一种鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种同时鉴别8种鸡传染性免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试剂盒和检测方法。该试剂盒是基于GeXP系统使用的，包含8对PCR引物，检测结果表明，该试剂盒特异性强，灵敏度高，可以用于同时鉴别检测鸡马立克氏病病毒、A、B和J亚群禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊炎病毒。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的GeXP快 速检测试剂盒和检测方法。 -种鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试剂盒 和检测方法
【背景技术】
[0002] 鸡马立克氏病病毒、A、B和J亚群禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽 呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊炎病毒均为传染性的可导致鸡免疫抑制的 病毒。鸡感染鸡马立克氏病病毒、A、B和J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒 后可引起病鸡发生肿瘤，且也可引起终身的免疫抑制。鸡感染禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血 病毒和传染性法氏囊炎病毒后也能长时间的抑制鸡的免疫功能。鸡感染这些病毒以后，免 疫功能受到抑制，注射疫苗后抗体产生迟缓，抗体水平低，容易继发感染其他细菌性疾病， 鸡生长缓慢，是阻碍养鸡行业发展的重要因素。
[0003] 鉴别诊断这些鸡免疫抑制病的传统方法，主要包括病原分离鉴定和血清学试验 等，但这些方法常受临床病材料新鲜度、污染程度或病程等因素的限制，操作也十分繁琐、 费时，对多重混合感染的鉴别诊断就更为困难。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术已 被广泛应用于这些鸡传染病的检测，并建立了多重PCR检测技术，同时检测几种病原，但需 几对引物组合在一起同时竞争的扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性 就越低。PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的条 带，一般只可做到2-4重PCR，难以达到高通量的检测。多重荧光PCR-般只检测到3重，由 于探针要标记不同发光波长的荧光基团，如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰，因此， 也只能检测到2-4重。由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物 二聚体的概率大大增加，同时检测的目的基因数量有限（多在2-4个基因），使得多重PCR 还达不到高通量快速检测和分析的目的。
[0004] GeXP 系统（Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国 Beckman Coulter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台，由两部分组成：用于设 计引物的 GeXP Expression Profiler 软件和用于结果分析的 GenomeLabTM GeXP Genetic Analysis System毛细管电泳仪，后者可清晰分离出相差7bp以上的相邻扩增片段。GeXP 多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物（即基因特异性引物5'端连接 通用引物序列）相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原 始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、 反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序 列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增， 通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离， 含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段（DNA Size Standard，DSS)迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含 量。GeXP系统可在同一个体系里对多达40个目的基因进行有效分析。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试 剂盒。
[0006] 上述所述试剂盒包括用于鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的引物组，为如下8种引 物对：
[0007] (1)用于鉴定鸡马立克氏病病毒的引物对A :-条序列如序列表中序列1，另一条 序列如序列表中序列2所示；
[0008] (2)用于鉴定A亚群禽白血病病毒的引物对B :-条序列如序列表中序列3,另一 条序列如序列表中序列4所示；
