一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程和视网膜损伤【技术领域】，具体涉及一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物中的应用。本发明构建的一种携带Neuritin基因的慢病毒，用于视网膜色素上皮细胞变性动物模型，进行相关指标的检测，证实Neuritin慢病毒载体能成功转染大鼠RPE并高表达，进而保护视网膜的RPE、视细胞等并改善功能恢复。
【专利说明】-种携带Neurit in基因的慢病毒在制备修复视网膜色素 上皮变性药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和视网膜损伤【技术领域】，具体涉及一种携带Neuritin基因 的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 视网膜色素上皮细胞（RPE)位于视网膜和脉络膜之间，具有吞噬、屏障及离子转运 等多种功能。RPE变性是一组以视网膜光感受器细胞和RPE的渐进性凋亡以及死亡为结局， 引起视力下降和视野缺损等为共同表现的疾病，具有遗传倾向性，现已经有100多个的相 关基因被发现。该病发病率较高，约1/4000,是致盲性疾病的关键环节。（参考文献[1] Sung CH，Chuang JZ. The cell biology of vision. J Cell Biol2010; 190:953-63)。而且目前 对这些疾病还没有有效的治疗措施，几乎不可避免的致盲，引起人们的广泛关注和研究。另 夕卜，年龄相关性黄斑变性，也称老年黄斑变性（AMD)，是当前中老年人致盲的主要原因，至今 仍未找到一种能阻止本病病程进展的确切有效的治疗方法。黄斑区RPE细胞损伤往往被认 为是其始动环节，受损RPE对视细胞外界盘膜吞噬消化功能下降，最终导致黄斑变性发生。 越来越多的眼底病与RPE细胞凋亡有关，如遗传性外层视网膜营养不良以及视网膜移植术 后等。因此，抑制RPE细胞凋亡就成为治疗上述疾病的关键。
[0003] 视网膜色素上皮变性（Retinitis pigmentosa, RP)的治疗，目前已出现针对致病 基因的基因治疗、针对RP发生机制的药物治疗（如干预视蛋白循环通路以减少代谢产物的 堆积，阻滞Ca2+通道等）、神经保护治疗（如神经营养因子，抗凋亡因子等）以及旨在恢复 视功能的细胞、组织移植或人工视觉等多种方法，但尚无一种方法能够完全阻止RP发展或 恢复受损视功能。（参考文献[2]Hamel C. Retinitis pigmentosa. Orphanet J Rare Dis， 2006,1 :40.)。由于RP具有显著的遗传异质性，从病因学角度治疗RP难度较大，但神经营 养因子治疗RP的疗效受致病基因差异的影响较小，因而其对RP变性视网膜组织的神经保 护效应一直成为研究热点。（参考文献[1]张湘，李根林.神经营养因子治疗视网膜色素变 性的研究进展.中华眼科杂志2009年9月第45卷第9期：855-859.)
[0004] 神经营养因子可直接作用于RPE、光感受器细胞或间接作用于视网膜其他细胞 进而促光感受器细胞存活。神经营养因子中，神经生长因子（nerve growth factor, NGF)、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、睫状神经 营养因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、喊性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF)、色素上皮源性生长因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF)、表皮细胞生长因子及肝细胞生长因子等，均显示可增强RPE增殖、减少 RPE凋亡，增加光感受器细胞存活，缓解视功能减退，部分神经营养因子联合使用还具有 协同作用。但神经营养因子的应用受到一定限制，主要原因是：（1)具有生物活性的生长 因子半衰期短，而且局部使用时易被稀释，难以保持有效的浓度，需反复多次给药或增加 使用剂量；（2)提取或基因重组的生长因子价格昂贵；（3)已经证明内源性合成的蛋白与 外源重组蛋白相比，生物活性更高。因此，目前人们主要致力于神经营养因子的基因转 移治疗 RP。（参考文献[3]Brian Rossmiller，Haoyu Mao, Alfred S.Lewin.Review:Gene therapy in animal models of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Molecular Vision2012;18:2479-2496.)
