来自具体健康供体的肽刺激的外周血单核细胞(PBMC)对该肽产生响应而产生显著水平的IFN-γ，但在铬-51释放试验中几乎不以HLA-A24或-A0201限制性图谱发挥针对肿瘤细胞的细胞毒作用(Kawano等，Cance Res 603550-8(2000)；Nishizaka等，Cancer Res 604830-7(2000)；Tamura等，Jpn J Cancer Res 92762-7(2001))。但是，HLA-A24和HLA-A0201均为一种在日本人以及高加索人中常见的HLA等位基因(Date等，Tissue Antigens 4793-101(1996)；Kondo等，J Immunol 1554307-12(1995)；Kubo等，J Immunol 1523913-24(1994)；Imanishi等，Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop andConference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams等，TissueAntigen 49129(1997))。因此，由这些HLA所呈递的癌抗原肽特别适用于治疗日本人和高加索人中的癌症。此外，已知在体外诱导低亲和力CTL通常是使用高浓度肽的结果，所述高浓度肽的使用在抗原呈递细胞(APC)上生成高水平特异性肽/MHC复合物，所述复合物将有效激活这些CTL(Alexander-Miller等，Proc Natl Acad Sci USA 934102-7(1996))。
发明概述为全面研究致癌的详细分子机制，我们试图利用cDNA微阵列(代表23,040个转录物)获得CML、急性髓细胞白血病(AML)和肺腺癌的癌细胞的全基因组表达分布图(Kaneta等，2002，Jpn.J.Cancer Res.，93，849-856.；Okutsu等，2002.Mol.Cancer Ther.，1，1035-1042.；Kikuchi等，2003，Onco基因，22，2192-2205.)。在这些癌症中上调的基因中，我们鉴定了RHBDF1基因(类似果蝇(Drosophila)Rhomboid-5)，其很可能属于Rhomboid家族。Rhomboid家族是最近分离的，并且其功能仅在有限数量的生物体及范围中显示。其中，果蝇Rhomboid-1已经被鉴定为膜内丝氨酸蛋白酶，其负责启动果蝇表皮生长因子受体(EGFR)信号(Lee等，2001.Cell，107，161-171.；Urban等，2001.Cell，107，173-182.)。在果蝇中该途径的活化通过三种跨膜EGFR配体前体Spitz，Keren和Gurken的选择性蛋白水解来调节。在其跨膜形式中，这些配体是无活性的，并限制在内质网(ER)。在信号为阳性的细胞中，Star(2型膜蛋白)，将这些配体从内质网输出到高尔基体，在那里它们通过rhomboid膜内丝氨酸蛋白酶切割。所述切割释出EGF配体结构域并随后分泌该结构域，作为其它细胞的活化信号。Rhomboid的蛋白酶活性位点位于膜双层中，且所述活化切割出现在配体跨膜结构域中。该蛋白水解切割系统与其它已知生长因子相反，其利用细胞表面的金属蛋白酶来释放活性生长因子结构域(Urban等，2002.Curr.Biol.，12，1507-1512.)。对于将近100种目前已知在进化中保守的rhomboid相关基因的功能知之甚少，但最近的研究表明来自病原细菌的Rhomboid参与群体感应(quorum-sensing)因子的产生(Rather等，1994.J.Bacteriol.，176，5140-5144.；Gallio等，2000.Curr.Biol.，10，R693-694.)，提示Rhomboid相关的细胞内信号机制在进化步骤中是保守的。
根据如上述最近对原核rhomboid的功能分析，可理解所有Rhomboid蛋白具有膜内丝氨酸蛋白酶功能。例如，果蝇Rhomboids1-4具有相似的蛋白水解活性并且所有膜粘连的(membrane-tethered)配体是Rhomboid蛋白酶的底物(Lee等，2001.Cell，107，161-171.；Urban等，2002.EMBO J.，21，4277-4286.)。然而，虽然RHBDF1含有高度保守的rhomboid结构域(图1band 1c)，催化蛋白水解的丝氨酸蛋白酶必要残基在该rhomboid结构域中不是保守的。因此，研究RHBDF1蛋白是否具有对膜-粘连的EGF受体配体诸如Spitz进行蛋白水解的能力有很大兴趣。需要其它对纯化的RHBDF1蛋白的直接生化分析来回答上述问题。
我们的结果提示活化的RHBDF1作为癌基因起作用，基于稳定RHBDF1表达增强细胞生长以及通过反义S-寡核苷酸或RNAi降低RHBDF1表达抑制CML和肺腺癌细胞的生长的事实。此外，免疫细胞化学染色提示RHBDF1与其它Rhomboid蛋白一样位于高尔基器。这些发现提示，RHBDF1可具有其自己的靶底物，所述底物介导RHBDF1-依赖的信号，尽管所述靶分子目前还不明确。如果是这样，鉴定RHBDF1底物可提供设计新抗癌药物的新线索。
因此，本发明提供了分离的基因RHBDF1，其作为癌症的候选诊断标志以及研制诊断新策略和有效抗癌试剂的有希望的潜在靶点。此外，本发明还提供了该基因编码的多肽，制备方法及其应用。更具体的，本发明提供了下述内容本申请提供了新的人类多肽RHBDF1，或其功能等价物，其促进细胞增殖并且在细胞增生性疾病中上调，所述细胞增生性疾病诸如CML，AML以及肺腺癌等。
一个优选实施方案中，RHBDF1多肽包括公知的855氨基酸蛋白质，其与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的Rhomboid-5具有约39％同一性。RHBDF1由SEQ ID NO15的开放阅读框编码。SMART程序预期RHBDF1蛋白质含有C末端部分的7个跨膜结构域组成的rhomboid结构域并提示其高尔基定位。RHBDF1多肽优选包括SEQ ID NO16的氨基酸序列。本发明还提供了由至少部分RHBDF1多核苷酸序列，或与SEQ ID NO15的序列至少40％，更优选至少50％互补的多核苷酸序列所编码的分离的蛋白质。
本发明还提供了分离的编码新的人类蛋白RHBDF1的多核苷酸，它在大多数CML中的表达相对于其在正常外周血细胞中的表达显著提高。该分离的RHBDF1基因包括SEQ ID NO15所示的多核苷酸序列。具体地，RHBDF1 cDNA包括含有2568个核苷酸的开放阅读框(SEQ ID NO15)的2958个核苷酸。本发明还包括与SEQ ID NO15所示的多核苷酸序列杂交并与其至少40％，更优选至少50％互补的多核苷酸，使得它们编码RHBDF1蛋白或其功能等价物。这种多核苷酸的实例为SEQ ID NO15的简并变体和等位基因突变体。
本文中，分离的基因指多核苷酸，其结构与任何天然存在的多核苷酸不同源，或与任何天然存在的基因组多核苷酸的片段不同。因此，该术语包括，例如(a)DNA，它具有生物体基因组中天然存在的天然基因组DNA分子的部分序列，其中所述DNA天然存在于所述生物体中；(b)插入载体或插入原核或真核生物基因组DNA中的多核苷酸，该插入方式使获得的分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不相同；(c)分离的分子，如cDNA、基因组片段、聚合酶链式反应(PCR)产生的片段或限制性酶切片段；和(d)重组核苷酸序列，其为杂合基因(即编码融合蛋白的基因)的一部分。
因此，一方面，本发明提供了编码本文所述多肽或其片段的分离的多核苷酸。优选，该分离的多核苷酸包括与SEQ ID NO15所示核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序列。更优选，该分离的核酸分子与SEQ ID NO15所示核苷酸序列的同一性为至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。当分离的多核苷酸比参照序列(例如SEQ ID NO15)的长度更长或者相同时，所述比较是以参照序列的全长进行的。当分离的多核苷酸比参照序列(例如SEQ ID NO15)短，所述比较是以参照序列的相同长度的片段进行的(排除同源性计算所需的任何环(loop))。
本发明还提供了一种制备蛋白质的方法，其通过用编码RHBDF1蛋白的多核苷酸序列转染或转化宿主细胞，并表达该多核苷酸序列来进行。另外，本发明还提供了含有编码RHBDF1蛋白的核苷酸序列的载体，含有编码RHBDF1蛋白的多核苷酸的宿主细胞。这种载体和宿主细胞可用于制备RHBDF1蛋白。
本申请还提供了识别RHBDF1蛋白的抗体。本发明的一部分还提供了RHBDF1基因的反义多核苷酸(例如，反义DNA)，核酶，和siRNA(小干扰RNA或短干扰RNA)。
本发明还提供了一种诊断细胞增生性疾病的方法，包括以下步骤确定样本(specimen)生物样品中的基因表达水平，并比较RHBDF1基因表达水平与正常样品中，样品中RHBDF1基因的高表达水平表示个体患有或将可能患有细胞增生性疾病诸如癌症。通过RHBDF1的表达水平诊断的疾病可为CML，AML或肺腺癌。
此外，本发明提供了一种筛选用于治疗细胞增生性疾病的化合物的方法。该方法包括将RHBDF1多肽与受试化合物接触，选出与RHBDF1多肽结合的受试化合物。
此外，本发明提供了一种筛选用于治疗细胞增生性疾病的化合物的方法，该方法包括将RHBDF1多肽与受试化合物接触，选出抑制RHBDF1多肽的表达水平或生物活性的受试化合物。
本发明还提供了一种治疗细胞增生性疾病诸如癌症的药物组合物。该药物组合物可以是，例如抗癌剂。该药物组合物可描述成SEQ ID NO15中显示并描述的RHBDF1多核苷酸序列的反义S-寡核苷酸或siRNA的至少一部分。适合的反义S-寡核苷酸具有SEQ ID NO11的序列。包括具有SEQID NO11的核苷酸序列的寡核苷酸在内的RHBDF1的反义S-寡核苷酸适用于CML，AML或肺腺癌。适宜的siRNA包括一组核苷酸，其具有SEQ IDNO13的核苷酸序列及其反义序列作为靶序列。RHBDF1的siRNA由SEQID NO13的核苷酸序列组成，并适用于治疗CML，AML或肺腺癌。
期望药物组合物的起效阶段能抑制瘤性细胞的生长。该药物组合物可施用于哺乳动物，包括人和家养哺乳动物。
本发明还提供了一种用本发明提供的药物组合物治疗细胞增生性疾病的方法。
另外，本发明还提供了一种用于治疗或预防癌的方法，所述方法包括给予RHBDF1多肽的步骤。预期通过给予RHBDF1多肽诱导抗肿瘤免疫性。因此，本发明还提供了一种诱导抗肿瘤免疫性的方法，包括给予RHBDF1多肽的步骤，和给予用于治疗或预防癌症的含RHBDF1多肽的药物组合物的步骤。
应当理解以上发明概述以及下述发明的详细描述都是本发明的优选实方案，并不限制本发明及其它替代实例。


图1利用cDNA微阵列分析的CML表达分布图。
(a)27CML患者中RHBDF1的Cy5/Cy3信号强度比。
(b)果蝇rhomboid结构域Rhomboid-1到Rhomboid-6与C6135(RHBDF1)的ClustalW-衍生的序列比对；7个跨膜结构域的预测的位置用黑线表示。
(c)来自Rhomboid家族的ClustalW序列比对的系统发生树。
图2RHBDF1基因的定性(a)各种人组织中C6135的Northern印迹。分子量显示在左侧。
(b)NIH3T3细胞中Myc-标记的C6135(RHBDF1)的亚细胞定位。
图3RHBDF1对NIH3T3细胞生长的影响(a)NIH3T3中外源转染的C6135的过表达。三种细胞系与载体-转染物相比稳定表达。甘油醛-3-磷酸酶脱氢酶(GAPDH)基因的表达作为内部对照。
(b)NIH3T3-C6135细胞和NIH3T3-载体细胞的生长速率。将所述细胞培养5天，然后通过MTT实验定量细胞生长。所述实验以一式三份进行实施。棒(Bar)表示SD。
图4设计为降低RHBDF1在K562细胞中表达的反义S-寡核苷酸和小干扰RNA(siRNA)的生长抑制效应。
(a)半定量RT-PCR测定的C6135在用反向(RHBDF1-R1)或反义(RHBDF1-AS1)S-寡核苷酸处理48小时的K562细胞中的表达。
(b)利用S-寡核苷酸(RHBDF1-R1和RHBDF1-AS1)的MTT实验在K562细胞中进行。将未经处理的组的值调节到1.0。该实验进行5次。棒表示SD。
(c)由半定量RT-PCR测定的psiH1BX-RHBDF1或psiH1BX-EGFPsiRNA处理的K562细胞中C6135的表达。
(d)利用siRNA(psiH1BX-RHBDF1和psiH1BX-EGFP)的MTT实验在K562细胞中进行。未处理的组的值调节到1.0。该实验进行5次。棒表示SD。
图5(a)AML患者和(b)肺腺癌患者中C6135表达的半定量RT-PCR分析。β-肌动蛋白基因的表达作为内部对照。PB，外周血，BM，骨髓。
图6反义S-寡核苷酸和siRNA在肺腺癌细胞中的生长抑制效应(a)，(c)和(e)，RHBDF1在siRNA表达载体转染的A549LC319，H522细胞系中的表达的半定量RT-PCR分析。
(b)，(d)和(f)，分别在肺癌细胞系A549 LC319，H522中进行的集落形成实验(colony formation assay)。
(g)MTT实验在肺癌细胞系LC319，A549和H522中进行。所述实验按一式三份实施。棒表示SD。
发明详述本文中“一个”指“至少一个”，除非另有特别说明。
本发明鉴定了新的人基因RHBDF1，其表达在CML中与正常外周血细胞中相比显著升高。RHBDF1 cDNA由2958个核苷酸组成，所述2958个核苷酸含有SEQ ID NO15中所示的2568个核苷酸的开放阅读框。所述开放阅读框编码推定的855-氨基酸蛋白质。预期的氨基酸序列显示与黑腹果蝇Rhomboid-5约39％的同一性。因此该蛋白质称RHBDF1。
同样，RHBDF1外源表达入细胞使得细胞生长增加，而用反义S-寡核苷酸或小干扰RNA(siRNA)抑制其表达导致癌性细胞生长被明显抑制。这些发现提示RHBDF1使得癌细胞具有致癌活性，且抑制这些蛋白的活性可能是治疗癌症的有希望的策略。
本发明包括新的人基因RHBDF1，包括SEQ ID NO15的多核苷酸序列及其简并物或其变体，所述序列及其简并物或其变体均编码RHBDF1蛋白，包括SEQ ID NO16的氨基酸序列或其功能等同物。RHBDF1功能性等同多肽的实例包括例如，与人RHBDF1蛋白对应的其它生物体的同源蛋白以及人RHBDF1蛋白的突变体。
本发明中，术语“功能等价(functionally equivalent)”指受试多肽与RHBDF1蛋白一样，具有促进细胞增殖以及赋予癌细胞致癌活性的活性。受试多肽是否具有细胞增殖活性可如下所述进行判断将编码受试多肽的DNA导入表达相应多肽的宿主细胞，检测对细胞增殖的促进作用或集落形成活性的增加。这种细胞包括，例如，NIH3T3细胞，K562细胞，A549细胞，H522细胞和LC319细胞。
