专利名称：新城疫病毒hn和鸡贫血病毒vp3基因联合抗肿瘤生物制剂的制作方法
技术领域：
本发明提供3个新城疫病毒(NDV)HN及鸡贫血病毒凋亡素基因(VP3)的真核重组表达载体，属于生物技术领域。
背景技术：
真核重组系统不同于任何传统疫苗或基因工程疫苗，它是将少量携带基因疫苗表达质粒的宿主菌，接种普通细菌生长培养基，即可得到大量无限复制的真核重组质粒。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)弱毒株能选择性杀伤人和动物的多种肿瘤细胞，而对正常人的细胞无作用。与NDV弱毒株相似，鸡贫血病毒(chickenanemia virus，CAV)的凋亡素基因(VP3)具有广泛的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。将NDV和CAV的抗肿瘤基因插入真核表达载体，即可获得表达抗肿瘤基因的重组体。以此重组体转染真核细胞，可获得抗肿瘤的特异蛋白。给动物和人注射时，可刺激机体产生特异性的抗肿瘤反应。因此该重组体可用于人和动物的肿瘤防治。
到目前为止，国内外用NDV抗肿瘤大多利用NDV的完整病毒来进行治疗。虽然NDV一般对人无致病性，但有时也可引起人的轻度感染。人受NDV感染后，潜伏期约48h，引起急性结膜炎或喉炎，偶尔也可侵害角膜，有时还可出现中度的体温升高。NDV完整病毒治疗肿瘤病人，另一个存在的隐患是有可能造成病毒的扩散。
新城疫病毒是副粘病毒科腮腺炎病毒属的成员，含有6种病毒特异性结构蛋白(L、NP、HN、F、M、P)。通过我们实验及NDV的分子基础分析，证明HN糖蛋白均为重要宿主保护性免疫原，使诱导机体产生各种细胞因子，在肿瘤作用方面有着独特的作用。
实验证明，NDV能选择性杀伤多种肿瘤细胞。NDV完整病毒及NDV HN构建的真核重组体，可显著去除肿瘤细胞表面的唾液酸，使被唾液酸掩盖的肿瘤细胞表面抗原决定簇暴露，增强肿瘤细胞相关抗原的免疫原性，引起宿主有效的抗肿瘤反应。
鸡贫血病毒是一种诱导细胞凋亡的新病毒，其基因产物不表现与任何已知蛋白的同源性。CAV基因组克隆显示有3个主要ORFVP1、VP2及VP3。VP3由121个氨基酸组成，为鸡贫血病毒的功能蛋白，主要是引发CAV引起的细胞凋亡。通过免疫荧光测定发现，VP3位于细胞核，随着VP3表达的积累，细胞形成凋亡小体。
从上分析可知NDV HN抗肿瘤是通过作用于细胞膜改变肿瘤细胞的抗原性及刺激抗体产生细胞因子等机制发挥作用，而CAV的VP3则通过VP3与细胞核的有关成分结合起到抗肿瘤作用。目前，国内外还没有利用NDV HN核酸疫苗抗肿瘤的报道，更没有NDV HN和VP3联合抗肿瘤的记载。本申请人首次将构建NDV HN核酸疫苗用于抗肿瘤，首次创立HN和VP3联合抗肿瘤的新策略。
发明内容
本发明提供NDV HN、CAV VP3及HN VP3的真核重组体及表达产物，以期用于人和动物肿瘤的防治。
本发明的方案是这样实现的3个可用于肿瘤防治的真核重组体。在表达载体的启动子下游，插入HN、VP3，构建可表达HN、VP3的重组体。将含NDV的HN分别插入pIRESlneo、pVAX1的多克隆位点，分别构建pIRHN、pVHN。将CAV的VP3插入pIRHN中，构建成pIRHNVP3。将CAV的VP3插入pVAX1的多克隆位点，构建成pVVP3。其中，pIRHNVP3是运用一个载体同时插入HN和VP3两个基因同时表达HN蛋白和VP3蛋白，用于抗肿瘤；而pVHN和pVVP3则是在相同载体分别插入HN、VP3基因，各自表达HN和VP3蛋白，将两个重组体混合在一起抗肿瘤。
构建成的这些真核表达重组体及其产物，可用于人和动物肿瘤的防治。这些真核重组质粒及其表达产物不仅可作用于体外的肿瘤细胞，而且可作用于体内的肿瘤细胞。
本发明的优点和积极效果为1.以含NDV的HN基因的真核重组体取代完整病毒，可克服完整病毒引起的副作用，具有可靠的安全性。2.NDV HN抗肿瘤的机制与CAV VP3抗肿瘤的机制不同。本发明创建了利用HN和VP3联合抗肿瘤的新策略。3.本发明所用的真核载体pIRES1neo，其启动子和增强子来源于在真核细胞中具有较大活性的人巨细胞病毒(CMV)直接早期区。另外，本载体的一个重要特征就是在多克隆位点和新霉素抗性基因(neo)之间有一外来源于脑心肌炎病毒的核糖体结合位点(IRES)，这一元件解决来源于同一mRNA的两个开放读框正确表达。真核载体pVAX1为卡那霉素抗性选择标志代替氨苄青霉素，由pVAX1构建的核酸疫苗更具开发应用价值。4.构建的表达重组体，既可用于肿瘤的预防，又可用于肿瘤的治疗。5.生产简单，成本低廉，稳定性好，贮运方便。