[0005] 如NGF能拮抗神经细胞谷氨酸毒性、缺氧损伤，能抑制视网膜RPE细胞凋亡的发 生。它还通过刺激BDNF、bFGF、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子等因子的分泌而对 遗传性视网膜色素变性动物模型的光感受器起保护作用。（参考文献[4]Lenzi L，Coassin M, Lambiase A, Bonini S, Amendola T, Aloe L. Effect of exogenous administration of nerve growth factor in the retina of rats with inherited retinitis pigmentosa. Vision Res. 2005Jun; 45 (12) :1491-500.)神经生长因子腺病毒载体注射入视网膜下腔，能 转染所有RPE，使遗传性视网膜色素变性RCS大鼠视细胞得以营救，使其凋亡的发生推迟。 (参考文献[5]刘世全，张薇，贾东辉，等.腺病毒介导神经生长因子对遗传性视网膜变 性RCS大鼠视细胞的营救.北京医科大学学报，2000, 32 (5) : 403-407.)
[0006] BDNF对视网膜色素变性疾病的有效性己得到了证实。在体电穿孔辅助BDNF 基因转染至RPE和神经节细胞层，能减少RCS大鼠 RPE凋亡，延缓其视网膜色素变性的 病程。（参考文献[6]Zhang Μ, Mo X，Fang Y, Guo W，Wu J, Zhang S, Huang Q. Rescue of photoreceptors by BDNF gene transfer using in vivo electroporation in the RCS rat of retinitis pigmentosa. Curr Eye Res. 2009Sep;34(9):791-9.)
[0007] GDNF治疗RP动物模型可维持光感受器细胞存活，并保存视功能。Ohnaka等用GDNF 腺相关病毒载体能转染视网膜退行性变小鼠 rdlO的RPE和视细胞并高表达，能有效减缓视 细胞变性的程度。（参考文献[7]0hnaka M，Miki K, Gong YY, Stevens R，Iwase T，Hackett SF, Campochiaro PA. Long-term expression of glial cell line-derived neurotrophic factor slows,but does not stop retinal degeneration in a model of retinitis pigmentosa. J Neurochem. 2012Sep;122(5):1047-53.)
[0008] bFGF是公认的光感受器存活因子，能够挽救光感受器的变性，恢复RPE细胞吞 噬功能，治疗RP。RCS (royal college of surgeons)鼠是公认的遗传性视网膜病变动 物模型。RCS鼠的RPE细胞对于光感受器外节盘膜的吞噬功能缺陷，bFGF在7?10d 的RCS鼠 RPE细胞的表达减少。对RCS鼠原代培养的RPE，加入bFGF后能恢复细胞的 吞噬功能。（参考文献[8]McLaren MJ，Inana G. Inherited retinal degeneration: basic FGF induces phagocytic competence in cultured RPE cells from RCS rats. FEBS Lett，1997, 412:21-29.)将牛bFGF重组腺相关病毒载体注射到视网膜变性转 基因鼠的视网膜下腔，提高了眼大量光感受器细胞存活，降低了光感受器的变性机率， 并且没有观察到显著的炎症反应和新生血管化。（参考文献[9]Lau D，McGee LH，Zhou S, Rendahl KG, Manning WC, Escobedo JA, Flannery JG. Retinal degeneration is slowed in transgenic rats by AAV-mediated delivery of FGF-2. Invest Ophthalmol Vis Sci. 20000ct;41 (11):3622-33.)
[0009] 猿猴慢病毒为载体介导PEDF转基因治疗RCS大鼠，能转染RPE并高表达PEDF，减 少光感受器细胞凋亡，并可维持视功能。（参考文献[l0]Miyazaki M，Ikeda Y，Yonemitsu Y，Goto Y，Sakamoto Τ，Tabata Τ，Ueda Υ，Hasegawa Μ，Tobimatsu S，Ishibashi T，Sueishi K.Simian lentiviral vector-mediated retinal gene transfer of pigment epithelium-derived factor protects retinal degeneration and electrical defect in Royal College of Surgeons rats. Gene Ther. 2003Aug;10 (17):1503-11.)