制备指定蛋白的功能等价多肽的方法是本领域技术人员已知的，包括在蛋白中导入突变的已知方法。例如，本领域技术人员可通过定点诱变在这些蛋白质之一的氨基酸序列中导入合适的突变，来制备人类RHBDF1蛋白的功能等价多肽(Hashimoto-Gotoh等，Gene 152271-5(1995)；Zoller andSmith，Methods Enzymol 100468-500(1983)；Kramer等，Nucleic Acids Res.129441-9456(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol 154350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82488-92(1985)；Kunkel，Methods Enzymol852763-6(1988))。氨基酸突变也会自然发生。本发明的多肽包括具有人类RHBDF1蛋白氨基酸序列的蛋白，其中一或多个氨基酸发生突变，产生的突变多肽与人类RHBDF1蛋白功能等价。这种突变体中突变氨基酸的数量通常是10个或更少，优选6个或更少，最优选3个或更少。
已知突变或修饰的蛋白保持原来的生物活性，所述蛋白为具有通过对具体氨基酸序列的一或多个氨基酸残基进行取代，缺失，插入和/或添加修饰而成的氨基酸序列的蛋白(Mark等，Proc Natl Acad Sci USA 815662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 106487-500(1982)；Dalbadie-McFarland等，Proc Natl Acad Sci USA 796409-13(1982))。
被突变的氨基酸残基优选突变为不同的氨基酸，其氨基酸侧链的性质是保守的(即保守氨基酸取代过程)。氨基酸侧链的性质例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，以及侧链带有下述功能基团或具有共有性质脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含有羟基的侧链(S，T，Y)；含有硫原子的侧链(C，M)；含有羧酸和酰胺的侧链(D，N，E，Q)；含碱基的侧链(R，K，H)；含芳香基的侧链(H，F，Y，W)。注意，括号中的字母是指氨基酸的单字母密码。
在人RHBDF1蛋白的氨基酸序列中添加了一或多个氨基酸残基的多肽的例子是包含人RHBDF1蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人RHBDF1蛋白与其它肽或蛋白的融合体，并且包括在本发明的范围。可用本领域技术人员熟知的技术制备融合蛋白，如将编码本发明人RHBDF1蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白的DNA连接，使编码框匹配，将该融合DNA插入表达载体并在宿主细胞中表达。对于与本发明蛋白融合的肽或蛋白没有限制。
可用作与本发明蛋白进行融合的已知的肽包括，例如FLAG(Hopp等，Biotechnology 61204-10(1988))，含6个His(组氨酸)残基的6×His，10×His，流感血凝素(Influenza agglutinin)(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18HIV片段，T7-标记，HSV-标记，E-标记，SV40抗原片段，lck标记，α-微管蛋白片段，B-标记，蛋白C片段及类似物。可与本发明蛋白融合的蛋白包括例如GST(谷胱甘肽-S-转移酶)，流感血凝素(HA)，免疫球蛋白恒定区，β-半乳糖苷酶，MBP(麦芽糖结合蛋白)等。
融合蛋白可如下制备将编码上述融合肽或蛋白的可购得DNA，与编码本发明多肽的DNA融合，并表达制备的融合DNA。
另一个本领域中已知的分离功能等价多肽的方法例如，使用杂交技术的方法(Sambrook等，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold Spring HarborLab.Press(1989))。本领域技术人员可以很容易的分离与编码人RHBDF1蛋白的全部或部分DNA序列(即SEQ ID NO15)高度同源的DNA，并从分离的DNA中分离人RHBDF1蛋白的功能等价多肽。本发明的多肽包括与编码人RHBDF1蛋白的DNA序列的全部或部分杂交的DNA编码的多肽，并且它们与人RHBDF1蛋白的功能等价。这些多肽包括对应于衍生自人蛋白的哺乳动物同系物(例如，猴，鼠，兔和牛基因编码的多肽)。当从动物分离与编码人RHBDF1蛋白DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用来自气管，甲状腺，脊髓，前列腺，骨骼肌或胎盘的组织。
本领域技术人员可以常规选择分离编码人RHBDF1蛋白功能等价多肽的DNA的杂交条件。例如，杂交如下进行用“Rapid-hyb缓冲液”在68℃预杂交30min或更长，加入标记探针，68℃保温1h或更长。随后的洗涤步骤可在例如低严谨条件进行。低严谨条件是，例如42℃，2×SSC，0.1％SDS，或优选50℃，2×SSC，0.1％SDS。更优选，采用高严谨条件。高严谨条件是，例如室温、于2×SSC，0.01％SDS中洗涤3次每次20min，随后37℃，于1×SSC，0.1％SDS中洗涤3次每次20min，然后50℃，于1×SSC，0.1％SDS洗涤2次每次20min。虽然一些因素如温度和盐浓度会影响杂交的严谨性，本领域技术人员可以适当的选择这些因素以获得必要的严谨度。
可利用基因扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)代替杂交，来分离编码人RHBDF1蛋白功能等价多肽的DNA，使用根据编码该蛋白的DNA的序列信息(SEQ ID NO15)合成的引物。
通过上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的人RHBDF1蛋白的功能等价多肽通常与人RHBDF1蛋白的氨基酸序列高度同源。“高度同源”通常指40％同源性或更高，优选60％或更高，更优选80％或更高，甚至优选95％或更高。多肽的同源性可用“Wilbur and Lipman，Proc Natl AcadSci USA 80726-30(1983)”的算法确定。
本发明多肽的氨基酸序列，分子量，等电点，糖链的存在或缺失，或形态可能发生变异，这取决于制备该多肽所使用的细胞或宿主或使用的纯化方法。不过，只要它的功能等同于本发明的人RHBDF1蛋白，它就属于本发明的范围。
可用本领域技术人员熟知的方法以重组蛋白或天然蛋白的形式制备本发明的多肽。重组蛋白如下制备将编码本发明多肽的DNA(例如，含SEQID NO15的核苷酸序列的DNA)插入合适的表达载体，将该载体导入合适的宿主细胞，获得提取物，使用其上固定有抗本发明蛋白抗体的柱或联合使用多个上述柱，对该提取物进行层析从而纯化所述多肽，所述层析如离子交换层析，反相层析，凝胶过滤或亲和层析。
当本发明多肽在宿主细胞(例如动物细胞和大肠杆菌)中被表达为与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白融合的融合蛋白或附加了多个组氨酸的重组蛋白时，该表达的重组蛋白可用谷胱甘肽柱或镍柱纯化。或者，当本发明的多肽被表达为c-myc、多组氨酸或FLAG标记的蛋白时，其可分别使用抗c-myc、His或FLAG抗体检测和纯化。
纯化该融合蛋白后，还可能通过按需切除凝血酶或因子Xa除去与受试多肽不同的区域。
分离天然蛋白可采用本领域技术人员已知的方法，例如与亲和柱接触，其中与下述RHBDF1蛋白结合的抗体与表达本发明多肽的组织或细胞的提取物相结合。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明还包括本发明多肽的部分肽。该部分肽含有本发明多肽的特异性氨基酸序列，并由至少7个氨基酸，优选8个或更多氨基酸，更优选9个或更多氨基酸组成。所述部分肽可用于，例如制备抗本发明多肽的抗体，筛选与本发明多肽结合的化合物，筛选本发明多肽的促进剂(accelerator)或抑制剂。
可通过基因工程方法，已知的肽合成方法，或用合适的肽酶消化本发明多肽来制备本发明的部分肽。对于肽合成，可使用例如固相肽合成或液相肽合成。
本发明进一步提供了编码本发明多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可用于在体内或体外制备上述本发明的多肽，或者应用于疾病的基因治疗，所述疾病归因于编码本发明多肽的基因的遗传异常。可利用本发明多核苷酸的任意一种形式，只要它编码本发明的多肽，所述多核苷酸的形式包括mRNA，RNA，cDNA，基因组DNA，化学合成的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括含有给定核苷酸序列的DNA及其简并序列，只要形成的DNA编码本发明的多肽。
可用本领域技术人员已知的方法制备本发明的多核苷酸。例如，本发明的多核苷酸可如下制备从表达本法明多肽的细胞中制备cDNA文库，用本发明DNA的部分序列(如SEQ ID NO15)作为探针进行杂交。cDNA文库可依照Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)描述的方法制备；或者也可以使用可购得的cDNA文库。cDNA文库还可如下制备从表达本发明多肽的细胞中提取RNA，根据本发明DNA序列(如SEQ ID NO15)合成寡DNA，以该寡DNA为引物进行PCR，扩增编码本发明蛋白的cDNA。
另外，通过测序获得的cDNA的核苷酸序列，可以常规的确定cDNA编码的翻译区，也就可以容易地获得本发明多肽的氨基酸序列。而且，用获得的cDNA或其部分作为探针筛选基因组DNA文库，可以分离基因组DNA。
更具体地，可以首先从表达本发明目的多肽的细胞，组织或器官(气管，甲状腺，脊髓，前列腺，骨骼肌或胎盘)中制备mRNA。用已知的方法分离mRNA；例如用胍超速离心(guanidine ultracentrifugation)(Chirgwin等，Biochemistry 185294-9(1979))或AGPC方法(Chomczynski and Sacchi，AnalBiochem 162156-9(1987))制备总RNA。另外，用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)从总RNA中纯化mRNA。或者，用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接纯化mRNA。
利用逆转录酶从获得的mRNA合成cDNA。cDNA的合成可使用可购得的试剂盒，如AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(Seikagaku Kogyo)。或者，用5’-RACE方法合成并扩增cDNA(Frohman等，Proc Natl Acad SciUSA 858998-9002(1988)；Belyavsky等，Nucleic Acids Res 172919-32(1989))，其中使用本文所述的引物，5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)以及聚合酶链式反应(PCR)。
从PCR产物制备所需的DNA片段并与载体DNA连接。重组载体用于转化大肠杆菌等，并从选出的集落中制备所需的重组载体。通过常规方法验证所需的DNA的核苷酸序列，例如双脱氧核苷酸链终止法(dideoxynucleotide chain termination)。
考虑到用于表达的宿主细胞中的密码子利用频率，设计本发明多核苷酸的核苷酸序列，使其更有效地表达(Grantham等，Nucleic Acids Res 943-74(1981))。可用商品化试剂盒或常规方法改变本发明多核苷酸的序列。例如，可用限制酶消化，插入合成的寡核苷酸或合适的多核苷酸片段，增加接头，或插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA，TGA或标记)来改变所述序列。
具体地，本发明的多核苷酸包括含有SEQ ID NO15的核苷酸序列的DNA。
另外，本发明提供了多核苷酸，其在严谨条件下与具有SEQ ID NO15所示核苷酸序列的多核苷酸杂交，并编码上述与本发明RHBDF1蛋白功能等价的多肽。本领域技术人员可以适当选择严谨条件。例如，可采用低严谨条件。更优选，可采用高严谨条件。这些条件与前文所述条件相同。上述用于杂交的DNA优选cDNA或染色体DNA。
本发明还提供了插入了本发明多核苷酸的载体。本发明的载体用于在宿主细胞中保留本发明的多核苷酸具体是DNA、用于表达本发明的多肽，或用于给予本发明的多核苷酸进行基因治疗。
当以大肠杆菌作为宿主细胞并在大肠杆菌中(例如JM109，DH5α，HB 101或XL1Blue)大量的扩增和生产载体时，该载体应当具有在大肠杆菌中扩增的“复制起始点ori”，以及用于筛选转化的大肠杆菌的标记基因(例如，通过例如氨卡青霉素，四环素，卡那霉素，氯霉素等药物进行筛选的抗药基因)。例如，可使用M13系列载体，pUC系列载体，pBR322，pBluescript，pCR-Script等等。另外，也可使用pGEM-T，pDIRECT和pT7来进行亚克隆及提取cDNA和上述载体。当利用载体制备本发明的蛋白时，表达载体特别有用。例如，在大肠杆菌中表达的表达载体应当具备上述性质以便在大肠杆菌中扩增。当以大肠杆菌如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue作为宿主细胞时，载体应当具有启动子，如lacZ启动子(Ward等，Nature 341544-6(1989)；FASEB J62422-7(1992))，araB启动子(Better等，Science2401041-3(1988))，T7启动子等，它们能在大肠杆菌中有效的表达所需的基因。在这方面，可使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)，“QIAexpress system”(Qiagen)，pEGFP和pET(在这种情况中，宿主优选表达T7RNA聚合酶的BL21)代替上述载体。另外，该载体还可包含多肽分泌的信号肽序列。指导多肽分泌到大肠杆菌周质的信号肽序列的实例是pelB信号序列(Lei等，JBacteriol 1694379(1987))。将所述载体导入靶宿主细胞的方法包括，例如氯化钙法和电穿孔法。