图1所示的为真核重组体克隆过程。①人工合成针对NDV HN的一对引物P1、P2，P1含有BamHI酶切位点，P2含有XbaI酶切位点。提取NDV的RNA，进行RT—PCR。将RT-PCR产物回收，利用BamHI和XbaI双酶切插入pBluescript II KS(-)中，测序。②人工合成针对CAV VP3的一以引物P5、P6，P5、P6各含有一个EcoRI位点。提取CAV基因组DNA，进行PCR扩增。回收PCR产物，利用EcoRI酶切插入pBluescriptII，ks(-)中，测序。③将pKSHN中的HN基因插到pIRES1neo的多克隆位点，构建成pIRHN。④在pIRHN基础上，将pKSVP3的VP3基因取代新霉素基因，构建成pIRHNVP3。⑤pKSHN中的HN基因插入到pVAX1的BamHI和XbaI之间，构建成pVHN。⑥将pKSVP3中的VP3基因插入到pVAX1的多克隆位点，构建成pVVP3。
图2所示的为NDV HN基因的核苷酸序列。
图3所示的是CAV VP3基因的核苷酸序列。
实施方式下面通过表达载体的构建与应用方法叙述本发明的实施例(一)DNA重组基本操作方法1.大肠杆菌感受态细胞的制备与转化大肠杆菌感受态细胞制备，采用氯化钙制备法，具体方法参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1998)，第55～56页。只是采用由0.75mmol/L Tris-HCl代替水为溶剂配制0.1mol/L CaCl2。感受态细胞的转化方法，参照上述参考文献进行。2.质粒的大量制备参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1998)，第26～28页，采用碱裂解法制备，用PEG沉淀法纯化。具体操作方法如下，离心收获经质粒转化、培养后的菌体，用STE悬浮、洗涤菌体一次，然后用特殊TE(10mmol/L Tris，50mmol/L EDTA pH8.0)悬浮沉淀。加入2倍体积的溶液II裂解，加入1.5倍体积的溶液III中和，离心后取上清，加入0.7倍体积的异丙醇沉淀。离心弃上清。用TE(pH8.0)溶解沉淀，加入等体积的5mol/L LiCl，离心去除大分子RNA。移出上清至一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀DNA。加适量70％乙醇洗涤沉淀一次，凉干。用TE溶解沉淀，加入无DNA酶的RNA酶至终浓度为20μg/ml去除RNA。加入等体积的PEG溶液(20％PEG 6000，2.5mol/L NacCl)混匀，置4℃过夜后离心，弃上清。用TE溶解沉淀，用饱合酚、酚氯仿，按顺序各抽提一次，然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗涤沉淀一次，凉干，最后溶于TE(pH8.0)中备用。3.质粒的限制性内切酶消化与DNA片段的回收质粒的限制性内切酶消化均参照下列反应条件进行，每微克质粒DNA用5单位限制性内切酶消化，加1/10体积的限制性内切酶反应缓冲液，加灭菌二馏水调整反应总体积为所用限制性内切酶体积的10倍，按各种限制性内切酶的供应商推荐的反应温度反应2～3小时。质粒用限制性内切酶消化后，DNA片段的回收采用DEAE-纤维素膜电泳回收法，具体方法参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1998)，第319～321页。本发明采用DE-81离子交换纸(Whatman公司产品)代替DEAE-纤维素膜。4.线性质粒的末端去磷酸化和DNA片段的连接酶切后线性质粒的末端去磷酸化，采用小牛小肠碱性磷酸酶(CIP)，具体操作参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1998)，第40～41页。去磷酸化反应后，CIP的灭活采用5mmol/L EDTA(PH8.0)存在下，75℃加热10min。然后用酚氯仿抽提去除CIP，乙醇沉淀去磷酸化后的线性质粒，溶于灭菌双馏水中，用于连接反应。
