猪btg2基因在抗prrs病毒中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及猪BTG2基因在抗PRRS病毒中的新功能，具体提供了猪BTG2基因在抗PRRS病毒中的应用，其是通过BTG2基因在细胞中的过表达来抑制PRRS病毒在细胞中的复制。本发明还提供了利用BTG2基因表达量筛选抗PRRS病毒猪的方法，以及制备过表达BTG2基因的克隆胚胎的方法。
【专利说明】猪BTG2基因在抗PRRS病毒中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及猪BTG2基因在抗PRRS病毒中的新功倉泛。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，俗称“蓝耳病”是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的,该病毒是巢状病毒目动脉炎病毒科的一个成员，同属的病毒还有马动脉炎病毒，鼠乳酸脱氢酶酶病毒和猴出血热病毒。该病主要引起猪的繁殖与呼吸症状，表现为间质性肺炎和母猪流产木乃伊胎等，每年对全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。2007年在中国爆发了一场高热病，该病迅速在全国范围扩散，超过200万头猪被感染，40万头猪死亡，该病最后证实是由一种高致病性的蓝耳病毒引起的。PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞，现在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干扰素应答，体液免疫不能及时产生有效的中和抗体，而且会形成抗体依赖的病毒增强效应，最终导致免疫抑制和持续感染。由于该病毒的突变率极高，传统疫苗方法也不能有效控制该病，很多研究都致力于寻找RNAi，干扰素等新的方法来针对该病毒，用于弥补传统方法的不足。
【发明内容】
[0003]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与抗蓝耳病相关的新基因BTG2，及其通过对BTG2基因进行过表达，从而抑制PRRS病毒在细胞中的复制。
[0004]本发明的技术方案如下:
[0005]本发明首先提供了`猪BTG2基因在抗PRRS病毒中的应用，其是通过BTG2基因在细胞中的过表达来抑制PRRS病毒在细胞中的复制。
[0006]本发明还提供了一种过表达BTG2基因的载体。
[0007]作为优选，所述载体为导入BTG2基因⑶S序列的pCMV-Myc-N载体。
[0008]本发明还提供了含有所述载体的转基因细胞。
[0009]进一步地，所述转基因细胞为除胚胎细胞外的猪体细胞。
[0010]本发明还提供了一种制备克隆胚胎的方法，其以权利要求5所述转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。
[0011]本发明还提供了利用BTG2基因表达量筛选抗PRRS病毒猪的方法，所述方法为通过对猪的BTG2基因的表达量进行测定，BTG2表达量高的猪比BTG2表达量低的猪具有更高的抗PRRS病毒感染能力。
[0012]本发明的有益效果在于:
[0013]本发明所鉴定的与抗蓝耳病相关的新基因BTG2 (B-cell translocation gene2),有研究表明BTG2具有调节细胞周期G1/S转换的作用。本发明人首次利用生物信息学结合细胞生物学实验的方法，证明了 BTG2具有抑制PRRS病毒复制的作用。
[0014]本发明发现的新的抑制PRRSV复制的基因BTG2可以有以下两个用途:[0015]1.分析表明，相对于没有过表达BTG2基因的细胞，过表达BTG2基因的细胞可以显著抑制PRRS病毒的复制，因此，可以通过对猪的BTG2基因的表达量进行测定，BTG2表达量高的猪可能会比BTG2表达量低的猪更加抗PRRSV的感染，从而达到根据BTG2基因的表达量高低来筛选抗PRRSV的猪。
[0016]2.可以利用转基因等基因工程学的方法，使得BTG2基因在猪中的表达量升高，从而得到BTG2表达量高的猪，进而培育出抗PRRSV复制的猪。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明实施例1中转录组数据分析得到的BTG2在通城猪和长白猪感染PRRSV的第O天，第3天，第5天和第7天肺组织中的表达模式和相对表达量；横坐标代表时间点，纵坐标代表RPKM (相对表达量)。
[0018]图2为本发明实施例2中原始载体pCMV-Myc-N的载体图谱。
[0019]图3为本发明实施例2中MARC145细胞攻毒实验后24小时PRRSV的拷贝数；横坐标代表对照组和攻毒组；纵坐标代表PRRSV 0RF7的相对表达量。
【具体实施方式】
[0020]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989),或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0021]实施例1利用分析转录组数据方法发现新的抗PRRSV感染的基因
