一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的MR成像聚合物胶束及其制备方法与流程

本发明属于高分子化学与生物医学工程领域，更具体地，涉及一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束及其制备方法。

背景技术：

恶性肿瘤严重危害人类健康，目前治疗癌症的常用的方法有手术、放疗、化疗和免疫治疗。而肿瘤免疫治疗现已成为继手术治疗、放射治疗和化学药物治疗之后的另一种控制肿瘤的有效疗法，并广泛应用于临床。其中，免疫检查点抑制剂抗体疗法因其在多种肿瘤中均表现出了很好的抗肿瘤活性并显著延长临床生存期而得到广泛关注。但免疫检查点抑制剂抗体疗法容易引发免疫相关的不良反应，比如心肌炎、肝炎、肺炎、皮炎等，这些都被认为是由于自身反应性t细胞的异常活化引起的。因此，有必要对其治疗方法进行改进。因此需要制备一种特殊功能的免疫检查点抑制剂抗体输送载体：“在生理环境中时抗体被屏蔽起来，从而阻止抗体与免疫细胞的结合，当抗体到达肿瘤微环境后，抗体重新被释放出来，恢复抗体与免疫细胞的结合功能。”使得肿瘤免疫被激活的同时降低自身反应性t细胞的异常活化率，从而降低肿瘤免疫疗法的毒副作用。

磁共振(mr)成像因具有空间分辨率高、软硬组织成像好、无创性观测等优点，在医疗诊断特别是分子影像研究方面发挥着重要作用。随着纳米技术和mr分子影像的发展与结合，以超顺磁性氧化铁(spio)纳米晶体构建的mr纳米探针得到了极大的关注。由于spio具有低毒性、良好的生物相容性和磁共振信号敏感性等特点，已经应用于临床mr成像。因此，研发具有抗体输送与磁学性能兼备的多功能磁共振分子探针，可以对抗体传输效率进行实时有效的评估。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种抗体输送与磁学性能兼备的多功能载体，即一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束。

本发明的另一目的是提供上述输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束的制备方法。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束，所述聚合物胶束为核壳结构：核负载超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒、胶束表面用基质金属蛋白酶敏感的多肽偶联抗体形成壳层，用酸敏键偶联的单甲基醚聚乙二醇mpeg20k，作为抗体的屏蔽层；所述单甲基醚聚乙二醇mpeg20k分子量为20kda。

本发明一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束，其表面的屏蔽层对ph敏感，在体内生理环境ph为7.4条件下，可以屏蔽血液中的免疫细胞与抗体结合，而在ph为6.5的肿瘤微环境中，该屏蔽层脱去，继而在肿瘤微环境高表达的基质金属蛋白酶(mmps)的作用下，释放抗体，与免疫细胞结合，发挥免疫治疗的作用；另一方面，聚合物胶束负载的超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒(spions)，可实现非侵入式的mr成像，从而实现诊疗一体化。

所述抗体可以是免疫治疗抗体，例如pd-1抗体，也可以是本领域其他常用的抗体。

优选地，所述聚合物胶束平均粒径为140nm～190nm。

优选地，所述超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒为油溶性。

所述聚合物胶束在肿瘤微环境，即ph小于或等于6.5时，屏蔽层脱落，在基质金属蛋白酶的作用下，释放抗体。

所述抗体质量占聚合物胶束质量的1.0％～2.0％，超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒质量占聚合物胶束质量的15％～25％。

所述输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束的制备方法，包括以下步骤：

s1.以l-苯丙氨酸为原料，加入三光气，制得l-苯丙氨酸-环碳酸酐，表述为l-phe-nca；

s2.以l-phe-nca为原料经聚合反应获得α-叠氮基-聚乙二醇-聚苯丙氨酸，表述为n3-peg-plphe；

s3.以乙酰丙酮铁、1,2-十六烷二醇为原料，制得超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒(spions)；

s4.以n3-peg-plphe和spions为原料，经过超声自组装获得负载spions的胶束，表述为n3-peg-plphe@spions；

s5.以pd-1单克隆抗体mab和基质金属蛋白酶底物多肽peptide为原料，经过一系列反应，将抗体偶联在s4所制备的胶束表面，表述为mab-peptide-peg-plphe@spions；

s6.以mpeg20k-oh为原料，经过一系列反应，在s5所制备的胶束表面构建酸敏感屏蔽层，表述为mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe@spions。

所述输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束在肿瘤免疫治疗和mr成像中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束可以在体内稳定循环，并富集在肿瘤部位，阻止携带的抗体药物在生理环境下与免疫细胞结合；同时该载体含有spions内核，可以实现mr成像造影功能；所述聚合物胶束还具有ph和mmps敏感性，当聚合物胶束到达肿瘤部位时，可以脱去屏蔽层，并断裂mmps敏感多肽，释放抗体药物，恢复抗体与免疫细胞的结合功能，实现抗体药物在肿瘤微环境的响应性释放，从而增加肿瘤免疫的组织特异性并降低自身反应性t细胞的异常活化率。