[0010] 目前，以腺相关病毒为载体的转基因和细胞包囊技术作为神经营养因子的给药 途径在多种RP动物模型上取得较好疗效，神经营养因子与针对致病基因的病因学治疗 和（或）细胞移植技术联合应用可能获得优劣互补、相得益彰的效果。基因治疗的出现， 给我们的研究带来了新的曙光，但基因治疗存在病毒载体潜在安全性等问题。慢病毒载 体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组能长期表达、免疫反应小，适于 体内基因治疗，已批准进行临床研究。慢病毒载体较其他病毒载体，特别易于转染RPE和 Mllller细胞。（参考文献[ll]Kostic C，Chiodini F，Salmon P，Wiznerowicz M，Deglon N，et al.Activity analysis of housekeeping promoters using self-inactivating lentiviral vector delivery into the mouse retina. Gene Ther，2003, 10:818 - 82L 参 考文献[12]Mats Hellstr5m and Alan R. Harvey. Retinal Ganglion Cell Gene Therapy and Visual System Repair. Current Gene Therapy, 2011, 11, 116-131.)
[0011] Neuritin(又名CPG15)是Nedivi等1993年通过构建海人藻酸激活型大鼠海马齿 状回cDNA文库得到的一个基因。人类的Neuritin基因位于染色体6P2513,全长2072bp， 开放读码框为426bp，表达的蛋白含有142个氨基酸，其中第1?27个氨基酸为信号肽， 第116?142个氨基酸为糖基磷脂酰肌醇（glycolsylphosphatidlinositol，GPI)锚定位 点。人类与鼠类、爪蟾的Neuritin基因经同源性比较分析分别为98%、88%，具有高度的保 守性，提示Neuritin在不同物种胚胎发育过程中发挥着重要的作用。成熟的Neuritin蛋 白是小分子量的糖蛋白，以可溶性和膜蛋白两种形式存在，膜蛋白以GPI锚定位点锚定在 细胞膜上。（参考文献[13]Loebrich S，Nedivi E. The function of activity-regulated genes in the nervous system. Physiol Rev. 2009, 89 (4) :1079-103.参考文献[14]Leslie JH, Nedivi E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Prog Neurobiol, 2011, 94:223 - 237.)
[0012] Neuritin在神经系统的表达、调节及作用。Neuritin高表达于神经系统，发育 时主要在新大脑皮质、海马、嗅球，成年后仅表达在发生结构改变并与神经活动密切相 关的组织，如海马、嗅球、小脑蒲肯野细胞。Neuritin是活动依赖性表达的神经营养因 子（NTF)。神经活动可诱导Neuritin蛋白的表达。生理性刺激如光刺激、触觉刺激以及 电刺激可诱导Neuritin的表达，促进树突和轴突的生长和突触成熟，调节突触回路的形 成?而众多 NTF 如 NGF (参考文献[15]Karamoysoyli E，Burnand RC，Tomlinson DR，et al. Neuritin mediates nerve growth factor-induced axonal regeneration and is deficient in experimental diabetic neuropathy. Diabetes，2008,57 (1):181-189.)、 BDNF (参考文献[16]Naeve GS，Ramakrishnan M，Kramer R，et al. Neuritin:a gene induced by neural activity and neurotrophins that promotes neuritogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A，1997,94(6) :2648-2653.)、神经营养素-3 (NT-3)、神 经胶质源性神经营养因子（GDNF)(参考文献[17]Pahnke J，Mix E，Knoblich R，et al.Overexpression of glial cell line-derived neurotrophic factor induces genes regulating migration and differentiation of neuronal progenitor cells. Exp Cell Res，2004, 297(2) :484-494.)