除了大肠杆菌，还可利用例如哺乳动物表达载体(如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)5322(1990))，pEF，pCDM8)，昆虫细胞表达载体(如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)，pBacPAK8)，植物表达载体(如pMH1，pMH2)，动物病毒表达载体(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，逆转录病毒表达载体(如pZIpneo)，酵母表达载体(如“毕赤酵母(Pichia)表达试剂盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)表达载体(如pPL608，pKTH50)制备本发明的多肽。
为了在动物细胞如CHO，COS或NIH3T3细胞中表达所述载体，该载体应当具有在这些细胞中表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等，Nature277108(1979))，MMLV-LTR启动子，EF1α启动子(Mizushima等，Nucleic Acids Res 185322(1990))，CMV启动子等，并优选具有用于筛选转化体的标记基因(如，经药物(例如新霉素，G418)选出的抗药基因)。已知具备这些性质的载体包括，例如pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。
本发明还提供了在细胞中稳定表达基因同时扩增该基因拷贝数的方法。例如，将含有互补DHFR基因的载体(如pCHOI)导入核酸合成途径被缺失的CHO细胞，然后由甲氨蝶呤(MTX)进行扩增。另外，当瞬时表达基因时，可采用下述方法将含有SV40复制起始点的载体(pcD等)转化入COS细胞，该细胞染色体包含SV40T抗原表达基因。
如上所述获得的本发明多肽可以从宿主细胞内或外(如培养基)分离，并纯化为基本纯的均质的多肽。本文给定多肽所用的术语“基本纯”是指该多肽基本上与其它生物大分子分离。基本纯的多肽指干重至少75％(如至少80，85，95，或99％)是纯的。用合适的标准方法测定纯度，所述方法例如柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。多肽分离纯化的方法并不限于任何具体方法；事实上，可采用任何标准方法。
例如，可以适当选择并联合使用柱层析，过滤，超滤，盐沉淀，溶剂沉淀，溶剂提取，蒸馏，免疫沉淀，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电点电泳，透析和重结晶以分离纯化所述多肽。
层析的实例包括，例如亲和层析，离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤，反相层析，吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1996))。这些层析法可以液相层析如HPLC和FPLC进行。因此，本发明提供了上述方法制备的高纯度的多肽。
在纯化之前或之后用合适的蛋白修饰酶处理本发明的多肽，可任选修饰或部分缺失所述多肽。有用的蛋白修饰酶包括、但不限于胰蛋白酶，糜蛋白酶，赖氨酰内肽酶，蛋白激酶，糖苷酶等等。
本发明提供了与本发明多肽结合的抗体。本发明的抗体可以任意形式如单克隆抗体或多克隆抗体进行使用，并且包括用本发明多肽免疫动物如兔获得的抗血清，所有类型的多克隆和单克隆抗体，人抗体以及通过基因重组制备的人源化抗体。
以本发明多肽作为抗原可以从任何动物种系获得抗体，但优选从哺乳动物诸如人、小鼠或大鼠，更优选从人获得抗体。来自人的多肽可从本文所述的核苷酸或氨基酸序列获得。
如本发明所述，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白或蛋白的部分肽。部分肽包括，例如本发明多肽的氨基端(N)或羧基端(C)片段。将编码本发明多肽或其片段的基因插入到已知的表达载体，然后用该载体转化本文所述的宿主细胞。用任意标准方法从宿主细胞内或外回收所需多肽或其片段，并随后将所述多肽或其片段用作抗原。或者，以表达该多肽的整个细胞或其裂解物或化学合成多肽作为抗原。
用所述抗原免疫任意哺乳动物，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常使用啮齿目(Rodentia)，兔类(Lagomorpha)或灵长类(Primates)的动物。啮齿目动物包括，如小鼠，大鼠和仓鼠。兔类动物包括兔。灵长类动物包括，例如狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴(old world monkey))如Macaca fascicularis，恒河猴(rhesus monkey)，狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。
用抗原免疫动物的方法是本领域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫动物的标准方法。更具体地，可以用适量的磷酸盐缓冲液(PBS)，生理盐水等稀释和悬浮抗原。如果需要，将抗原悬液与适量的标准佐剂如福氏(Freund’s)完全佐剂混合，形成乳液，然后给予哺乳动物。优选，将与适量福氏完全佐剂混合的抗原每4至21天给药数次。也可使用合适的载体进行免疫。上所述免疫后，用标准方法检验血清中所需的抗体数量的增加。
本发明多肽的多克隆抗体可如下制备从经免疫的动物(该动物经检测其血清中所需的抗体增加)收集血液，用任意常规的方法从所述血液中分离血清。多克隆抗体包括含多克隆抗体的血清且可从所述血清中分离含有该多克隆抗体的级分。利用例如与本发明多肽偶联的亲和层析柱，从仅识别本发明多肽的级分制备免疫球蛋白G或M，随后进一步用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。
为制备单克隆抗体，从用所述抗原免疫、并且如上述经检测血清中所需抗体水平增高的动物中收集免疫细胞，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选获自脾。其它待与上述免疫细胞融合的优选亲本细胞包括，例如哺乳动物骨髓瘤细胞，更优选具备获得的特性以便用药物筛选融合细胞的骨髓瘤细胞。
根据已知的方法。如Milstein等(Galfre and Milstein，Methods Enzymol 733-46(1981))的方法将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞融合。
通过在标准选择性培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培养基)等中进行培养来选择细胞融合所得的杂交瘤。通常，细胞培养物在HAT培养基中连续培养数天至数周，该时间要足以使除了所需的杂交瘤细胞之外的所有其它细胞(非融合的细胞)死亡。然后，以标准有限稀释法筛选并克隆生产所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述以抗原免疫非人动物制备杂交瘤的方法外，人淋巴细胞诸如EB病毒感染的淋巴细胞也可在体外用多肽，表达多肽的细胞或其裂解物进行免疫。然后，被免疫的淋巴细胞与能模糊分裂的(indefinite dividing)、人来源的骨髓瘤细胞诸如U266融合，以获得产生与所述多肽结合的所需人抗体的杂交瘤细胞(未审查的日本专利申请(Unexamined Published JapanesePatent Application No.)(JP-A)Sho 63-17688)。
获得的杂交瘤细胞随后移植到小鼠的腹腔，并抽提腹水。获得的单克隆抗体可通过，例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联了本发明多肽的亲和柱进行纯化。本发明的抗体不仅可以用于纯化和检测本发明的多肽，还可以作为本发明多肽的候选激动剂和拮抗剂。另外，该抗体可应用于本发明多肽相关疾病的抗体治疗。当将获得的抗体给予人体(抗体治疗)时，优选人抗体或人源化抗体以降低免疫原性。
例如，用选自多肽，表达多肽的细胞或其裂解物的抗原来免疫具有人抗体基因库的转基因动物。然后从该动物收集产生抗体的细胞，将其与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤，从该杂交瘤制备抗所述多肽的人抗体(参见WO92-03918，WO93-2227，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。
或者，用癌基因使产生抗体的免疫细胞如经免疫的淋巴细胞永生化，用于制备单克隆抗体。
如此获得的单克隆抗体也可以利用基因工程技术通过重组方法制备(参见，如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可从免疫细胞，如产生抗体的杂交瘤或经免疫的淋巴细胞来克隆编码该抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并转入宿主细胞制备重组抗体。本发明还提供了如上所述制备的重组抗体。
另外，本发明的抗体可以是抗体片段或修饰的抗体，只要它结合一或多种本发明的多肽。例如，所述抗体片段可以是Fab，F(ab’)2，Fv或单链Fv(scFv)，其中H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接(Huston等，Proc NatlAcad Sci USA 855879-83(1988))。更具体地，抗体片段可用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体而生成。或者可构建编码该抗体片段的基因，将其插入合适的表达载体，并在适合的宿主细胞中表达(参见，如Co等，JImmunol 1522968-76(1994)；Better and Horwitz，Methods Enzymol 178476-96(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121652-63(1986)；Rousseaux等，MethodsEnzymol 121663-9(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol 9132-7(1991))。
抗体可通过与各种分子，如聚乙二醇(PEG)连接进行修饰。本发明提供了这种修饰的抗体。也可通过化学修饰抗体而获得修饰的抗体。这些修饰方法是本领域常规的。
或者，本发明的抗体可作为嵌合抗体而获得，所述嵌合抗体可变区来自非人抗体而恒定区来自人抗体；或者作为人源化抗体而获得，所述人源化抗体包括来自非人抗体的互补决定区(CDR)，来自人抗体的框架区(FR)以及恒定区。通过利用已知技术制备这种抗体。
如上所述获得的抗体可以纯化成均质的。例如，以用于普通蛋白的分离纯化方法进行抗体的分离纯化。例如，抗体可通过适当地选择并联合使用柱层析来分离及纯化，所述层析诸如亲和层析，过滤，超滤，盐析，透析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及等电聚焦(AntibodiesA Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))等，但不限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可用作亲和柱。可利用的示例性蛋白A柱包括，如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了亲和层析，层析的实例还包括，如离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤，反相层析，吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1996))。层析过程可以通过液相层析诸如HPLC和FPLC等实施。
例如，通过测定吸光度，酶联免疫吸附分析(ELISA)，酶免疫分析(EIA)，放射免疫分析(RIA)和/或免疫荧光来测定本发明抗体的抗原结合活性。ELISA中，本发明的抗体固定在平板上，本发明的多肽施加于平板上，然后施加含有所需抗体的样品(诸如产生抗体的细胞的培养上清或纯化的抗体)。接着施加识别第一抗体并用酶诸如碱性磷酸酶标记的第二抗体，温育所述平板。洗涤后，向平板添加酶底物如磷酸对硝基苯酯，测定吸光度以评价样品的抗原结合活性。多肽片段，如C末端或N末端片段也可用作抗原来评价抗体的结合活性。根据本发明，可用BIAcore(Pharmacia)评价抗体的活性。
上述方法可以检测或测定本发明的多肽，这是通过将本发明的抗体暴露于假设含有本发明多肽的样品，检测或测定抗体和多肽形成的免疫复合物。
因为本发明所述的检测或测量多肽的方法可以特异性的检测或测量多肽，所以该方法能用于各种使用了多肽的实验。
本发明还提供了与编码人RHBDF1蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO15)或其互补链互补且包括至少15个核苷酸的多核苷酸。本发明的多核苷酸优选与编码本发明多肽的DNA特异性杂交的多核苷酸。本文术语“特异性杂交”指在通常的杂交条件、优选严谨杂交条件下，与编码其它蛋白的DNA不发生明显的交叉杂交。这种多核苷酸包括探针，引物，核苷酸及核苷酸衍生物(例如，反义寡核苷酸和核酶)，它们与编码本发明多肽的DNA或其互补链特异性杂交。而且，这种多核苷酸可用于制备DNA阵列。
本发明包括与SEQ ID NO15的核苷酸序列的任意位点杂交的反义寡核苷酸。该反义寡核苷酸优选针对SEQ ID NO15的核苷酸序列的至少15个连续的核苷酸。在上述至少15个连续的核苷酸中包含起始密码子的上述反义寡核苷酸是更优选的。更具体地，所述反义寡核苷酸包括含有SEQ IDNO11的核苷酸序列的寡核苷酸，其可抑制RHBDF1的表达。
反义寡核苷酸的衍生物或修饰的产物也可作为反义寡核苷酸。这种修饰的产物包括低级烷基膦酸盐/酯修饰，如甲基膦酸盐型或乙基膦酸盐型，硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰以及氨基磷酸盐(phosphoroamidate)修饰。
本文所用的术语“反义寡核苷酸”不仅指其中对应于组成DNA或mRNA具体区域的核苷酸完全互补的寡核苷酸，还指包含一或多种错配核苷酸的寡核苷酸，条件是所述DNA或mRNA以及反义寡核苷酸能特异性的与SEQ ID NO15的核苷酸序列杂交。