附图说明

图1为n3-peg-nh2、l-phe-nca和n3-peg-plphe的核磁谱图。

图2为酸敏mpeg20k-cdm和mpeg20k-phe-alkyne的核磁谱图。

图3为聚合物胶束在ph7.4、ph6.5和ph6.5&mmp-2条件下的粒径分布图。

图4为聚合物胶束的tem图，(a)负载spions，未用染色剂染色，(b)负载spions，3％醋酸铀染色1min。

图5为聚合物胶束在ph7.4、ph6.5和ph6.5&mmp-2条件下与t淋巴细胞的结合效率图。

图6为聚合物胶束标记肿瘤细胞后的mr成像图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明进行进一步解释说明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应包括在本发明权利要求的保护范围之内。

以下实施例和对比例中，所用原料均为市售商品。

实施例1

一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束的制备方法，包括如下步骤：

s1.l-phe-nca(l-苯丙氨酸-环碳酸酐)聚合物的合成：具体合成步骤如下：称取10gl-苯丙氨酸于500ml的三口瓶中，加入新蒸的100ml乙酸乙酯，90℃加热回流后，滴入溶有10g三光气的50ml乙酸乙酯，搅拌，加热回流约5h至溶液呈黄色澄清溶液。恢复到室温后，-40℃冷冻0.5h。乙酸乙酯层分别用4℃预冷饱和nahco3溶液(100ml×2)、饱和nacl溶液(50ml×2)洗涤，分液。乙酸乙酯层再用mgso4干燥，过滤，旋蒸浓缩后在新蒸的石油醚中沉淀，抽滤，所得固体用乙酸乙酯/石油醚重结晶，抽滤，真空干燥得白色粉末l-phe-nca6.0g，产率52％。

s2.n3-peg-plphe聚合物的合成：称取1.0gn3-peg-nh2(α-叠氮基-ω-氨基聚乙二醇，mw为1.8k)于100ml的史莱克反应茄瓶中，70℃真空干燥1h，通n2后恢复至室温，加入30ml新蒸的ch2cl2溶解。将3.2gl-phe-nca溶于3ml无水dmf后，加入到上述史莱克反应茄瓶中，密封，35℃反应48h后在乙醚中沉淀，离心得白色产物n3-peg-plphe。¹hnmr测得phe的单元为25，聚合物数均分子量为5525。

s3.超顺磁性fe3o4纳米粒子的合成：将乙酰丙酮铁(2mmol)、油胺(6mmol)、油酸(6mmol)、1,2-十六烷二醇(10mmol)和苄醚(18ml)混合均匀，氩气保护下迅速加热到200℃，保持2h后，继续升温到300℃，回流1h。自然冷却至室温，在乙醇(200ml)中沉淀，离心分离后，再分散在35ml正己烷中，过滤干燥即得fe3o4纳米粒子。

s4.制备负载spions的胶束：将3mgspions、30mgn3-peg-plphe溶于8mlthf，超声下滴加到30ml的去离子水中，用水透析以除去thf(透析袋mwco14k)，用220nm水相滤头过滤，50krpm超高速离心去除未包裹spions的胶束，用5mmpbs(ph为7.4)复溶至约2.5mg/ml。该制备方法采用本技术领域常规技术。

s5.mab-peptide-peg-plphe@spions的合成：

首先，使pd-1抗体(goinvivo^tmanti-mousecd279，biolegend)巯基化，简要操作步骤如下：取1ml1mg/ml的抗体溶液(ph为7.4)，加入10μl100mmpbs和30mmedta(ph为7.4)，加入0.7mg2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-it，mw为137.6，5mm)，20℃反应45min。使用hitrap^tm柱进行快速脱盐纯化(puresystem)，洗脱液组成:10mmpbs+3mmedta(ph为7.4)，检测波长：280nm，按照1ml/管收集样品。合并含有蛋白的溶液，超滤(mwco:10k)浓缩，定量至2.5ml。用紫外分光光度法或者elisa法测定抗体浓度，回收率约80％。使用dtnb测定巯基的含量，测的平均每个抗体分子引入3.2个巯基。