[0009] (3)用于鉴定B亚群禽白血病病毒的引物对C:一条序列如序列表中序列5,另一 条序列如序列表中序列6所示；
[0010] (4)用于鉴定J亚群禽白血病病毒的引物对D :-条序列如序列表中序列7,另一 条序列如序列表中序列8所示；
[0011] (5)用于鉴定禽网状内皮组织增生症病毒的引物对E :-条序列如序列表中序列 9,另一条序列如序列表中序列10所7]^ ;
[0012] (6)用于鉴定禽呼肠孤病毒的引物对F :-条序列如序列表中序列11，另一条序列 如序列表中序列12所示；
[0013] (7)用于鉴定鸡传染性贫血病毒的引物对G :-条序列如序列表中序列13,另一条 序列如序列表中序列14所示；
[0014] (8)用于鉴定传染性法氏囊炎病毒的引物对Η :-条序列如序列表中序列15,另一 条序列如序列表中序列16所示。
[0015] 上述所述引物组在制备检测8种鸡免疫抑制病病原体的试剂盒中的应用。
[0016] 上述所述8种鸡免疫抑制病病原体为鸡马立克氏病病毒、Α亚群禽白血病病毒、Β 亚群禽白血病病毒、J亚群禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传 染性贫血病毒或传染性法氏囊炎病毒。
[0017] 上述所述鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的引物组中的引物对混合使用。
[0018] 上述所述的检测为利用GeXP系统进行检测。
[0019] 本发明利用GeXP多重基因表达遗传分析系统，建立一种能同时鉴别多种病原体 的检测方法和检测试剂盒，关键是设计特异性引物，将多重引物组合，利用通用引物，把多 重引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。
[0020] 本发明提供了一种同时鉴别8种鸡传染性免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试 剂盒和检测方法。该试剂盒是基于GeXP系统使用的，包含8对PCR引物，检测结果表明，该 试剂盒特异性强，灵敏度高，可以用于同时鉴别检测鸡马立克氏病病毒、A、B和J亚群禽白 血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊 炎病毒。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为A亚群禽白血病病毒前病毒DNA、J亚群禽白血病病毒前病毒DNA和禽网状 内皮组织增生症病毒前病毒DNA混合模板的GeXP八重PCR的毛细管电泳分析图。
[0022] 图2为A亚群禽白血病病毒前病毒DNA、J亚群禽白血病病毒前病毒DNA和禽呼肠 孤病毒的cDNA混合模板的GeXP八重PCR的毛细管电泳分析图。
[0023] 图3为八种鸡传染性疾病病原的GeXP八重PCR的毛细管电泳分析图。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 鸡马立克病病毒记载在"曾婷婷，谢芝勋，谢丽基，等。网状内皮组织增生症病毒改 良型LAMP检测方法的建立，动物医学进展，2013, 34⑶：30-34"中，公众可从广西壮族自治 区兽医研究所获得。
[0027] A(RSV-A)、B(RSV_B)亚群禽白血病病毒毒株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中 心，该中心可向公众出售该毒株。
[0028] J亚群禽白血病病毒记载在"曾婷婷，谢芝勋，谢丽基，等。网状内皮组织增生症病 毒改良型LAMP检测方法的建立，动物医学进展，2013, 34 (8) :30-34"中，公众可从广西壮族 自治区兽医研究所获得。
[0029] 禽网状内皮组织增生症病毒记载在"曾婷婷，谢芝勋，谢丽基，等。网状内皮组织增 生症病毒改良型LAMP检测方法的建立，动物医学进展，2013, 34 (8) :30-34"中，公众可从广 西壮族自治区兽医研究所获得。
[0030] 禽呼肠孤病毒疫苗毒V-S1133和强毒株S1133购自中国兽医微生物菌种保藏管 理中心，该中心可向公众出售该毒株。其余野毒株GuangxiRl、GuangxiR2、Guangxill0058 和 Guangxill0116 记载在 "Teng Liqiong, Xie Zhixun, Xie Li ji, et al. Sequencing and phylogenetic analysis of an avian reovirus genome, 2014, 48 (2) : 381-386"中，公众可 从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0031] 鸡传染性贫血病毒毒株GXC060821记载在"邓显文，谢芝勋，谢丽基，等。鸡传染性 贫血病毒广西株全基因组的克隆与序列分析，动物医学进展，2011，32(4):19-22"中，公众 可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0032] 传染性法氏囊炎病毒毒株NN1107记载在"李军，陶立，兰美益，等。传染性法氏囊 病病毒NN1107广西株的分离鉴定及遗传进化分析，动物医学进展，2012, 33 (4) :63-67"中， 公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0033] 实施例1、PCR引物对的设计
[0034] 从NCBI上下载已知引物的序列，使用DNASTAR软件进行序列比对，选取针对各个 革巴基因高度保守与特异的基因片段，由primer premier5.0软件设计了 8重特异性引物，并 在引物的5'端添加 GeXP通用引物，引物方向均为从5'端到3'端，具体如下：