等均能单独诱导 Neuritin 蛋白的表达，Neuritin 还是介导这些NTF发挥神经营养作用（促进神经元存活和突起生长）的关键下游因 子。Neuritin定位于神经元胞体和轴突，在轴突呈点状分布，以细胞内囊泡形式分泌至 细胞表面经GPI锚定在细胞膜上，通过募集AMPA受体到突触来促进突触成熟，促进突 触后树突树的发育。在发育期间，Neuritin还可阻止神经祖细胞ca SpaSe3的激活而 免于凋亡，能维持神经元的存活（参考文献[18]Putz U, Harwell C，Nodivi E.Soluble CPG15expressed during early development rescues cortical progenitors from apoptosis. Nat Neurosci, 2005, 8 (3) : 322-331.)。在体外培养神经兀，Neuritin 富 集于轴突伸出突起处和生长锥处，旁分泌促进邻近神经元突起的生长(参考文献[19] Cantallops I, Cline HT. Rapid activity-dependent delivery of the neurotrophic protein CPG15 to the axon surface of neurons in intact Xenopus Tadpoles. Dev Neurobiol, 2008, 68:744 - 759. )〇
[0013] Neuritin在视觉系统中主要分布在视网膜、视神经、外侧膝状体、视皮层及视上 丘。在视网膜，Neuritin mRNA仅表达于RGC中。Nedivi等发现Neuritin在大鼠视觉系统 发育过程中呈动态变化，先后高表达于外侧膝状体和视皮层，并与眼优势柱的形成有关。通 过光刺激可以诱导Neuritin在成年大鼠视皮层的表达。提示Neuritin在视觉系统发育和 功能调节中发挥重要作用。
[0014] Neuritin在神经系统伤后表达的变化。大鼠脑弥漫性轴索损伤(参考文献[20] 贺亚龙，贺晓生，章翔，等.候选可塑性相关基因15在大鼠脑弥漫性轴索损伤中的表达.中 华神经外科杂志，2010, 26 (2) :186-188.)、小鼠局部脑缺血（[21]Han Y，Chen X，Shi F，et al. CPG15, a new factor upregulated after ischemic brain iniury contributes to neuronal network reestablishiment after glutamate-induced injury.J Neurotrauma, 2007, 24:722-731·)、大鼠脊髓损伤（参考文献[22]Di Giovanni S,Faden AI, Yakovlev A, et al. Neuronal plasticity after spinal cord injury:identification of a gene cluster driving neurite outgrowth. FASEB J, 2005. 19, 153-154.)后，脑或 脊髓内Neuritin表达增强。席绍松、黎兴毅等蛛网膜下腔导管注入外源性Neuritin,能 促进大鼠急性脊髓损伤(改良Allen打击法）后伤区轴突再生相关蛋白神经丝蛋白200及 生长相关蛋白43 (growth associated protein 43, GAP-43)的表达，并能促进大鼠后肢运 动功能的恢复(参考文献[23]席绍松，刘维钢，张红，等.Neuritin蛋白对大鼠急性脊 髓损伤后神经元轴突再生的作用·中国修复重建外科杂志，2009, 23 (10) :1219-1223.)。 而Sharma等在大鼠面神经损伤后的面神经核神经元中，观察到Neuritin表达略低于正 常。雄激素、电刺激促进面神经再生必须通过Neuritin才能发挥作用（参考文献[24] Sharma N, Marzo SJ,Jones KJ,et al.Electrical stimulation and testosterone differentially enhance expression of regeneration-associated genes.Exp Neurol, 2010, 223:183 - 191.)。提示Neuritin在神经系统的创伤修复和治疗中具有重要 作用，极富应用前景。
[0015] 由上可见，Neuritin锚在轴突生长活跃区的细胞膜外或分泌至细胞外，与其他 NTF-样具有促进神经元存活及其突起生长和突触成熟的神经营养作用，特别是为众多 NTF发挥神经营养作用的关键的、共同的下游分子，在神经系统包括视觉系统的发育和功能 调节中至关重要，脊髓和视神经损伤后早期的表达量显著下调Neuritin，而同时轴突再生 夭折，推测Neuritin为影响神经轴突内在再生能力的关键和重要分子。