[0022]BTG2`[0023]由于不同的猪品种和个体的遗传背景差异，对蓝耳病的抗性也不同，研究表明在临床症状和生理生化指标上，通城猪、梅山猪等国内猪品种相较于国外长白猪、大白猪等感染高致病性PRRSV后有较强的抗性。通过高通量测序的方法，对感染PRRSV前后长白猪和通城猪的组织做差异基因表达分析，某些免疫相关的基因表达量在感染前后两个品种间有显著的差异。通过对不同品种间PRRSV感染造成的基因表达差异的分析，不仅可以研究蓝耳病的感染机制，还可以找出抗性或易感相关的基因，从而为蓝耳病的治疗和预防提供新办法。
[0024]前期实验通过对6个品种猪(长白猪、大白猪、杜洛克猪、清平猪、梅山猪、通城猪)感染高致病性蓝耳病毒(PRRSV)进行抗病猪的筛选，通过临床症状记录:采食量、体温、生理生化、细胞因子以及存活时间等的检测，最后得到了对蓝耳病抗性差异较大的两个品种:长白猪(易感猪)、通城猪(抗病猪)。
[0025]选取抗病猪和易感猪各8头，分别在第O天和感染高致病PRRSV后第3、5、7天宰杀取样，肺组织提取总RNA，建库进行高通量测序，通过生物信息学分析。分析发现:在攻毒第O天即对照组，BTG2在通城猪肺组织中的第3天的相对表达量(RPKM) 218.16大于长白猪的88.52 ;而且在通城猪肺组织中BTG2的表达达到峰值是在感染后第3天，在长白猪肺组织中BTG2基因感染后的表达量均低于感染前(如图1所示)。
[0026]实施例2利用细胞实验方法验证BTG2基因抗PRRSV感染
[0027]1.设计针对BTG2基因(GenBank登录号为EU255256.1)的引物，利用反转录PCR技术反转录mRNA并扩增得到BTG2基因的CDS序列，引物序列如下:
[0028]目的基因BTG2:
[0029]上游引物BTG2-F:
[0030]5' -GCGTCGACCATGAGCCAGGCCCGCTGGAC-3'；
[0031]下游引物BTG2-R:
[0032]5' -CCCTCGAGACTAACTGGAGACCGCCATGACGTAG-3'。
[0033]将扩增得到的BTG2基因的⑶S序列(如SEQ ID N0.1所示)导入原始载体pCMV-Myc-N (购自Clonetech公司，载体图谱如图2所示)，构建pCMV_BTG2_Myc载体。由于pCMV-Myc-N具有CMV强启动子，能够使导入其中的BTG2基因进行过表达。
[0034]2.BTG2基因过表达的验证
[0035]将构建好的连有BTG2基因⑶S序列的pCMV_BTG2载体和未连接有BTG2基因的⑶S序列的pCMV-Myc-N载体，分别转染MARC145细胞。
[0036]3.将构建好的连有BTG2基因⑶S序列的pCMV_BTG2载体和未连接有BTG2基因的CDS序列的pCMV-Myc-N载体，分别转染MARC145细胞，培养24小时之后，提取细胞的总RNA,对PRRS病毒的0RF7 (第7个编码阅读框)进行定量PCR检测。
[0037]PRRS 病毒 0RF7 引物:
[0038]上游引物PRRS-F: AATAACAACGGCAAGCAGCA ；
[0039]下游引物PRRS-R: GCACAGTATGATGCGTCGGC。
[0040]为了计算PRRS病毒0RF7的相对表达量，在对PRRS病毒的0RF7进行定量PCR检测的同时引入内参基因GAPDH (GAPDH在细胞内表达量比较恒定)，同时进行PCR扩增。
[0041]内参基因GAPDH (GenBank 登录号为 ΝΜ_001206359.1):
[0042]内参基因GAPDH引物:
[0043]上游引物GAPDH-F: CCTTCCGTGTCCCTACTGCCAAC ；
[0044]下游引物GAPDH-R:GACGCCTGCTTCACCACCTTCT。
[0045]4.分析转染了带有BTG2基因⑶S序列的质粒的细胞中的PRRS 0RF7的拷贝数与转染了不带有BTG2基因CDS序列的质粒的细胞中的0RF7的拷贝数是否有显著差异。我们的结果显示，在攻毒完成，并培养24小时后，转染了过表达BTG2基因CDS序列的细胞中的PRRS病毒的0RF7的相对表达量要显著的低于对照组(如图3所示)。
[0046]通过比较过表达BTG2基因的MARC145细胞和不转任何基因的MARC145细胞中的PRRS的拷贝数目，来分析BTG2基因对于PRRS病毒在MARC145细胞中复制的影响。我们研究发现过表达BTG2基因后，PRRS病毒在MARC145细胞中的复制明显受到抑制，这说明BTG2基因对于PRRS病毒的复制具有抑制作用，我们可以通过过表达BTG2基因来达到抑制PRRS病毒复制的目的。
[0047]本实施例实验操作中包含:
[0048]I)总RNA的提取
[0049]总RNA的提取是用Invitrog en公司生产的TRIzol试剂，并严格按照产品说明书要求进行操作。
[0050]2)反转录 PCR
[0051]反转录所采用的是MMLV逆转录DNA聚合酶并严格按照Promega公司的说明书要求进行操作。
[0052]3)利用荧光实时定量PCR技术检测PRRSV 0RF7的表达情况