其次，pd-1抗体上的巯基与mal-peptide-alkyne的马来酰亚胺基加成，从而引入炔基(alkyne)，简要操作步骤如下：称取2.5mgmal-peptide-alkyne(mw为1013.5，1mm)溶于30μldmso，加入到上述巯基化的抗体溶液中，4℃搅拌过夜。使用hitrap^tm柱进行脱盐纯化(puresystem)，洗脱液组成:10mmpbs，ph7.4，检测波长：280nm，按照1ml/管收集样品。合并含有蛋白的溶液，超滤(mwco:10k)浓缩，定量至2ml。用紫外分光光度法或者elisa法测定抗体浓度，回收率约81％。最后，pd-1抗体上的炔基与胶束表面的叠氮基进行点击反应，具体操作步骤如下：取上述制备得到的2mln3-peg-plphe@spions的胶束溶液(叠氮基约为0.72μmol)，加入10μlcu(ii)bsc(1mg/ml)后，冻融除氧，重复2次。加入上述制备的炔基化的抗体溶液(抗体约0.64mg，炔基约0.0085μmol)和2mg维生素c，室温下反应过夜。

s6.mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe@spions的合成：

mpeg20k-phe-alkyne合成反应路线如下：

首先，将2-丙酸-3-甲基马来酸酐(cdm)用草酰氯活化成酰氯。简要描述如下：称取0.37gcdm(mw184.1,2.0mmol)溶于新蒸的5mlch2cl2，加入催化剂量的50μldmf，n2气保护下，冰水浴下滴入1.27ml草酰氯(20mmol)。滴加完后，室温下反应3h，真空旋蒸除去溶剂及多余的草酰氯得到浅黄色粘稠液体。

第二步，合成mpeg20k-cdm。将1.0gmpeg20k-oh(0.05mmol)溶于无水的4mlch2cl2，加入到上述粘稠液体中，加入催化剂12mgdmap(mw122.17,0.1mmol)，冰水浴下逐滴滴入含有0.35ml三乙胺(mw101.2,2.5mmol)的12ml甲苯溶液，溶液呈棕灰色，反应24h。反应完后抽滤，浓缩滤液，在冷乙醚中沉淀，抽滤，滤饼用50mlch2cl2溶解。ch2cl2层分别用15ml0.5mhcl、15ml饱和nacl溶液洗涤，分层，之后用mgso4干燥，过滤，浓缩，在冷乙醚沉淀得微黄色产物。¹hnmr测得转化率约80％。

第三步，合成mpeg20k-phe-alkyne。将0.6gmpeg20k-cdm(0.03mmol)溶于4mlch2cl2和0.2mldmf后，加入33μg丙炔胺(mw55.1，0.6mmol)，室温下反应12h，在冷乙醚中沉淀，离心得产物，产物用ch2cl2溶解后再在乙醚中沉淀得产物，mpeg20k-phe-alkyne的结构式如上述反应路线所示。

第四步，往s5所述反应过夜后的mab-peptide-peg-plphe@spions溶液中加入29.0mgmpeg20k-phe-alkyne(1.44μmol)和2mg维生素c，继续反应8h。反应完后，加入1ml10mmedta，50krpm超高速离心分离，所得固体用pbs(ph7.4)洗涤一次，复溶至2ml生理盐水中，4℃保存备用。

将该溶液调至ph6.5，使peg20k从表面脱落后再用elisa法测定抗体浓度，约100ug/ml，抗体的反应效率约31％。抗体占总质量的1.25％。mpeg20k的屏蔽层密度可以通过调整反应时间进行调控。

聚合物的结构分析和聚合物胶束的形貌表征：取各步产物约9mg溶于适量氘代溶剂，用¹h-nmr400mhz核磁共振波谱仪进行测试，检测反应前后聚合物结构上¹h化学位移的变化，如图1和图2。制备了不同聚合物胶束样品，包括：n3-peg-plphe、n3-peg-plphe@spions，mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe，mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe@spions，用zeta电位及粒度测定仪(dls)检测聚合物胶束的粒径，如图3，入射激光波长λ＝532nm，入射角θ＝175°，温度为25℃；粒径值取三次测量值的平均值。

用透射电镜(tem)观察聚合物胶束的形貌如图4，图4(a)为负载spions的胶束，未染色，图4(b)为负载spions的胶束，染色。从图4(b)中可以看出整个聚合物胶束载体粒径大约在170nm。简要操作如下：取2μl样品(0.2mg/ml)滴在纯碳膜铜网上，在室温下晾干，用3％的醋酸铀染色1min。用透射电镜在120kv下观察(所述操作采用本领域常规技术进行检测)。

用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束的ph和mmps双响应性检测：为证明实施例1制备的聚合物胶束具有ph和mmps双响应性，分别将聚合物胶束置于ph6.5和10nmmmp-2的环境中处理4h和6h后，再与t淋巴细胞进行共孵育，使用流式细胞仪检测处理前后抗体与t淋巴细胞的结合效率，结果如图5所示。结果表明，游离的pd-1抗体与t淋巴细胞的结合效率可达82.85％(freeapd1)，而经聚合物胶束载体屏蔽后抗体与t淋巴细胞的结合效率降至32.00％(shielded)，说明载体在ph7.4的生理环境下可以很好地屏蔽抗体，阻止pd-1抗体与t淋巴细胞的结合。当聚合物胶束经ph6.5的弱酸性环境处理后，抗体与t淋巴细胞的结合效率可恢复至65.65％(ph6.5)，当进一步使用mmp-2酶切处理后，抗体与t淋巴细胞的结合效率可恢复到75.49％(ph6.5&mmp-2)，说明载体具有很好的ph和mmps酶响应性。