[0016] 本 申请人:长期以来致力于Neuritin的相关研究，已于2013年1月30日申请了中 国专利CN201310043613. 9,发明名称为"一种携带Neuritin基因的慢病毒及其在修复视神 经损伤中的应用"，并于2013年5月17日申请了中国专利CN201310182950. 6,发明名称为 "一种携带Neuritin基因的II型腺相关病毒及其在修复视神经损伤中的应用"。
[0017] 目前，尚未见Neuritin在RP后表达变化及作用的研究报道。
【发明内容】
[0018] 本发明的目的在于提供一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素 上皮变性药物(或称治疗RP药物）中的应用。
[0019] 本 申请人:认为，虽然RPE细胞不是神经细胞，但它是从神经外胚层分化而来的，受 到众多神经营养因子的作用。Neuritin具有独特的神经营养作用，且为其他神经营养因子 发挥作用的关键分子和共同下游分子，有可能也能作用于RPE。
[0020] 基于RPE变性和凋亡是RP发生的始动和关键因素；神经营养因子治疗RP为当今 研究热点和有效方法之一；Neuritin为其他神经营养因子发挥作用的关键分子和共同下 游分子。我们推测以Neuritin为靶点治疗RP，较单一神经营养因子为靶点治疗RP，可更强 地保护RPE，获得更好的功能恢复。由于外源性Neuritin如同其他NTF -样，在体内半衰期 较短，玻璃体注射Neuritin基因重组慢病毒以转染RPE，可使之持续高表达Neuritin,并可 观察Neuritin长期作用的效果。
[0021] 本发明的技术方案，主要是构建Neuritin的慢病毒载体，并在RP动物模型中 和体外培养的RPE受损细胞模型上，利用Neuritin的慢病毒载体感染RPE，观察并探讨 Neuritin基因治疗RP的作用及机制，为临床治疗RP提供新的有力手段和理论基础。
[0022] Neuritin基因，以下也称NRN1基因或Nrnl基因。
[0023] 本发明的第一方面，是提供一种携带Neuritin基因的慢病毒载体，该慢病毒载体 是携带如SEQ ID NO: 1所示的Neuritin基因的DNA序列。
[0024] 所述的慢病毒载体选用Tronolab系统为四质粒系统，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、 pMD2G和目的穿梭质粒。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE和pMD2G含有病毒包装所必须的元件， 目的穿梭质粒含有目的基因（Nrnl)以及标记基因红色荧光蛋白（RFP)。较优的，目的穿梭 质粒的多克隆位点插入如SEQ ID NO: 1所示的Neuritin基因的DNA序列。
[0025] 本发明的第二方面，提供了一种携带Neuritin基因的慢病毒载体的构建方法，具 体步骤如下：
[0026] 1. Neuritin基因慢病毒表达载体的构建
[0027] 根据 Neuritin (NRN1)基因（GenBank:BC002683. 2)设计并合成如下 PCR 引物：
[0028] NRN1-正向引物：5'-CGACGCGTATGGGACTTAAGTTGAAC-3'（SEQ ID N0:2);
[0029] NRN1-反向引物：5'-TTTGCGGCCGCTCAGAAGGAAAGCCA-3'（SEQ ID N0:3);
[0030] 使用PCR方法从含有NRN1基因 cDNA (155lbp，如SEQ ID NO: 1所示)克隆模板中 扩增NRN1基因 CDS区；将慢病毒载体和目的基因分别双酶切，纯化酶切产物后与NRN1基因 PCR产物进行定向连接或重组，其产物转化感受态细菌，对生长出的克隆进行Nrnl基因 PCR 鉴定，PCR鉴定为阳性的克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的 克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。将构建好 的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提，钙转法将质粒转入293T细胞，36-48小时后 通过荧光显微镜观察融合蛋白RFP。
[0031] 2. Neuritin基因慢病毒包装
[0032] 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别进行高纯度 无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后8小时更换为完全培养基，培养48小时后，收集富 含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，感染Hela细胞后采 用倍比稀释法检测病毒滴度。体内和体外实验对慢病毒滴度的要求不同，生产过程中可过 浓缩得到不同滴度的慢病毒颗粒。