线性质粒与DNA片段的连接反应按GIBCO-BRL公司提供的T4DNA连接酶推荐的条件进行。粘性末端的连接按质粒载体目的DNA片段的摩尔比＝1∶2，25℃连接1h。平末端的连接采用质粒载体目的DNA片段摩尔比＝1∶5的比例，14～16℃，连接17～24h，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。5.重组质粒的筛选与鉴定将连接反应物转化感受态细菌，涂于含抗生素的平板上，挑选过夜培养长出的单菌落，接种于2ml LB液体培养基中，培养16～20h。然后参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1998)，第19～22页介绍的碱裂解法小量制备质粒，以空载体质粒作对照进行质粒的琼脂糖凝胶电泳，挑选重组质粒，作限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳，鉴定插入的目的基因及其插入方向。(二)HN和VP3核酸表达质粒的构建1.pIRHNVP3重组体的构建①HN的克隆 针对NDV的HN设计引物。针对HN设计的引物为P15’CGGGATCCTCAGTCATGGACCGCGCAGTT3’；P2 5’GCTCTAGATAGGTGACACAATGTCATCTTTCC3’。从分离鉴定的NDV长春株中提取RNA，进行RT-PCR。RT-PCR的具体操作，参照TaKaRa RNA LA PCRTM kit说明进行。RT反应条件为30℃10min，42℃1h，99℃5min，5℃5min。PCR反应条件为94℃，120s 1次；94℃50s、55℃45s、72℃90s，30个循环；最后72℃10min。将RT-PCR产物回收，利用BamHI和XbaI双酶切插入pBluescriptII KS(-)中，测序。其策略如附图1所示。②VP3的克隆 针对CAV病毒的VP3基因设计引物P35’CGAATTCATGAACGCTCTCCAAGAAG3’，P45’CGGAATTCTTACAGTCTTATACGCC3’。从鸡贫血病毒毒株中，提取病毒基因组DNA，进行PCR。PCR反应条件94℃50s，52℃50s，72℃1min，35个循环后，72℃延伸10min。回收PCR产物，利用EcoR I酶切将VP3基因插入pBluescriptII KS(-)中，其策略如附图1所示。③用EcoRV消化PIRES1neo，回收pIRS1片段，去磷。用BamHI和XbaI消化pKSHN，回收HN基因片段，Klenow进行末端补平。将回收的HN插入pIRES1的EcoRV位点，得到含HN的表达质粒pIRHN。构建策略见图1。④将PIRVP3用EcoRV消化，回收pIRVP3，进行末端补平和去磷酸。用BamHI和XbaI消化pKSHN，回收HN基因，Klenow进行末端补平。将回收的HN基因，插入到pIRVP3的EcoRV位点。构建策略见图1。2.pVHN表达载体的构建用BamHI和XbaI消化pKSHN，回收HN基因。用BamHI和XbaI消化pVAX1，回收pVAX1。将HN插入到pVX1的BamHI和XbaI之间，构建策略见图1。3.pVVP3表达载体的构建。
将pVAX1用EcoRI消化，回收pVAX1片段。用EcoRI消化pKSVP3，回收VP3基因。将回收的VP3基因插入到pVAX1的EcoRI位点，构建策略见图1。4.细胞转染方法(除本发表所介绍的转染方法外，还可用其它将DNA转染进行细胞的方法。
在500ulRPMI1640中，加入10ulDTAP，轻轻混匀，另取500ulRPMI 1640加入重组质粒2.0ug混匀，温育30min，然后将后者滴加于前一液体中，混匀，室温下作用30min，备转染。于60min×30min培养板中接种HeLa细胞或骨肉瘤细胞(OS-732细胞)2×105/ml，每孔2ml，待细胞长至60-70％单层时，吸去培养液，用不含血清和抗生素的RPMI1640洗二次。加入备转染液，在5％CO2、37℃作用12h。吸去转染液，加入10％FBS的RPMI1640 2ml，继续培养48h，收获细胞，备检测。(三)抗肿瘤效应观察测1.观测指标(1)细胞抑制率测定转染细胞培养72小时后，用台盼兰染色法计算细胞数量。(2)表达产物的血凝试验用1％鸡红细胞作血凝素效价测定。具体操作参照殷震、刘景华主编《动物动物病毒学》第二版，科学出版社(1997)，第445-448页。(3)间接免疫荧光鉴定重组质粒表达产物取适量的重组细胞，接种于玻片上，同时用正常细胞做对照，待凉干后，用PBS(PH7.2)洗一次，用10％丙酮固定10-15分钟，PBS冲洗后，与一抗阳性血清反应用2小时，PBS洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光黄(FITC)标记的二抗反应2小时，PBS洗涤3-5次，将载有细胞的飞片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察和拍照。