这种多核苷酸包括在“至少15个连续核苷酸序列区域”中有至少70％同或70％以上、优选80％或80％以上、更优选90％或90％以上、甚至最优选95％或95％以上同源性的多核苷酸。本文所述的运算规则可用于确定同源性。本领域中已知的运算规则也可用于确定同源性。这种反义多核苷酸可作为探针以分离或检测编码本发明多肽的DNA、或作为引物用于扩增。
本发明反义寡核苷酸的衍生物通过与编码多肽的DNA或mRNA结合作用于产生本发明多肽的细胞，抑制其转录或翻译，促进所述mRNA的降解，抑制本发明多肽的表达，因此抑制所述多肽的功能。
本发明的反义寡核苷酸衍生物可通过与适宜的基质(base)物质混合而制成外用制剂，如涂敷膏药或敷剂，所述基质物质对于该衍生物而言是无活性的。
同样，如果需要，通过添加辅料，非离子试剂，助溶剂，稳定剂，防腐剂，止痛药等，所述衍生物可制成片剂，粉剂，颗粒剂，胶囊，脂质胶囊，注射剂，溶液剂，滴鼻剂以及冻干剂。依照常规方法制备这些制剂。
所述反义寡核苷酸衍生物可通过直接施用在患病部位或通过将注射入血管使其到达患病部位而给药患者。还可以使用封固剂以增加耐久性和膜通透性。封固剂的实例包括脂质体，聚-L-赖氨酸，脂质、胆固醇，脂转染剂或其衍生物。
根据患者的情况适当调整本发明反义寡核苷酸衍生物的剂量并以所需用量使用。例如，给药剂量范围为0.1至100mg/kg，优选0.1至50mg/kg。
本发明还包括小干扰RNA(siRNA)，其含有SEQ ID NO15核苷酸序列的有义核酸链和反义核酸链的组合。更具体地，这种抑制RHBDF1表达的siRNA包括其有义链含有SEQ ID NO13的核苷酸序列的siRNA。
术语“siRNA”指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。用于将siRNA导入宿主细胞的标准技术包括以DNA作为模板进行RNA转录的方法。所述siRNA包含编码人RHBDF1蛋白(SEQ ID NO15)的多核苷酸的有义核酸序列和反义核酸序列。所述siRNA被构建成单个转录产物具有来自靶基因例如发夹结构的的有义序列和互补反义序列。
所述方法用于改变细胞的基因表达，即上调RHBDF1多肽的表达，例如作为细胞恶性转化的结果。siRNA与靶细胞中RHBDF1转录物的结合导致该细胞的蛋白生成减少。所述寡核苷酸的长度是至少10个核苷酸，也可能与天然转录物一样长。优选，所述寡核苷酸有19-25个核苷酸。更优选，所述寡核苷酸的长度少于75，50，25个核苷酸。
用Ambion网站(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)的siRNA设计程序设计siRNA的核苷酸序列。根据下述方案由计算机程序选择siRNA的核苷酸序列siRNA靶位点的选择1.从目标转录物的AUG起始密码开始，向下游扫描寻找AA双核苷酸序列。记录每个AA的出现，临近3′的19个核苷酸作为可能的siRNA靶位点。Tuschl等反对针对5′和3′非翻译区(UTR)和邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为上述区域可能较为富含调节性蛋白质结合位点。UTR结合蛋白质和/或翻译起始复合物可干扰与siRNA内切核酸酶复合物的结合的。
2.将所述潜在靶位与人类基因组数据库进行比较，不考虑与其它编码序列显著同源的任何靶序列。利用BLAST进行同源搜索，BLAST可在NCBI服务器找到，网址是www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion，优选沿该基因选择数个靶序列进行评估。
本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明多肽的表达，因此可抑制本发明多肽的生物活性。同样，含有本发明反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂可用于抑制本发明多肽的生物活性。因此，含有本发明反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗细胞增生性疾病，如癌症。
本发明还提供一种利用本发明多肽的表达水平作为诊断标志，诊断细胞增生性疾病的方法。
该诊断方法包括下述步骤(a)检测本发明RHBDF1基因的表达水平；和(b)将表达水平的提高与细胞增生性疾病，如癌症相联系。
具体样品中RHBDF1基因表达水平可以通过定量RHBDF1基因相应的mRNA或RHBDF1基因编码的蛋白来估计。mRNA的定量方法是本领域技术人员已知的。例如，通过Northern印迹或RT-PCR估计RHBDF1基因相应的mRNA的水平。因为RHBDF1基因的全长核苷酸序列如SEQ ID NO15所示，任何本领域技术人员都能够设计用于定量RHBDF1基因的探针或引物的核苷酸序列。
也可以根据该基因编码的蛋白的活性或量来分析RHBDF1基因的表达水平。测定RHBDF1蛋白量的方法如下。例如，以免疫测定法检测生物材料中的蛋白质。任何生物材料都可用于进行蛋白或其活性的测定。例如，可分析血液样品来评估血清标记所编码的蛋白。另一方面，应根据要分析的蛋白的活性选择合适的方法来测定RHBDF1基因编码的蛋白的活性。
评估样品(受试样品)中RHBDF1基因的表达水平，并将其与正常样品中该基因的表达水平进行比较。当这种比较显示靶基因的表达水平高于正常样品中的所述表达水平时，则判断该受试者患细胞增生性疾病。可以在同一时间确定来自正常样品和受试样品中RHBDF1基因的表达水平。或者可通过统计方法确定表达水平的正常范围，所述方法基于分析先前从对照组收集的样品的基因表达水平所得的结果。对检测受试样品所得结果与正常范围进行比较，如果该结果没有落入正常范围，则判断该受试者患有细胞增生性疾病。本发明中，优选待诊断的细胞增生性疾病为癌症。更优选，当RHBDF1基因的表达水平被估计并与正常样品中的相比较时，所述细胞增生性疾病被诊断为CML，AML或肺腺癌之一。
本发明也提供了诊断细胞增生性疾病，如CML，AML或肺腺癌的诊断试剂。本发明的诊断试剂包括与本发明多核苷酸或多肽结合的化合物。优选，将与本发明多核苷酸杂交的寡核苷酸或与本发明多肽结合的抗体用作这样的化合物。
因此，本发明提供了一种利用本发明多肽筛选治疗细胞增生性疾病的化合物的方法。这种筛选方法的一个实实施方案包括以下步骤(a)将受试化合物与本发明多肽接触；(b)检测本发明多肽与受试化合物的结合活性；和(c)选择与本发明多肽结合的化合物。
用于筛选的本发明多肽可以是重组多肽或衍生自天然的蛋白或其部分肽。任何受试化合物，例如，细胞提取物，细胞培养上清液，微生物发酵产物，海洋生物提取物，植物提取物，纯化的或粗制的蛋白，肽，非肽化合物，合成的小分子化合物以及天然化合物都可用。与受试化合物接触的本发明多肽可以是，例如纯化的多肽，可溶性蛋白，与载体结合的形式或与其它多肽融合的融合蛋白。
本领域技术人员熟知的许多方法都可作为利用本发明多肽筛选例如与本发明多肽结合的蛋白的方法。这种筛选通过，例如免疫沉淀方法进行，具体地以下述方式进行。将编码本发明多肽的基因插入外源基因表达载体诸如pSV2neo，pcDNAI和pCD8等，在动物细胞等中表达所述基因。用于表达的启动子是通常使用的任意启动子，包括，例如SV40早期启动子(Rigbyin Williamson(ed.)，Genetic Engineering，Vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-1α启动子(Kim等，Gene 91217-23(1990))，CAG启动子(Niwa等，Gene 108193-200(1991))，RSV LTR启动子(Cullen，Methods inEnzymology 152684-704(1987))，SRα启动子(Takebe等，Mol Cell Biol 8466(1988))，CMV立即早期启动子(Seed and Aruffo，Proc Natl Acad Sci USA843365-9(1987))，SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1385-94(1982))，腺病毒晚期启动子(Kaufman等，Mol Cell Biol 9946(1989))，HSV TK启动子等等。将基因导入动物细胞以表达外源基因可采用任意方法，例如电穿孔法(Chu等，Nucleic Acids Res 151311-26(1987))，磷酸钙法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 72745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopata等，Nucleic Acids Res 125707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol41642-3(1985))，脂质体转染法(Derijard，B Cell 71025-37(1994)；Lamb等，Nature Genetics 522-30(1993)Rabindran等，Science 259230-4(1993))等等。本发明多肽也以融合蛋白的形式表达，所述融合蛋白包含单克隆抗体识别位点(表位)，所述位点通过将特异性已知的单克隆抗体的表位导入本发明多肽的N-或C-末端获得。可利用可购得的表位-抗体系统(ExperimentalMedicine 1385-90(1995))。利用其多克隆位点表达与，例如β-半乳糖苷酶，麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽-S-转移酶，绿色荧光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白的载体是可购得的。
还报道了通过仅导入小表位而制备的融合蛋白，该小抗原表位包含几个至十几个氨基酸因而并不改变本发明融合多肽的性质。表位，如聚组氨酸(His-标记)，流感凝集素HA，人c-myc，FLAG，水泡性口膜炎病毒(Vesicularstomatitis virus)糖蛋白(VSV-GP)，T7基因10蛋白(T7-标记)，人单纯疱疹病毒(simple herpes virus)糖蛋白(HSV-标记)，E-标记(单克隆噬菌体的表位)等，以及识别它们的单克隆抗体都可以作为表位-抗体系统来筛选与本发明多肽结合的蛋白(Experimental Medicine 1385-90(1995))。
免疫沉淀法中，通过在用合适的洗涤剂制备的细胞裂解物中添加这些抗体形成免疫复合物。免疫复合物含有本发明的多肽，具有与所述多肽结合的能力的多肽以及抗体。除了使用如上所述制备的、针对上述表位的抗体，免疫沉淀法中还可以使用抗本发明多肽的抗体实施。
当抗体是小鼠IgG抗体时，可例如用蛋白A琼脂糖或蛋白G琼脂糖沉淀免疫复合物。如果本发明多肽制备成与表位如GST融合的融合蛋白形式，使用与这些抗原表位特异性结合的物质诸如谷胱甘肽琼脂糖4B等形成免疫复合物的方式可与使用抗本发明多肽的抗体时一样。
免疫沉淀法可根据例如文献记载的方法进行(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))。
SDS-PAGE经常用来分析经免疫沉淀的蛋白，并且以合适浓度的凝胶根据蛋白的分子量也可以分析结合蛋白。因为与本发明多肽结合的蛋白很难用普通染色方法如考马斯染色或银染来检测，该蛋白的检测灵敏度可如下改进用含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基培养细胞，标记细胞中的蛋白并检测该蛋白。当蛋白的分子量已知时，靶蛋白可以经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳直接纯化并确定其序列。
例如West-Western印迹分析(Skolnik等，Cell6583-90(1991))可作为利用多肽筛选与本发明多肽结合的蛋白的方法。具体地，与本发明多肽结合的蛋白可如下获得从细胞，组织，器官(例如，气管，甲状腺，脊髓，前列腺，骨骼肌或胎盘)，或者培养的细胞制备cDNA文库，其中预计利用噬菌体载体(如ZAP)表达与本发明多肽结合的蛋白；在LB琼脂糖中表达蛋白；将表达的蛋白固定在滤膜上；经纯化和标记的本发明多肽与上述滤膜反应；根据标记检测表达与本发明多肽结合的蛋白的噬斑。本发明多肽的标记可利用生物素和抗生物素蛋白之间的结合，或利用特异性与本发明多肽结合的抗体，或与本发明多肽融合的肽或多肽(如GST)。也可以采用放射性同位素或荧光法等方法。
或者，本发明筛选方法的另一个实施方案中，采用了利用细胞的双杂交系统(two-hybrid system)(“MATCHMAKER双杂交系统”，“哺乳动物MATCHMAKER双杂交试验试剂盒”，“MATCHMAKER单杂交(one-hybrid)系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体系统”(Stra标记ene)；参考文献“Dalton and Treisman，Cell68597-612(1992)”，“Fields and Stemglanz，TrendsGenet 10286-92(1994)”)。
双杂交系统中，本发明多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合并在酵母细胞中表达。从预计表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞中制备cDNA文库，使得当所述文库表达时，即与VP16或GAL4的转录激活区融合。然后将该cDNA文库导入上述酵母细胞，从检测的阳性克隆中分离来自该文库的cDNA(当与本发明多肽结合的蛋白在酵母细胞中表达时，两者的结合激活报告基因，使得阳性克隆可以检测到)。将上述分离的cDNA导入大肠杆菌并表达该蛋白从而制备该cDNA编码的蛋白。
除了HIS3基因，例如Ade2基因，lacZ基因，CAT基因，萤光素酶基因等也可用作报告基因。
与本发明多肽结合的化合物也可利用亲和层析进行筛选。例如，将本发明多肽固定在亲和层析柱的载体上，并将含有能与本发明多肽结合的蛋白的受试化合物施加于层析柱。本文的受试化合物可以是，例如细胞提取物，细胞裂解物等。装载该受试化合物后，洗涤柱，制备与本发明多肽结合的化合物。
当受试化合物是蛋白质时，分析所得蛋白的氨基酸序列，根据该序列合成寡DNA，用该寡DNA作为探针筛选cDNA文库获得编码该蛋白的DNA。
利用表面胞质团共振现象的生物传感器可作为检测或定量本发明结合的化合物的一种方法。当使用这种生物传感器时，本发明多肽和受试化合物之间的相互作用可作为表面胞质团共振信号而被实时观察，仅仅使用极少量的多肽并且不需要标记(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能利用生物传感器如BIAcore评估本发明多肽和受试分子之间的结合。