[0033] 本发明的第三方面，提供了一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜 色素上皮变性药物(或称治疗RP药物）中的应用。
[0034] 所述的一种携带Neuritin基因的慢病毒，其Neuritin基因如SEQ ID NO: 1所示。
[0035] 所述的慢病毒载体选用Tronolab系统为四质粒系统，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、 pMD2G和目的穿梭质粒。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE和pMD2G含有病毒包装所必须的元件， 目的穿梭质粒含有目的基因（Nrnl)以及标记基因红色荧光蛋白（RFP)。较优的，目的穿梭 质粒的多克隆位点插入如SEQ ID NO: 1所示的Neuritin基因的DNA序列。
[0036] 携带Neurit in基因的慢病毒载体在制备治疗RP药物中的应用，临床上，具体可采 用玻璃体注射该药物进行RP的基因治疗。
[0037] 本发明所述的一种携带Neuritin基因的慢病毒，用于视网膜色素上皮细胞变性 动物模型，进行相关指标的检测，证实Neuritin慢病毒载体能成功转染大鼠 RPE并高表达， 进而保护视网膜的RPE、视细胞等并改善功能恢复。
[0038] 本发明基于Neuritin独特的神经营养作用及其在神经创伤、疾病中的表达变化 和作用，以Neuritin为靶标对RP进行基因治疗，以增强RP的内在再生能力，改善其存活。 并推测其对RPE和视细胞这两RP的关键细胞具有明显的作用，从而达到甚至超过给予多种 NTF、或多种治疗方法保护RPE的疗效，为临床治疗RP提供有力的手段和理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1是Neuritin慢病毒表达质粒载体构建图；
[0040] 图2是Neuritin慢病毒转染大鼠视网膜，视网膜切片显示慢病毒转染色素上皮层 (A、B、C),其中（A)为DAPI染核，核为蓝色；（B)箭头示Neuritin慢病毒转染色素上皮细 胞，呈红色荧光；（C) A与B合并的照片。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明 范围的限制。
[0042] 实施例1 :
[0043] 1. Neuritin基因慢病毒表达载体构建
[0044] ( 1)慢病毒表达载体及目的基因的酶切
[0045] 采用pLen〇-RIP (购自Addgene公司）载体使用Not I、Mlu I进行酶切，酶切后 的载体准备载体构建时使用（图1)。以NRN1基因 CDS区的cDNA克隆为模板采用PCR扩增 NRN1基因片段，产物使用Not I、Mlu I进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收载体及目的 基因 DNA。
[0046] (2)连接反应
[0047] 将酶切后的慢病毒载体和NRN1基因的PCR产物按照表1中的反应体系进行连接 反应。
[0048] 表1 :连接反应体系
[0049]
【权利要求】
1. 一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上皮变性药物中的应用， 所携带的Neuritin基因如SEQ ID N0:1所示。
2. 根据权利要求1所述的一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上 皮变性药物中的应用，其特征在于，所述的慢病毒载体选用Tronolab系统，为四质粒系统 由 pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G 和目的穿梭质粒；其中 pRsv-REV，pMDlg-pRRE 和 pMD2G 含 有病毒包装所必须的元件，目的穿梭质粒含有目的基因以及标记基因红色荧光蛋白。
3. 根据权利要求2所述的一种携带Neuritin基因的慢病毒在制备修复视网膜色素上 皮变性药物中的应用，其特征在于，目的穿梭质粒的多克隆位点插入如SEQ ID N0:1所示的 Neuritin基因的DNA序列。
【文档编号】A61P27/02GK104208721SQ201310219995
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年6月4日 优先权日:2013年6月4日
【发明者】许家军, 刘芳, 曹文珞, 蔺海燕 申请人:中国人民解放军第二军医大学