(4)Western bloting鉴定重组质粒表达蛋白将收获的转染细胞用细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl，pH7.4～8.0，1mmol/L MgCl2，0.5％NP-40，20μg/ml DnaseI)裂解后，加等量2×SDSloading Buffer混合，1 00℃水浴煮沸3min，作SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜上。用封闭液(用TBS配制3％BSA，0.05％Tween-20)室温封闭1～2h，然后用TBS(10mmol/L Tris.Cl(pH7.5)，150mmol/L NaCl)液漂洗两次，再与抗目的蛋白的抗体室温感作2h，用TBS液漂洗三次，每次10分钟。然后与碱性磷酸酶标记的第二抗体(1∶500)室温感作2h，再用TBS液漂洗三次，最后用碱性磷酸酶缓冲液配制的NBT和BCIP显色液显色，适时终止显色反应。(5)转染细胞的TUNEL染色转染细胞涂片，干燥，用4％多聚甲醛固定1小时，用PBS冲洗，渗透液(0.1％Triton X-100，0.1％柠檬酸钠)4℃作用2分钟，PBS漂洗2次，干燥，在样品上滴加50ulTUNEL反应液，置湿盒中，37℃作用60分钟，PBS漂洗3次后，擦干样品周围的水分，然后加入50ul Converter-Ap，置于湿盒中，37℃作用30分钟，PBS漂洗3次，加入50-100ul Ap底物溶液，室温下反应10分钟，PBS洗3次，加盖玻片，光镜下观察。(6)PCR检测VP3的表达提取转染细胞的RNA，RNA的提取参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1998)，第345～349页。提取转染细胞的RNA后，按VP3克隆的方法进行PCR。
(7)电泳提取转化了上述三种重组体(72小时)的细胞基因组DNA进行电泳。细胞基因组DNA的提取按Prigent P等(1993)在J Immunological Methods第160期第139-140页发表的的方法进行。2.观测结果构建的核酸表达质粒分别转染HeLa细胞、OS-732(骨肉瘤)细胞、B16(鼠黑色素)细胞、S-180(鼠肉瘤)细胞、Hep-2(人喉癌)细胞和正常人的细胞等，转染细胞的存活率显著降低。经间接免疫荧光试验证实，在转染的细胞膜和细胞浆中，均可观察到特异的黄绿色荧光，说明表达产物是特异的；经Westernblot分析，出现了与抗HN单抗结合的74KD的特异带，证明HN蛋白在真核细胞中得到了表达。血凝试验证实表达产物具有血凝活性。提取转染细胞RNA，运用针对VP3基因的引物进行PCR，获得了363bp的特异电泳带，证明VP3基因在真核细胞已经表达。TUNEL染色和基因组DNA电泳，证实pIRHNVP3或pVHN和pVVP3具有很强的肿瘤细胞坏死和凋亡作用，而对正常细胞无影响。
权利要求
1.可用于肿瘤防治的真核重组体，其特征在于将含新城疫病毒HN分别插入pIRES1neo、pVAX1的多克隆位点，分别构建pIRHN、pVHN；将鸡贫血病毒凋亡素基因(VP3)插入pIRHN中，构建成pIRHNVP3；将鸡贫血病毒凋亡素基因(VP3)插入pVAX1的多克隆位点，构建成pVVP3。
2.根据权利要求1所述的真核重组体，其特征在于新城疫病毒HN基因的核苷酸序列是说明书附图2所述的序列。
3.根据权利要求1所述的真核重组体，其特征在于鸡贫血病毒凋亡素基因(VP3)的核苷酸序列是说明书附图3所述的序列。
4.一种权利要求1所述的真核重组体的用途，其特征在于pIRHNVP3是运用一个载体同时插入HN和VP3两个基因并同时表达HN蛋白和VP3蛋白，用于防治肿瘤；pVHN和pVVP3则是在相同载体中分别插入HN、VP3基因，各自表达HN和VP3蛋白，将两个重组体混合在一起用于防治肿瘤。
全文摘要
本发明提供3种能表达新城疫病毒HN基因及鸡贫血病毒VP3基因的联合抗肿瘤作用的核酸疫苗,分别为pIRHNVP3、pVHN和pVVP3。其中,pIRHNVP3转染真核细胞后,能同时表达HN蛋白和VP3蛋白;pVHN和pVVP3混合后转染亦能获得HN蛋白及VP3蛋白。这些核酸疫苗及特异蛋白可用于人和动物肿瘤的防治。
文档编号C12N15/79GK1330148SQ0112023
公开日2002年1月9日 申请日期2001年7月11日 优先权日2001年7月11日
发明者金宁一, 龚伟, 薛立娟, 丁壮, 葛涛, 金扩世, 郭志儒, 王宏伟, 李萍 申请人:中国人民解放军军需大学军事兽医研究所