筛选当本发明固定化的多肽暴露于合成化合物、或天然物质库、或随机噬菌体肽展示文库时发生结合的分子的方法，或根据组合化学技术(Wrighton等，Science 273458-64(1996)；Verdine，Nature 38411-13(1996)；Hogan，Nature 38417-9(1996))利用高通量以分离与本发明蛋白(包括激动剂和拮抗剂)结合的蛋白及化合物的筛选方法是本领域技术人员熟知的。
另外，本发明的筛选方法可包括以下步骤a)使受试化合物与导入了载体的细胞接触，该载体含有一或多种标记基因的转录调节区以及在该转录调节区控制下表达的报道基因，其中所述标记基因包含SEQ ID NO15的核苷酸序列，b)测定所述报道基因的活性；和
c)选择降低所述报道基因表达水平的化合物，所述降低是与在缺乏所述受试化合物时检测到的所述报道基因的表达水平相比。
适宜的报道基因和宿主细胞是本领域中所众所周知的。筛选所需的报告物构建体可通过使用标记基因的转录调节区来制备。当标记基因的转录调节区是本领域技术人员所已知时，报告物构建体可通过使用已知序列信息来制备。如果标记基因的转录调节区未被鉴定，包含转录调节区的核苷酸片段可从基于该标记基因的核苷酸序列信息的基因组文库中分离。
通过所述筛选分离的化合物是促进或抑制本发明多肽活性的候选物，其用于治疗或预防由于例如细胞增生性疾病诸如癌症造成的疾病。由本发明筛选方法获得的化合物还包括这样的化合物，其中由本发明筛选方法获得的化合物的部分结构经添加，缺失和/或取代修饰而改变。
另一实施方案中，本发明提供筛选候选药剂的方法，所述候选药剂为细胞增生性疾病治疗中的潜在靶。如上所述，通过控制RHBDF1表达水平，可控制CML，AML或肺腺癌的开始和进展。因此，作为细胞增生性疾病治疗中的潜在靶的候选药剂可通过利用RHBDF1表达水平和活性作为指示物进行筛选来鉴定。本文中，所述筛选可包括例如以下步骤a)将候选化合物与表达RHBDF1的细胞接触；和b)选择降低RHBDF1表达水平的化合物，所述降低与缺乏受试化合物时检测到的RHBDF1表达水平相比。
表达至少一种RHBDF1的细胞包括例如，从CML，AML，以及肺腺癌建立的细胞系；所述细胞可用于本发明上述筛选中。所述表达水平可通过本领域技术人员已知方法估计。筛选方法中，降低至少一种RHBDF1表达水平的化合物可选为候选药剂。
筛选治疗本发明细胞增生性疾病的化合物的方法的另一实施方案中，该方法利用本发明多肽的生物活性作为指示物。由于本发明的RHBDF1蛋白具有促进细胞增殖的活性，促进或抑制本发明蛋白之一的活性的化合物可利用该活性为指标进行筛选。该筛选方法包括以下步骤(a)将受试化合物与本发明的多肽接触；(b)检测步骤(a)的多肽的活性；和(c)选出与选择与缺乏受试化合物时检测到的所述多肽活性相比抑制所述多肽生物活性的化合物。
任何包含RHBDF1蛋白的生物活性的多肽都可用于筛选。所述生物活性包括人RHBDF1蛋白的细胞增殖活性。
可以使用任何受试化合物，例如，细胞提取物，细胞培养上清，微生物发酵产物，海洋生物提取物，植物提取物，纯化的或粗制蛋白质，肽，非肽化合物，合成小分子化合物和天然化合物。
通过这种筛选分离的化合物是本发明多肽的激动剂或拮抗剂。术语“激动剂“指通过与本发明多肽结合活化其功能的分子。同样，“拮抗剂”指通过与本发明多肽结合抑制其功能的分子。而且，通过这种筛选分离的化合物是抑制本发明多肽与分子(包括DNA和蛋白质)在体内相互作用的候选化合物。
当本发明方法中所检测的生物活性是细胞增殖作用时，可例如如下进行检测例如通过制备表达本发明多肽的细胞，在存在受试化合物的情况下培养所述细胞，测定细胞增殖速度，测量细胞周期等，以及如实施例所述测定集落形成活性。
通过上述筛选而分离的化合物是药物的候补物，所述药物抑制本发明蛋白质的活性，且可用于治疗或预防与本发明多肽相关的疾病，例如细胞增生性疾病包括癌症。更具体地，当RHBDF1蛋白的生物活性用作指标时，通过本发明方法筛选的化合物可作为治疗CML，AML，肺腺癌的候选药物。
此外，可由本发明筛选方法获得的化合物还包括这样的化合物，其中该化合物中能够抑制RHBDF1蛋白质的活性的部分结构经添加，缺失和/或取代修饰而改变。
当通过本发明筛选方法分离的化合物作为药物而施用于人类或其它哺乳动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒以及猩猩来治疗细胞增生性疾病(例如癌)时，该分离的化合物可被直接施用或可采用已知的药物制备方法而被制成剂型。例如，根据需要，该药物可作为糖衣片剂，胶囊剂，酏剂和微囊剂而口服，或以水或任何其它可药用的液体的无菌溶液或悬浮液的注射液形式以非口服方式施用。例如，该化合物可与可药用的载体或介质以通常可接受的药物制备方法所需的单位剂型进行混合，所述载体或介质具体而言为无菌水，生理盐水，植物油，乳化剂，悬浮剂，表面活性剂，稳定剂，调味剂，赋形剂，载体，防腐剂，粘合剂等。这些制剂中活性成分的量为所述范围内的适宜剂量。
可混合至片剂和胶囊的添加剂的实例是，粘合剂诸如明胶，玉米淀粉，黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂诸如微晶纤维素；溶胀剂诸如玉米淀粉，明胶和海藻酸；润滑剂诸如硬脂酸镁；增甜剂诸如蔗糖，乳糖或糖精；以及调味剂诸如薄荷，Gaultheria adenothrix油和樱桃红(cherry)。当单位剂型是胶囊时，液体载体诸如油，也可进一步包括在上述成份中。用于注射的无菌组合物可按照标准的药物制备方法采用载体诸如用于注射的蒸馏水进行制备。
生理盐水，葡萄糖，以及包含佐剂诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的其它等张液可被用作注射用含水溶液。其可与适宜的增溶剂，诸如醇，具体地乙醇，多元醇诸如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(Polysorbate)80(TM)和HCO-50联合使用。
麻油或大豆油可用作油性液体，其可与以下物质联合使用用作增溶剂的苯甲酸苄酯或苯甲醇，可采用缓冲液诸如磷酸盐缓冲液和醋酸钠缓冲液进行配制；止痛药，诸如盐酸普鲁卡因；稳定剂，诸如苯甲醇和苯酚；和抗氧化剂。可将制备的注射剂装于适宜的安瓿中。
可采用本领域技术人员众所周知的方法将本发明的药物组合物给药患者，例如以动脉内，静脉内，或经皮注射的方式，也可以经鼻内、经支气管、经肌内或口服投药。施用的剂量和方法根据患者的体重和年龄以及施用方法而改变；然而，本领域技术人员可常规地选择适宜的施用方法。如果所述化合物可由DNA编码，可将该DNA插入用于基因治疗的载体中，并施用该载体来实施治疗。施用的剂量和方法根据患者的体重，年龄和症状而改变但本领域技术人员能适当地对其进行选择。
例如，不同症状适宜的剂量不同，但经口服施用于正常成年受试者(体重60kg)时，与本发明多肽结合并调节其活性的化合物的剂量为约0.1mg-约100mg/日，优选约1.0mg-约50mg/日且更优选约1.0mg-约20mg/日。
当经胃肠外以注射剂方式施用于正常成年受试者(体重60kg)时，虽然根据患者、靶器官、症状和施用方法而存在一些差异，适于静脉内注射的剂量是约0.01mg-约30mg/日，优选约0.1-约20mg/日且更优选约0.1-约10mg/日。而且，当用于其它动物时，可以施用按60kg体重转换的量。
另外，本发明提供了一种用抗本发明多肽的抗体治疗或预防细胞增生性疾病，诸如癌的方法。根据该方法，给予药物有效量的抗本发明多肽的抗体。因为癌细胞中RHBDF1蛋白的表达上调，并且抑制这些蛋白的表达能降低细胞增殖活性，所以预计将所述抗体与这些蛋白结合可以治疗或预防细胞增生性疾病。因此，抗本发明多肽的抗体以足以降低本发明蛋白的活性的剂量给予，该剂量是约3至2000mg/天(60kg体重)。例如，尽管根据症状会有一些差异，对于正常成年人(60kg体重)而言与本发明多肽结合的抗体的剂量从约5mg至约1000mg/天，优选约10mg至约500mg/天。
另外，用与肿瘤细胞特异性细胞表面标志物结合的抗体作为药物递送工具。例如，以足以杀伤肿瘤细胞的剂量给予与细胞毒药剂偶联的抗体。
本发明还涉及诱导抗肿瘤免疫的方法，包括给予RHBDF1蛋白或其免疫活性片段，或编码所述蛋白或其片段的多核苷酸的步骤。RHBDF1蛋白或其免疫活性片段可用作抗细胞增生性疾病诸如癌等的疫苗。一些情况中，蛋白或其片段以结合于T细胞受体(TCR)的形式或由抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞，树突细胞(DC)或B细胞呈递的形式给予。由于DC细胞的强抗原呈递活性，APC中最优选使用DC细胞。
本发明中，抗细胞增生性疾病的疫苗指具有一经接种到动物便具有抗肿瘤免疫的物质。通常，抗肿瘤免疫包括下述免疫反应-诱导抗肿瘤的细胞毒淋巴细胞，-诱导识别肿瘤的抗体，和-诱导抗肿瘤细胞因子的产生。
因此，当某种蛋白在接种动物中诱导这些免疫反应的任意一种时，则确定该蛋白具备抗肿瘤免疫诱导效应。通过在体内或体外观察宿主免疫系统对蛋白的反应检测蛋白对抗肿瘤免疫的诱导。
例如，检测诱导细胞毒T淋巴细胞的方法是已知的。进入活体的外来物质经过抗原呈递细胞(APC)的作用呈递到T细胞和B细胞。对APC以抗原特异性方式呈递的抗原有反应的T细胞由于受到该抗原的刺激，分化成细胞毒T细胞(或细胞毒T淋巴细胞，CTL)，随后进行增殖(本文中称为T细胞激活)。因此，具体肽对CTL的诱导可通过由APC将肽呈递到T细胞来评估，并检测对CTL的诱导。另外，APC能激活CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞和NK细胞。因为CD4+T细胞和CD8+T细胞对抗肿瘤免疫也很重要，所以肽的抗肿瘤免疫诱导作用可利用这些细胞的活化效应作为指示物进行评价。
用树突细胞(DC)作为APC评价对CTL的诱导作用的方法是本领域已知的。DC是一种代表性APC，它的CTL诱导活性在APC中最强。在本方法中，受试多肽首先与DC接触，然后该DC与T细胞接触。与DC接触后若检测到T细胞对感兴趣的细胞有细胞毒效应，则说明受试多肽具有诱导细胞毒T细胞的活性。CTL的抗肿瘤活性可利用例如，51Cr-标记的肿瘤细胞的溶解作为指示进行检测。或者，利用3H-胸苷吸收活性或LDH(乳糖脱氢酶)-释放作为指示物，评价肿瘤细胞损伤程度的方法也是本领域已知的。
除了DC，外周血单核细胞(PBMC)也可作为APC。有报道当存在GM-CSF和IL-4时培养PBMC能促进CTL的诱导。类似地，当存在匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)和IL-7时培养PBMC也能诱导CTL。
经这些方法证实具有CTL诱导活性的受试多肽是具备DC活化效应以及随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导抗肿瘤细胞CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。另外，通过与该多肽接触而获得了诱导抗肿瘤CTL能力的APC也可用作抗肿瘤的疫苗。此外，由于APC对多肽抗原的呈递而获得了细胞毒性的CTL也可作为抗肿瘤的疫苗。这种利用由APC和CTL造成的抗肿瘤免疫治疗肿瘤的方法称作细胞免疫疗法。
通常，当使用多肽进行细胞免疫疗法时，已知联合使用具有不同结构的多种多肽并将它们与DC接触可以增加CTL诱导的效率。因此，当用蛋白片段刺激DC时，使用多种类型片段的混合物是有利的。
或者，多肽的抗肿瘤免疫诱导作用可通过观察到诱导抗肿瘤抗体的产生而证实。例如，当在用多肽免疫的实验室动物中诱导了抗多肽的抗体时，以及肿瘤细胞的生长被这些抗体抑制时，则确定该多肽具有诱导抗肿瘤免疫的能力。
通过给予本发明的疫苗诱导抗肿瘤免疫，并且抗肿瘤免疫的诱导使得可以治疗和预防细胞增生性疾病诸如CML，AML或肺腺癌等。治疗癌症或预防癌症发病包括下述任意步骤，诸如抑制癌性细胞的生长，癌症的退化以及抑制癌症的发生。降低癌症患者受试者的死亡率，减少血液中的肿瘤标志物，减轻伴随癌症的可检测的症状等，都包括在治疗或预防癌症的效果中。这种治疗或预防效果优选是统计学上显著的。例如，在观察中，显著性水平是5％或更低时，将抗细胞增生性疾病的疫苗的治疗或预防效果与不给予疫苗的对照组进行比较。如，Student’s t-检验，曼-惠特尼U-检验或ANOVA都可用来进行统计分析。
上述具有免疫活性的蛋白或编码该蛋白的载体可与佐剂联合。佐剂指当与具有免疫活性的蛋白同时给予(或相继给予)时，能促进针对该蛋白的免疫反应的化合物。佐剂包括霍乱毒素，沙门氏菌毒素，铝等，但并不限于这些。此外，本发明疫苗可与适当的可药用载体联合。这种载体例如无菌水，生理盐水，磷酸盐缓冲液，培养液等。而且，如果必要，疫苗可包含稳定剂，混悬剂，防腐剂，表面活性剂等。疫苗全身性或局部给药。给予疫苗可以是单次给药或通过多次给药进行强化。
当使用APC或CTL作为本发明的疫苗，可例如通过体外方法治疗或预防肿瘤。更具体地，收集正接受治疗或预防疗法的受试者的PBMC，在离体条件下将该细胞与所述多肽接触，诱导APC或CTL之后，再将该细胞给予受试者。也可通过在离体条件下将编码所述多肽的载体导入PBMC从而诱导APC。可在给药之前克隆在体外诱导的APC或CTL。通过克隆对靶细胞有高损伤活性的细胞并使其生长，细胞免疫疗法可以更加有效地进行。另外，以这种方式分离的APC和CTL可用于细胞免疫疗法，所述疗法不仅针对所述细胞来源的受试者，也针对其它受试者相似类型的肿瘤。
另外，提供了治疗和预防细胞增生性疾病，诸如癌等的药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的多肽。该药物组合物可用于激发抗肿瘤免疫。正常的RHBDF1表达局限于睾丸，而PCOTH的表达局限于气管，甲状腺，脊髓，前列腺，骨骼肌或胎盘。因此，抑制这些基因的表达不会对其它器官造成不利影响。所以，优选RHBDF1多肽用于治疗细胞增生性疾病，具体为CML，AML或肺腺癌。
下述实施例用来解释本发明，并帮助本领域普通技术人员实施本发明。所述实施例并不限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。虽然与本文所述的相同或相似的方法和材料也可用来实施或验证本发明，但适宜的方法和材料如下所述。本文引用的任何专利，专利申请和出版物都包含在本文作为参考。
本发明最佳实施方式通过下述实施例详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