[0035] 1、以鸡马立克氏病病毒（MDV)meq基因为靶基因的引物对A :
[0036] MDV-F1: AGGTGACACTATAGAATAAGGGAGCAGACGTACTATGTAGACAA (序列表中序列 1);
[0037] MDV-R1:GTACGACTCACTATAGGGATGGTAAGCAGTCCAAGGGTCA (序列表中序列 2);
[0038] 预计扩增产物长度（即目的峰位置）为227bp。
[0039] 2、以A亚群禽白血病病毒（ALV_A)gp85基因为靶基因的引物对B :
[0040] ALV-A-F1:AGGTGACACTATAGAATACAAGGGGTTCCTTGGTATCT 序列表中序列 3);
[0041] ALV-A-R1:GTACGACTCACTATAGGGATGTGCCTATCCGCTGTCA (序列表中序列 4);
[0042] 预计扩增产物长度（即目的峰位置）为155bp。
[0043] 3、以B亚群禽白血病病毒（ALV_B)gp85基因为靶基因的引物对C:
[0044] ALV-B-F1: AGGTGACACTATAGAATATCAATCACGATTCTCCCACC (序列表中序列 5);
[0045] ALV-B-R1:GTACGACTCACTATAGGGATGTGACGCTTCGTTTACGTCTT (序列表中序列 6);
[0046] 预计扩增产物长度（即目的峰位置）为285bp。
[0047] 4、以J亚群禽白血病病毒（ALV_J)gp85基因为靶基因的引物对D:
[0048] ALV-J-F1: AGGTGACACTATAGAATACTGATGCAACAACCAGGAAA (序列表中序列 7);
[0049] ALV-J-R1:GTACGACTCACTATAGGGAGCAGTGACATTAGTGACATACCC (序列表中序列 8);
[0050] 预计扩增产物长度（即目的峰位置）为204bp。
[0051] 5、以禽网状内皮组织增生症病毒（REV) gp90基因为靶基因的引物对E :
[0052] REV-F1: AGGTGACACTATAGAATAGACCAGGCGAGCAAAATC (序列表中序列 9);
[0053] REV-R1:GTACGACTCACTATAGGGAGGTGTAATAGGTAGGTATGGAGGA (序列表中序列 10);
[0054] 预计扩增产物长度（即目的峰位置）为182bp。
[0055] 6、以禽呼肠孤病毒（ReoV)Sl基因为靶基因的引物对F :
[0056] ReoV-Fl: AGGTGACACTATAGAATAGGACCCCTACTTCTGTTCTCA (序列表中序列 11);
[0057] ReoV-Rl: GTACGACTCACTATAGGGAATTTCCCGTGGACGACAT (序列表中序列 12);
[0058] 预计扩增产物长度（即目的峰位置）为215bp。
[0059] 7、以鸡传染性贫血病毒（CIAV)VPl基因为靶基因的引物对G :
[0060] CIAV-F1: AGGTGACACTATAGAATAGGGTCAGGGCTAATTGTCTT (序列表中序列 13);
[0061] CIAV-R1:GTACGACTCACTATAGGGATGCCCTGGAGGAAAAGACC (序列表中序列 14);
[0062] 预计扩增产物长度（即目的峰位置）为270bp。
[0063] 8、以传染性法氏囊炎病毒（IBDV)VP5基因为靶基因的引物对Η:
[0064] IBDV-F1: AGGTGACACTATAGAATAGGGTCAGGGCTAATTGTCTT (序列表中序列 15);
[0065] IBDV-R1:GTACGACTCACTATAGGGATCTGTCAGTTCACTCAGGCTTC (序列表中序列 16);
[0066] 预计扩增产物长度（即目的峰位置）为294bp。
[0067] 根据实际检测的病原体的毒株不同以及GeXP系统如GenomeLabTM GeXP Genetic Analysis System毛细管电泳仪的误差，使用上述引物对A?Η及GeXP通用引物对检测获 得的实际扩增产物长度可在预计扩增产物的长度基础上上下波动3bp。
[0068] 实施例2、PCR引物对的特异性检测
[0069] 一、模板的制备
[0070] 1、病毒RNA提取及cDNA的获得
[0071] 分别提取以下样品病毒的RNA :禽呼肠孤病V-S1133、S1133、GuangxiRl、 GuangxiR2、Guangxi 110058 和 Guangxi 110116,鸡传染性贫血病毒 GXC060821 和传染性法氏 囊炎病毒NN1107 (以提取阴性鸡胚尿囊液获得的样品为阴性对照样品）。反转录获得cDNA。
[0072] 2、基因组DNA的提取
[0073] 分别从病鸡组织无菌处理后感染细胞的细胞培养物中提取鸡马立克氏病病毒总 基因组DNA、A、B和J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒的前病毒基因组 DNA(A、B和J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒是反转录病毒，感染方式为 将病毒基因组反转录为DNA插入宿主基因组，所以称之为前病毒，检测时直接抽提细胞培 养物DNA，就可特异检测是否感染病毒。病毒基因组为RNA，但一般抽提病鸡组织或细胞培 养物DNA即可达到检测目的）（以提取阴性鸡胚尿囊液获得的样品为阴性对照样品）。
[0074] 3、测定核酸含量
[0075] 测定上述cDNA及基因组DNA的0D值，根据其浓度与纯度值来控制核酸含量。