[0053]荧光实时定量PCR:
[0054]仪器型号:ABI公司生产的 Applied BiosystemsViiA7
[0055]试剂盒:康为世纪公司生产的FastSYBR mixture (Coffin Biotech C0., Ltd.[CWBIO])，并按照产品说明书操作。
[0056]PRRSV 0RF7相对表达量分析方法:
[0057]Λ Λ Ct方法:Λ Ct实验组=(实验组目的基因Ct-实验组内参基因Ct)
[0058]Δ Ct对照组=(对照组目的基因Ct-对照组内参基因Ct)
[0059]2—Δ ACt=2~(ACt 实验组-ACt 对照组)
[0060]采用GAPDH作为内参基因。
[0061]实施例3利用BTG2基因过表达制备抗PRRSV的转基因猪
[0062]1、供体细胞的复苏。从液氮中取出冻存管，快速投入37度水浴中，并不断快速摇动冻存管。待冷冻液彻底解冻后，转移至离心管中，用新鲜培养液稀释3倍，1000rpm,离心5分钟，出去上清，用新鲜的培养液悬浮细胞沉淀，将细胞稀释至所需浓度，接种到培养皿中
培养。`
[0063]2、利用脂质体转染的方法，将目的质粒转入供体细胞中。常规方法消化细胞，用IOOul无血清培养基DMEM来稀释0.8ug待转质粒和2ul脂质体(lipofectamineTM2000)。室温孵育20分钟后，向24孔培养板的每个孔内添加IOOul上述液体。将培养板前后轻轻晃动摇匀，培养4-6小时后更换培养液为完全细胞培养基。
[0064]3、转基因阳性细胞的筛选。将脂质体转染48小时的细胞加入800ug/mL G418，每2-3天换液一次，筛选14天后，用PBS洗2遍，收集阳性细胞克隆。
[0065]4、转基因阳性细胞的DNA检测。按照常规分子克隆方法，提取转基因阳性细胞DNA并进行PCR验证。
[0066]5、以上述转基因阳性细胞为核移植供体细胞，以体外成熟的初情期前母猪卵母细胞为核移植受体细胞。把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入39度，5%C02,100%湿度平衡10分钟，然后在配有显微操作仪器及恒温台的倒置显微镜上用固定吸管吸持卵母细胞，用注射针将吸取卵母细胞核。然后挑选表面光滑的体细胞，从去核时裂口处放入卵周隙，用注射针点压透明带，使供体细胞与受体卵的胞膜接触紧密。将供体细胞-卵胞质构成的重构卵转移到培养液PZM3中，在39度，5%C02，100%湿度培养箱中恢复I小时。
[0067]6、将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡2分钟，用融合/激活液洗涤3遍后，每批放5-8个放入已经铺满融合液的融合槽内，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，用CUY-21融合仪(BEX，日本)施加I个lOOus，1.4kv/cm的直流电脉冲诱导融合同时激活，接着用PZM3培养液洗涤3遍，立即转入矿物油覆盖胚胎培养液中或辅助激活液中，39度，5%C02,100%湿度培养4小时后再体视显微镜下判定融合。
[0068]7、克隆胚胎体外培养。将融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后，转入预平衡2小时以上的胚胎培养液PZM3中，培养条件39度，5%C02，5%02，90%N2，饱和湿度。
[0069]8、挑选形态优良的克隆胚胎用非手术法移入自然发情的经产母猪子宫内进行妊娠。[0070]9、对出生的克隆转基因猪进行PCR和southern检测，进行功能研究。
[0071]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所`做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.猪BTG2基因在抗PRRS病毒中的应用，其特征在于，其是通过BTG2基因在细胞中的过表达来抑制PRRS病毒在细胞中的复制。
2.一种过表达BTG2基因的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为导入BTG2基因CDS序列的pCMV-Myc-N 载体。
4.含有权利要求2或3所述载体的转基因细胞。
5.根据权利要求4所述的转基因细胞，其特征在于，其为除胚胎细胞外的猪体细胞。
6.一种制备克隆胚胎的方法，其特征在于，其以权利要求5所述转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。
7.利用BTG2基因表达量筛选抗PRRS病毒猪的方法，其特征在于，所述方法为通过对猪的BTG2基因的表达量进行测定，BTG2表达量高的猪比BTG2表达量低的猪具有更高的抗PRRS病毒感染能力。
【文档编号】A61K48/00GK103751802SQ201310717888
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】李宁, 李佳, 任立明, 李骏蔚 申请人:中国农业大学