材料和方法细胞系和临床材料人白血病K562细胞得自Dr.M.Towatari(Nagoya Univ.，School of Med.，Nagoya，Japan)。人肺癌系A549，LC319和H522，以及小鼠成纤维细胞系NIH3T3购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC，Rockville，MD)。所有细胞均培养在适宜培养基中，即RPMI-1640(Sigma，St.Louis，MO)用于K562，A549，LC319和H522；Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于NIH3T3，每种培养基都添加10％胎牛血清和1％抗生素/抗菌素溶液(Sigma)。细胞保持在37℃、含5％CO2潮湿空气的环境中。急性髓细胞白血病和肺癌样品获自预先告知并征得同意的患者。
用cDNA微阵列分离人基因C6135已经描述了cDNA微阵列载片的构建(Ono等，2000，Cancer Res605007-11)。对于每一次表达分布图的分析，本发明人制备了两组相同的含23,040cDNA点的cDNA微阵列载片，以减小试验波动。简言之，从CML患者和健康志愿者的白细胞纯化总RNA。进行基于T7的RNA扩增以获得足够的RNA进行微阵列试验。从CML细胞和正常自愿者的等分试样扩增的RNA分别用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP通过反转录进行标记(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)。杂交，洗涤和检测如前文所述进行(Kaneta等，2002 Jpn.J.Cancer Res.，93，849-856.)。随后，在所有上调基因中，选择内部标识号为C6135的基因。在提供信息的(informative)的CML病例中，超过60％的病例的C6135表达比大于5.0。
Northern-印迹分析C6135(所述微阵列上的基因)的[α32P]dCTP标记的PCR产物与人多个组织的Northern印迹(Clontech，Palo Alto，CA)杂交。该PCR产物是利用下述引物经RT-PCR制备的5’-GTGCTCTTCCTCTTCACCTTTG-3’(SEQ.IDNO.1)和5’-GGTGGTCGTCAAGAAACAAGTTA-3’(SEQ.IDNO.2)。根据提供商的推荐进行预杂交，杂交和洗涤。在-80℃，所述印迹用增光屏放射自显影9天。
半定量RT-PCR分析根据制造商的方案，用TRIzol试剂(Invitrogen)从培养细胞和临床样品提取总RNA。提取的RNA用DNAeI(Roche)处理，并用寡(dT)16引物和SuperscriptII逆转录酶(Roche)逆转录成单链cDNA。适当稀释每种单链cDNA以进行随后的PCR扩增，所述扩增是通过监测作为定量对照的β-肌动蛋白(ACTB)进行的。引物序列是5’-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’(SEQ.IDNO.3)和5’-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ.IDNO.4)用于ACTB；5’-GTGCTCTTCCTCTTCACCTTTG-3’(SEQ.IDNO.5)和5’-GGTGGTCGTCAAGAAACAAGTTA-3’(SEQ.IDNO.6)用于C6135；5’-GACAACTCACTCAAGATTGTCAG-3’(SEQ.IDNO.7)和5’-GATCCACGACGGACACATTG-3’(SEQ.ID.NO.8)用于GAPDH。所有反应包括94℃初始变性2min，然后在94℃、30s，58℃、30s，72℃、1min进行21个循环(对ACTB和GAPDH)或30个循环(对C6135)，所述反应均在GeneAmp PCR系统9700(PE Applied Biosystems)进行。
表达载体的构建用下述引物经RT-PCR扩增C6135cDNA的全长编码序列C6135-正向(5’-CGGAATTCCGATGAGTGAGGCCCGCAGG-3’(SEQ.IDNO.9))和C6135-反向(5’-GGGGTACCCCAGTGGAGCTGAGCGTCCAG-3’(SEQ.IDNO.10))。所得产物被插入pcDNA3.1(-).myc.his(invitrogen)的EcoRI and KpnI位点，其携带巨细胞病毒(CMV)启动子和赋予新霉素抗性的基因(pcDNA3.1(-)-C6135-myc-his)。通过DNA测序证实构建体。
免疫细胞化学染色根据制造商的说明书，利用FuGENE6(Roche)以pcDNA3.1(-)-C6135-myc.his瞬时转染NIH3T3细胞，随后所述细胞随后用4％低聚甲醛固定，并在室温用含0.2％Triton X-100的PBS通透化3min。接着，室温用封闭液(含0.2％Triton X-100的3％BSA/PBS)覆盖所述细胞30min，并在室温、封闭液中与兔抗myc抗体(Santa Cruz Biotechnology)和小鼠单克隆抗-高尔基体(Golgi)58K蛋白(Sigma)共同温育60min。用PBS洗涤后，细胞用FITC-偶联的抗兔第二抗体(Organon teknika)，若丹明偶联的-抗小鼠第二抗体(ICN Biomedicals)以及4’，6’-联脒(diamidine)-2’-苯基吲哚二氢氯化物(phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)(Roche)在室温染色60min，然后用Nikon Eclips E800荧光显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)显像。
生长实验稳定表达C6135的NIH3T3细胞(NIH3T3-C6135细胞)通过用pcDNA3.1(-)-C6135-myc.his质粒利用FuGENE 6转染NIH3T3细胞建立。作为对照，空载体转染的细胞(NIH3T3-载体细胞)也被亚克隆。NIH3T3-C6135和NIH3T3-载体细胞接种在6孔板(1×104细胞/孔)，且利用细胞计数试剂盒-8(Wako pure chemicals industries)根据生产商说明通过MTT实验测定细胞增殖。
反义S-寡核苷酸对细胞生长的影响NIH3T3细胞铺在24孔板(2×106细胞/孔)，并用C6135的相应合成S-寡核苷酸(10mM)转染所述细胞，保持在含10％胎牛血清的培养基中48小时。MTT(3-(4，5-二甲基(dimethyl)-噻唑(thiazol)-2-基)-2，5-二苯基(diphenyl)-2H-四唑(tetrazolium)溴化物(bromide))实验如其它部分所述按一式三份进行(Akashi等，2000.Int.J.Cancer，88，873-880.).S-寡核苷酸序列如下反义(5’-CTGTGTGATGGACGTCTG-3’(SEQ.IDNO.11))，反向(5’-GTCTGCAGGTAGTGTGTC-3’(SEQ.IDNO.12))。
RNAi对细胞生长的影响siRNA表达载体(psiH1BX)用于RNAi。H1启动子克隆入基因特异性序列(来自靶转录物的19nt序列，通过短间隔物与其反向互补序列分开)上游，5个胸腺嘧啶作为终止信号，并且整合neo盒变为对Geneticin(Sigma)抵抗。RHBDF1和EGFP的靶序列分别为5’-GTACGTGCAGCAGGAGAAC-3’(SEQ.IDNO.13)以及5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ.IDNO.14)。人肺腺癌细胞系A549，H522和LC319铺于10-cm皿(5×105细胞/皿)，并用含EGFP靶序列的psiH1BX，psiH1BX(psiH1BX-EGFP)以及含RHBDF1靶序列的psiH1BX(psiH1BX-RHBDF1)、利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)、根据生产商说明进行转染。细胞通过500mg/ml Geneticin选择一周，并用Giemsa溶液染色并进行MTT实验。
结果鉴定RHBDF1为CML细胞中上调的基因利用代表23,040人基因的cDNA微阵列(Kaneta等，2002.Jpn.J.CancerRes.，93，849-856.)分析来自27CML患者的癌细胞的基因-表达分布图，并鉴定了在CML细胞中通常上调的150种基因。其中，焦点集中在内部编号为C6135的一种基因，其在超过60％CML患者中上调(图1a)。C6135 cDNA由含开放阅读框2568bp的2958核苷酸(SEQ.ID.NO.15)组成，其编码推定的855氨基酸的蛋白质(DNA序列获自GenBank，登录号NM022450)(SEQ.ID.NO.16)。利用BLAST程序在NCBI数据库中(National Center forBiotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)对预测的氨基酸序列以及蛋白进行的同源性搜索显示，该蛋白质与黑腹果蝇Rhomboid-5具有一定程度的同一性(39％氨基酸同一性)。SMART程序预测C6135蛋白质含有C末端部分的7个跨膜结构域组成的rhomboid结构域，并提示其高尔基体定位。比较C6135蛋白质与果蝇rhomboid家族还表明该家族成员中rhomboid结构域高度保守(图1b)。由此我们将该基因命名为RHBDF1，Rhomboid家族1(Drosophila)。如图1c所示，来自这些序列的系统发生树也表示RHBDF1与果蝇Rhomboid-5同源性最高。
利用RHBDF1 cDNA克隆作为探针的Northern印迹分析(图2a)鉴定了3.1-kb转录物，其遍在表达但主要见于气管、甲状腺、脊髓、前列腺、骨骼肌或胎盘。为进一步研究RHBDF1蛋白质的亚细胞定位，将表达RHBDF1蛋白质(pcDNA3.1(-)-C6135-myc-his)的质粒转染入NIH3T3细胞并进行免疫细胞化学染色。如图2b所示，用抗-myc抗体在高尔基体观察到RHBDF1蛋白质。
RHBDF1对NIH3T3细胞生长的影响为说明RHBDF1潜在的致肿瘤作用，建立NIH3T3-RHBDF1细胞。通过将pcDNA3.1(-)-RHBDF1-myc-his转染入NIH3T3细胞，NIH3T3-RHBDF1稳定过表达RHBDF1，并通过半定量RT-PCR证实一些转化物中的稳定表达(图3a)。随后，为利用这些转化的克隆研究RHBDF1表达对生长的影响，通过MTT实验将其生长与用模拟(mock)转染的对照细胞(NIH3T3-模拟细胞)进行比较。如图3b所示，NIH3T3-RHBDF1细胞(#1，#2，and#3)与对照细胞相比生长速率明显提高。这些结果被以一式三份在孔中进行的三次独立实验证实。该发现表明过表达RHBDF1的NIH3T3细胞具有生长优势。
设计为降低RHBDF1表达的反义S-寡核苷酸和小干扰RNA(siRNA)对生长抑制性影响为进一步评估RHBDF1的促生长作用，合成与部分RHBDF1序列相对应的5种反义S-寡核苷酸并将其转染入K562细胞，所述细胞过表达RHBDF1。转染后48小时，提取mRNA并通过半定量RT-PCR检测RHBDF1表达水平。所检测的5种反义S-寡核苷酸中，一种(RHBDF1-AS1)与具有所述反义寡核苷酸的反向序列的对照寡核苷酸(RHBDF1-R1)相比显著抑制RHBDF1表达(图4a)。RHBDF1-AS1的生长抑制效应通过利用MTT实验证实，并证实与导入RHBDF1-R1相比，导入RHBDF1-AS1明确抑制K562细胞生长(图4b)。
为进一步证实RHBDF1在K562CML细胞中的生长抑制作用，通过基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术(见材料和方法)敲除外源RHBDF1基因表达(图4c)。psiH1BX-RHBDF1的转染导致表达降低，并导致生长抑制，这与利用反义S-寡核苷酸所得结果一致(图4d)。总之，我们的发现表明RHBDF1在CML细胞中有致癌作用。
我们最近的表达分布图表明，与各自的正常对照相比RHBDF1还在急性髓细胞白血病(AML)以及肺腺癌中明显上调。随后的半定量RT-PCR实验鉴定了14AML样品中的一半以上以及所有7个肺腺癌样品中的RHBDF1表达增加(图5a和5b)。因此，为研究RHBDF1在肺癌形成中的作用，在A549，LC319和H522，肺腺癌细胞系中通过基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术敲除RHBDF1表达并检测对细胞生长的影响。如图6a，6c和6e所示，导入psiH1BX-RHBDF1明显降低RHBDF1在所有肺腺癌细胞系中的表达，并导致这些细胞的生长抑制，而用对照质粒psiH1BX以及psiH1BX-GFPsiRNA表达载体转染的细胞中没有观察到所述影响。为进一步确认psiH1BX-RHBDF1的基因-特异性生长降低作用，利用三种肺腺癌细胞系进行集落形成实验。如图6b，6d和6f，将psiH1BX-RHBDF1导入所述三种细胞系导致细胞生长明显被抑制。此外，RHBDF1表达被抑制时，MTT实验的结果还显示生长抑制效应(图6g)。这些结果通过三次独立实验证实。
讨论为全面研究致癌的详细分子机制，我们试图通过cDNA微阵列方法(代表23,040个转录物)获得CML、急性髓细胞白血病(AML)和肺腺癌的癌细胞的全基因组表达分布图(Kaneta等，2002，Jpn.J.Cancer Res.，93，849-856.；Okutsu等，2002.Mol.Cancer Ther.，1，1035-1042.；Kikuchi等，2003，Onco基因，22，2192-2205.)。在这些癌症中上调的基因当中，我们鉴定了RHBDF1基因(类似果蝇Rhomboid-5)，其很可能属于Rhomboid家族。Rhomboid家族是最近分离的，并且其功能仅在有限数量的生物体和背景中显示。其中，果蝇Rhomboid-1已经被鉴定为膜内丝氨酸蛋白酶，其负责启动果蝇表皮生长因子受体(EGFR)信号(Lee等，2001.Cell，107，161-171.；Urban等，2001.Cell，107，173-182.)。在果蝇中该途径的活化通过三种跨膜EGFR配体前体Spitz，Keren和Gurken的选择性蛋白水解来调节。在其跨膜形式中，这些配体是无活性的，并限制在内质网(ER)。在信号为阳性的细胞中，Star(2型膜蛋白)，将这些配体从内质网输出到高尔基体，在那里它们通过rhomboid膜内丝氨酸蛋白酶切割。所述切割释出EGF配体结构域并随后分泌该结构域，作为其它细胞的活化信号。Rhomboid的蛋白酶活性位点位于膜双层中，且所述活化切割出现在配体跨膜结构域中。该蛋白水解切割系统与其它已知生长因子相反，其利用细胞表面的金属蛋白酶来释放活性生长因子结构域(Urban等，2002.Curr.Biol.，12，1507-1512.)。对于将近100种目前已知在进化中保守的rhomboid相关基因的功能知之甚少，但最近的研究表明来自病原细菌的Rhomboid参与群体感应(quorum-sensing)因子的产生(Rather等，1994.J.Bacteriol.，176，5140-5144.；Gallio等，2000.Curr.Biol.，10，R693-694.)，提示Rhomboid相关的细胞内信号机制在进化步骤中是保守的。