[0076] 二、各引物对单重PCR的特异性检测
[0077] 1、引物对A的特异性检测
[0078] (l)PCR 扩增
[0079] 用引物对A对获得的禽呼肠孤病、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊炎病毒的 cDNA样品以及鸡马立克氏病病毒总基因组DNA、A、B和J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮 组织增生症病毒的前病毒基因组DNA的样品分别进行PCR扩增，以上述获得的阴性鸡胚尿 囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照。每个cDNA/DNA设置3个重复。
[0080] 反应体系（2〇μ 1) :GenomeLabTM GeXP Start KitSXPCR Buffer (含 GeXP 通 用引物对）4μ 1、引物对A(每条引物在反应体系中的终浓度为20nM)、25mM MgCl24y 1、 了1__)3七&1'1:1&9〇嫩？〇15〇116四862.0以1、模板〇0嫩或0敵0.5卩区-〇.5以区、加灭菌水至2〇4 1。
[0081] 反应程序：951：3〇8,551：3〇8,721：3〇8，10个循环；951：3〇8,651：3〇8,721：3〇8， 10 个循环；95°C 30s，52°C 30s，72°C 30s，20 个循环；4°C终止。
[0082] (2)毛细管电泳
[0083] 将DNA size standard Kit_400Base Pairs与上样缓冲液甲醜胺按体积比 1: (80-160)彻底混匀，在样品板上每孔加入39 μ 1混匀好的液体，用PCR产物进行10-100 倍稀释，取稀释后的产物?μ 1加至样品板，吹打混匀，最后在每孔滴入一滴石蜡油封闭，以 免甲酰胺氧化和样品蒸发。
[0084] 在缓冲液板上每孔加入2/3的缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳的条件如下：
[0085]
【权利要求】
1. 一种用于鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的引物组，为如下8种引物对： (1) 用于鉴定鸡马立克氏病病毒的引物对A :-条序列如序列表中序列1，另一条序列 如序列表中序列2所示； (2) 用于鉴定A亚群禽白血病病毒的引物对B :-条序列如序列表中序列3,另一条序 列如序列表中序列4所示； (3) 用于鉴定B亚群禽白血病病毒的引物对C :一条序列如序列表中序列5,另一条序 列如序列表中序列6所示； (4) 用于鉴定J亚群禽白血病病毒的引物对D :-条序列如序列表中序列7,另一条序 列如序列表中序列8所示； (5) 用于鉴定禽网状内皮组织增生症病毒的引物对E :-条序列如序列表中序列9,另 一条序列如序列表中序列10所示； (6) 用于鉴定禽呼肠孤病毒的引物对F :-条序列如序列表中序列11，另一条序列如序 列表中序列12所示； (7) 用于鉴定鸡传染性贫血病毒的引物对G :-条序列如序列表中序列13,另一条序列 如序列表中序列14所示； (8) 用于鉴定传染性法氏囊炎病毒的引物对Η :-条序列如序列表中序列15,另一条序 列如序列表中序列16所示。
2. 权利要求1所述引物组在制备检测或辅助检测8种鸡免疫抑制病病原体的试剂盒中 的应用； 所述8种鸡免疫抑制病病原体为鸡马立克氏病病毒、Α亚群禽白血病病毒、Β亚群禽白 血病病毒、J亚群禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血 病毒或传染性法氏囊炎病毒。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述引物对混合使用。
4. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述检测为利用GeXP系统进行检测。
5. 根据权利要求2-4中任一所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括使用说明书，所 述使用说明书上记载如下内容： 使用权利要求1所述的引物组对待测样品进行PCR扩增，然后根据PCR扩增结果判定 所述待测样品含有哪种病毒； 若所述PCR产物中含有226-228bp的片段，则判定待测样品中含有或候选含有鸡马立 克氏病病毒； 若所述PCR产物中含有154-156bp的片段，则判定待测样品中含有或候选含有A亚群 禽白血病病毒； 若所述PCR产物中含有283-285bp的片段，则判定待测样品中含有或候选含有B亚群 禽白血病病毒前病毒； 若所述PCR产物中含有203-205bp的片段，则判定待测样品中含有或候选含有J亚群 禽白血病病毒前病毒； 若所述PCR产物中含有181-183bp的片段，则判定待测样品中含有或候选含有网状内 皮组织增生症病毒前病毒； 若所述PCR产物中含有214-216bp的片段，则判定待测样品中含有或候选含有鸡呼肠 孤病毒； 若所述PCR产物中含有268-270bp的片段，则判定待测样品中含有或候选含有鸡传染 性贫血病毒； 若所述PCR产物中含有293-295bp的片段，则判定待测样品中含有或候选含有传染性 法氏囊炎病毒。
【文档编号】C12Q1/68GK104087686SQ201410333041
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】谢芝勋, 曾婷婷, 谢丽基, 罗思思, 邓显文, 谢志勤, 范晴, 刘加波, 庞耀珊 申请人:广西壮族自治区兽医研究所