体外mri成像效果：为更进一步证明实施例1制备的聚合物胶束具有mr成像能力，以5×10⁵/孔的b16-f10接种于96孔板中，培养24h后加入实施例1制备的聚合物胶束，使得各孔的最终铁浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml，并进一步检测孵育时间为30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min后各孔的mr成像能力。由图6可以看到，各浓度梯度标记b16-f10在t1wi、t/2wi、ffe及t2-mapping上信号均逐渐降低，其信号的减低程度具有一定的聚合物胶束浓度的依赖性，随着聚合物胶束含量的增高，细胞mr信号逐渐减低。说明该聚合物胶束具有很强的磁敏感性，可用于mr成像，结合孵育时间和铁浓度结果可知，当铁浓度为30μg/ml、孵育时间为210min时，即可达到最佳的mr成像效果。

实施例2

一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束的制备方法，包括如下步骤：

步骤s1至s3，及s5至s6同实施例1

s4.制备负载spions的胶束：将8mgspion、30mgn3-peg-plphe溶于10mlthf，超声下滴加到30ml的去离子水中，用水透析以除去thf(透析袋mwco14k)，用450nm水相滤头过滤，50krpm超高速离心去除未包裹spions的胶束，用5mmpbs(ph为7.4)复溶至约2.5mg/ml。超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒(spions)质量占聚合物胶束质量的25％。该制备方法采用本技术领域常规技术。

实施例3

一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束的制备方法，包括如下步骤：步骤s1至s3，及s5至s6同实施例1

s4.制备负载spions的胶束：将4mgspion、32mgn3-peg-plphe溶于5mlthf，超声下滴加到25ml的去离子水中，用水透析以除去thf(透析袋mwco14k)，用450nm水相滤头过滤，60krpm超高速离心去除未包裹spions的胶束，用5mmpbs(ph为7.4)复溶至约2.5mg/ml。超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒(spions)质量占聚合物胶束质量的15％。该制备方法采用本技术领域常规技术。

实施例4

一种输送抗体用于肿瘤免疫治疗的mr成像聚合物胶束的制备方法，包括如下步骤：

步骤s1至s4，及s6同实施例1

s4mab-peptide-peg-plphe@spions的合成：

首先，使pd-1抗体(goinvivo^tmanti-mousecd279，biolegend)巯基化，简要操作步骤如下：取1ml1mg/ml的抗体溶液(ph为7.4)，加入10μl100mmpbs和30mmedta(ph为7.4)，加入0.7mg2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-it，mw为137.6，5mm)，20℃反应45min。使用hitrap^tm柱进行快速脱盐纯化(puresystem)，洗脱液组成:10mmpbs+3mmedta(ph为7.4)，检测波长：280nm，按照1ml/管收集样品。合并含有蛋白的溶液，超滤(mwco:10k)浓缩，定量至2.5ml。用紫外分光光度法或者elisa法测定抗体浓度，回收率约80％。使用dtnb测定巯基的含量，测的平均每个抗体分子引入3.2个巯基。

其次，pd-1抗体上的巯基与mal-peptide-alkyne的马来酰亚胺基加成，从而引入炔基(alkyne)，简要操作步骤如下：称取2.5mgmal-peptide-alkyne(mw为1013.5，1mm)溶于30μldmso，加入到上述巯基化的抗体溶液中，4℃搅拌过夜。使用hitrap^tm柱进行脱盐纯化(puresystem)，洗脱液组成:10mmpbs，ph7.4，检测波长：280nm，按照1ml/管收集样品。合并含有蛋白的溶液，超滤(mwco:10k)浓缩，定量至2ml。用紫外分光光度法或者elisa法测定抗体浓度，回收率约81％。

最后，pd-1抗体上的炔基与胶束表面的叠氮基进行点击反应，具体操作步骤如下：取上述制备得到的0.5mln3-peg-plphe@spions的胶束溶液(叠氮基约为0.18μmol)，加入5μlcu(ii)bsc(1mg/ml)后，冻融除氧，重复2次。加入上述制备的炔基化的抗体溶液(抗体约0.64mg，炔基约0.0085μmol)和2mg维生素c，室温下反应过夜。得到的载体抗体负载量大于实施例1。并且通过与实施例1的相同的步骤s6后，得到抗体占载体质量的2.0％。