根据如上述最近对原核rhomboid的功能分析，可理解所有Rhomboid蛋白具有膜内丝氨酸蛋白酶功能。例如，果蝇Rhomboids 1-4具有相似的蛋白水解活性并且所有膜粘连的(membrane-tethered)配体是Rhomboid蛋白酶的底物(Lee等，2001.Cell，107，161-171.；Urban等，2002.EMBO J.，21，4277-4286.)。然而，虽然RHBDF1含有高度保守的rhomboid结构域(图1band 1c)，催化蛋白水解的丝氨酸蛋白酶必要残基在该rhomboid结构域中不是保守的。因此，研究RHBDF1蛋白是否具有对膜-粘连的EGF受体配体诸如Spitz进行蛋白水解的能力有很大兴趣。需要其它对纯化的RHBDF1蛋白的直接生化分析来回答上述问题。
我们的结果提示活化的RHBDF1作为癌基因起作用，基于稳定RHBDF1表达增强细胞生长以及通过反义S-寡核苷酸或RNAi降低RHBDF1表达抑制CML和肺腺癌细胞的生长的事实。此外，免疫细胞化学染色提示RHBDF1与其它Rhomboid蛋白一样位于高尔基器。这些发现提示，RHBDF1可具有其自己的靶底物，所述底物介导RHBDF1-依赖的信号，尽管所述靶分子目前还不明确。如果是这样，鉴定RHBDF1底物可提供设计新抗癌药物的新线索。
结论是，该研究证实了Rhomboid蛋白质可能参与致癌。由于RHBDF1转录物的表达在正常成人组织中相对较低，RHBDF1本身可作为癌症的新治疗靶。
工业实用性新的人RHBDF1基因在CML和AML中的表达与在正常外周血细胞中的表达相比而言显著提高。因此，这些基因可作为癌的诊断标志物，其编码的蛋白可用于癌的诊断试验。
本发明人还指出新蛋白RHBDF1的表达促进细胞生长，而对应于RHBDF1基因的反义寡核苷酸或小干扰RNA抑制细胞生长。这些发现证明每个RHBDF1蛋白都刺激致癌活性。因此，这些新的癌蛋白每个都是研制抗癌药物的有用靶点。例如，阻断RHBDF1表达或抑制其活性的的试剂可用作抗癌试剂，特别是用于治疗CML，AML和肺腺癌。这种试剂的实例包括抗RHBDF1基因的反义寡核苷酸，小干扰RNA，以及识别RHBDF1的抗体。
已经详细描述了本发明并以具体实施例作为参考，不偏离本发明精神和范畴进行的各种改变和修饰对本领域技术人员是显而易见的。
序列表<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO<120>与人髓细胞白血病相关的基因和多肽<130>ONC-A0213P2<150>US60/414,867<151>2002-09-30<160>16<170>PatentIn version3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>1gtgctcttcc tcttcacctt tg 22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>2ggtggtcgtc aagaaacaag tta 23<210>3<211>23<212>DNA<213>人工
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>3catccacgaa actaccttca act 23<210>4<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>4tctccttaga gagaagtggg gtg 23<210>5<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>5gtgctcttcc tcttcacctt tg 22<210>6<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>6ggtggtcgtc aagaaacaag tta 23
<210>7<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>7gacaactcac tcaagattgt cag 23<210>8<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>8gatccacgac ggacacattg 20<210>9<211>28<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>9cggaattccg atgagtgagg cccgcagg 28<210>10<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列
<400>10ggggtacccc agtggagctg agcgtccag29<210>11<211>18<212>DNA<213>人工<220>
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<223>人工合成的反义S-寡核苷酸序列<400>12gtctgcaggt agtgtgtc18<210>13<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>SiRNA的靶序列<400>13gtacgtgcag caggagaac 19<210>14<211>19<212>DNA<213>人工
<220>
<223>SiRNA的靶序列<400>14gaagcagcac gacttcttc 19<210>15<211>2958<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(111)..(2678)<223>
<400>15ctcggcgcgg gcgccctccc ggccagcggc ggcagcccct cctccccggc gccctcagga 60ccccccagag acccccggcg gcggcagcct gccttgctct gccaggaacc atg agt 116Met Ser1gag gcc cgc agg gac agc acg agc agc ctg cag cgc aag aag cca ccc 164Glu Ala Arg Arg Asp Ser Thr Ser Ser Leu Gln Arg Lys Lys Pro Pro5 10 15tgg cta aag ctg gac att ccc tct gcg gtg ccc ctg acg gca gaa gag 212Trp Leu Lys Leu Asp Ile Pro Ser Ala Val Pro Leu Thr Ala Glu Glu20 25 30ccc agc ttc ctg cag ccc ctg agg cga cag gct ttc ctg agg agt gtg 260Pro Ser Phe Leu Gln Pro Leu Arg Arg Gln Ala Phe Leu Arg Ser Val35 40 45 50agt atg cca gcc gag aca gcc cac atc tct tca ccc cac cat gag ctc 308Ser Met Pro Ala Glu Thr Ala His Ile Ser Ser Pro His His Glu Leu55 60 65cgg cgg ccg gtg ctg caa cgc cag acg tcc atc aca cag acc atc cgc 356Arg Arg Pro Val Leu Gln Arg Gln Thr Ser Ile Thr Gln Thr Ile Arg70 75 80
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Glu Glu Pro Ser Phe Leu Gln Pro Leu Arg Arg Gln Ala Phe Leu Arg35 40 45Ser Val Ser Met Pro Ala Glu Thr Ala His Ile Ser Ser Pro His His50 55 60Glu Leu Arg Arg Pro Val Leu Gln Arg Gln Thr Ser Ile Thr Gln Thr65 70 75 80Ile Arg Arg Gly Thr Ala Asp Trp Phe Gly Val Ser Lys Asp Ser Asp85 90 95Ser Thr Gln Lys Trp Gln Arg Lys Ser Ile Arg His Cys Ser Gln Arg100 105 110Tyr Gly Lys Leu Lys Pro Gln Val Leu Arg Glu Leu Asp Leu Pro Ser115 120 125Gln Asp Asn Val Ser Leu Thr Ser Thr Glu Thr Pro Pro Pro Leu Tyr130 135 140Val Gly Pro Cys Gln Leu Gly Met Gln Lys Ile Ile Asp Pro Leu Ala145 150 155 160Arg Gly Arg Ala Phe Arg Val Ala Asp Asp Thr Ala Glu Gly Leu Ser165 170 175Ala Pro His Thr Pro Val Thr Pro Gly Ala Ala Ser Leu Cys Ser Phe180 185 190Ser Ser Ser Arg Ser Gly Phe His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Lys Arg195 200 205Glu Ser Val Ala Lys Met Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ala Leu Met Lys210 215 220Gly Arg Ser Val Arg Asp Gly Thr Phe Arg Arg Ala Arg Arg Arg Ser225 230 235 240Phe Thr Pro Ala Ser Phe Leu Glu Glu Asp Thr Thr Asp Phe Pro Asp245 250 255Glu Leu Asp Thr Ser Phe Phe Ala Arg Glu Gly Ile Leu His Glu Glu260 265 270
Leu Ser Thr Tyr Pro Asp Glu Val Phe Glu Ser Pro Ser Glu Ala Ala275 280 285Leu Lys Asp Trp G1u Lys Ala Pro Glu Gln Ala Asp Leu Thr Gly Gly290 295 300Ala Leu Asp Arg Ser Glu Leu Glu Arg Ser His Leu Met Leu Pro Leu305 310 315 320Glu Arg Gly Trp Arg Lys Gln Lys Glu Gly Ala Ala Ala Pro Gln Pro325 330 335Lys Val Arg Leu Arg Gln Glu Val Val Ser Thr Ala Gly Pro Arg Arg340 345 350Gly Gln Arg Ile Ala Val Pro Val Arg Lys Leu Phe Ala Arg Glu Lys355 360 365Arg Pro Tyr Gly Leu Gly Met Val Gly Arg Leu Thr Asn Arg Thr Tyr370 375 380Arg Lys Arg Ile Asp Ser Phe Val Lys Arg Gln Ile Glu Asp Met Asp385 390 395 400Asp His Arg Pro Phe Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Ser Leu405 410 415Val Thr Ile Leu Ala Val Cys Ile Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly Phe420 425 430Ser Gln His Glu Thr Val Asp Ser Val Leu Arg Asn Arg Gly Val Tyr435 440 445Glu Asn Val Lys Tyr Val Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly Pro Ser450 455 460Ser Glu Ala Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Met Arg465 470 475 480Gln Asp Pro Gln Val His Ser Phe Ile Arg Ser Ala Arg Glu Arg Glu485 490 495Lys His Ser Ala Cys Cys Val Arg Asn Asp Arg Ser Gly Cys Val Gln
500 505 510Thr Ser Glu Glu Glu Cys Ser Ser Thr Leu Ala Val Trp Val Lys Trp515 520 525Pro Ile His Pro Ser Ala Pro Glu Leu Ala Gly His Lys Arg Gln Phe530 535 540Gly Ser Val Cys His Gln Asp Pro Arg Val Cys Asp Glu Pro Ser Ser545 550 555 560Glu Asp Pro His Glu Trp Pro Glu Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile Cys565 570 575Thr Lys Asn Ser Ala Gly Asn His Thr Asn His Pro His Met Asp Cys580 585 590Val Ile Thr Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys Gly Arg Cys Glu595 600 605Ile Thr Ser Arg Glu Tyr Cys Asp Phe Met Arg Gly Tyr Phe His Glu610 615 620Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Met Asp Asp Val Cys Gly625 630 635 640Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln Phe Tyr Arg Leu645 650 655Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Leu His Cys Leu Val Ser660 665 670Ile Cys Phe Gln Met Thr Val Leu Arg Asp Leu Glu Lys Leu Ala Gly675 680 685Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Leu Ser Gly Val Thr Gly Asn690 695 700Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu Val Gly Pro Ala705 710 715 720Gly Ser Gln Phe Gly Ile Leu Ala Cys Leu Phe Val Glu Leu Phe Gln725 730 735
Ser Trp Gln Ile Leu Ala Arg Pro Trp Arg Ala Phe Phe Lys Leu Leu740 745 750Ala Val Val Leu Phe Leu Phe Thr Phe Gly Leu Leu Pro Trp Ile Asp755 760 765Asn Phe Ala His Ile Ser Gly Phe Ile Ser Gly Leu Phe Leu Ser Phe770 775 780Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Ser Phe Gly Lys Phe Asp Leu Tyr Arg Lys785 790 795 800Arg Cys Gln Ile Ile Ile Phe Gln Val Val Phe Leu Gly Leu Leu Ala805 810 815Gly Leu Val Val Leu Phe Tyr Val Tyr Pro Val Arg Cys Glu Trp Cys820 825 830Glu Phe Leu Thr Cys Ile Pro Phe Thr Asp Lys Phe Cys Glu Lys Tyr835 840 845Glu Leu Asp Ala Gln Leu His850 85权利要求
1.一种基本上纯的多肽，其选自(a)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，其中一或多个氨基酸被置换、删除、插入、和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的蛋白质等同的生物活性；和(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO15的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ IDNO16的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
2.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1的多肽。
3.一种载体，其包含权利要求2的多核苷酸。
4.一种宿主细胞，其含有权利要求2的多核苷酸或权利要求3的载体。
5.一种制备权利要求1的多肽的方法，所述方法包括以下步骤(a)培养权利要求4的宿主细胞；(b)使该宿主细胞表达所述多肽；和(c)收集表达的多肽。
6.一种抗体，其与权利要求1的多肽结合。
7.一种多核苷酸，所述多核苷酸与权利要求2的多核苷酸或其互补链互补并包含至少15个核苷酸。
8.一种反义多核苷酸或小干扰RNA，其针对权利要求2的多核苷酸。
9.权利要求8的反义多核苷酸，其核苷酸序列包含SEQ ID NO11的核苷酸序列。
10.权利要求8的小干扰RNA，其有义链包含SEQ ID NO13的核苷酸序列。
11.一种诊断细胞增生性疾病的方法，所述方法包括以下步骤(a)检测受试生物样品中编码SEQ ID NO16的氨基酸序列的基因的表达水平；和(b)使所述表达水平的升高与所述疾病相关联。
12.权利要求11的方法，其中所述表达水平通过选自下组的任一方法进行测定(a)检测编码SEQ ID NO16的氨基酸序列的mRNA，(b)检测包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的蛋白质，和(c)检测包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的蛋白质的生物活性。
13.筛选用于治疗细胞增生性疾病的化合物的方法，所述方法包括以下步骤a)将受试化合物与选自下组的多肽接触(1)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(2)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，其中一个或多个氨基酸被置换、删除、插入、和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的蛋白质等同的生物活性；和(3)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO15的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性；b)检测所述多肽与受试化合物的结合活性；和c)选择与所述多肽结合的化合物。
14.筛选用于治疗细胞增生性疾病的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)将候选化合物与细胞接触，所述细胞表达含SEQ ID NO15所示核苷酸序列的多核苷酸；和(b)选出使所述多核苷酸的表达水平与没有该受试化合物时检测到的表达水平相比降低的化合物。
15.筛选用于治疗细胞增生性疾病的化合物的方法，所述方法包括以下步骤a)将受试化合物与选自下组的多肽接触(1)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(2)包含SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，其中一个或多个氨基酸被置换、删除、插入、和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的蛋白质等同的生物活性；和(3)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO15的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQID NO16的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性；b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和c)选出与缺乏该受试化合物时检测到的所述多肽的生物活性相比抑制该多肽生物活性的化合物。
16.权利要求15的方法，其中所述生物活性是促细胞增殖活性。
17.筛选用于治疗细胞增生性疾病的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)将候选化合物与导入了载体的细胞接触，所述载体包含标记基因的转录调节区以及在该转录调节区控制下表达的报告基因，其中所述标记基因包含SEQ ID NO15的核苷酸序列，(b)测定所述报告基因的活性；和(c)选出使所述报告基因表达水平与缺乏所述受试化合物时检测到的表达水平相比降低的化合物。
18.权利要求11-17的方法，其中所述细胞增生性疾病是癌症。
19.一种治疗细胞增生性疾病的组合物，所述组合物包含药物有效量的反义多核苷酸或小干扰RNA作为有效成分并含有可药用的载体，其中所述反义多核苷酸或小干扰RNA针对编码选自下组的多肽的多核苷酸(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ ID NO15的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
20.一种治疗细胞增生性疾病的组合物，所述组合物包含药物有效量的抗多肽抗体作为活性成分并含有可药用的载体，其中所述多肽选自(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且其具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO15的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ IDNO16的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
21.一种用于治疗细胞增生性疾病的组合物，所述组合物包含药物有效量的化合物作为活性成分并包含可药用的载体，所述化合物通过权利要求13-17任意一种方法选出。
22.权利要求19-21之一的组合物，其中所述细胞增生性疾病为癌症。
23.一种用于治疗细胞增生性疾病的方法，所述方法包括给予药物有效量的反义多核苷酸或小干扰RNA的步骤，该反义多核苷酸或小干扰RNA针对编码选自下组的多肽的多核苷酸(1)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(2)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(3)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO15的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ IDNO16的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
24.一种用于治疗细胞增生性疾病的方法，所述方法包括给予药物有效量的抗多肽抗体的步骤，所述多肽选自(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽，所述多肽中一或多个氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ IDNO15的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ IDNO16的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
25.一种用于治疗细胞增生性疾病的方法，所述方法包括给予药物有效量的化合物的步骤，所述化合物通过权利要求13-15任意一种方法选出。
26.权利要求23-25之一的组合物，其中所述细胞增生性疾病为癌症。
27.一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括给予药物有效量的多肽或编码该多肽的多核苷酸的步骤，所述多肽选自(a)-(c)之一(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多个氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且该多肽具有与含SEQ IDNO16的氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽或其片段，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ ID NO15的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
28.一种诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括将选自(a)-(c)之一的多肽与抗原递呈细胞接触的步骤(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多个氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ IDNO16的氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽或其片段，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ ID NO15的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
29.权利要求28的诱导抗肿瘤免疫的方法，其中该方法进一步包括将所述抗原递呈细胞给予受试者的步骤。
30.一种治疗或预防癌症的药物组合物，所述组合物包含药物有效量的多肽或编码所述多肽的多核苷酸，其中所述多肽选自(a)-(c)之一(a)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段；(b)含有SEQ ID NO16的氨基酸序列的多肽或其片段，所述多肽中一或多个氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，并且该多肽具有与由SEQ IDNO16的氨基酸序列组成的蛋白等同的生物活性；和(c)多核苷酸编码的多肽或其片段，所述多核苷酸在严谨条件下与由SEQ ID NO15的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO16的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
全文摘要
本发明提供了新的人基因RHBDFI，其在CML和AML中的表达与在正常外周血细胞中的表达相比明显提高，且在肺腺癌中的表达与正常肺细胞中的相比明显提高。所述基因及其编码的多肽，可用于例如诊断细胞增生性疾病，以及作为研发抗所述疾病药物的靶分子。
文档编号C12Q1/68GK1701079SQ0382537
公开日2005年11月23日 申请日期2003年7月29日 优先权日2002年9月30日
发明者中村佑辅, 片桐丰雅 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司, 国立大学法人东京大学