一种原卟啉‑锌铝水滑石复合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于无机-有机复合功能材料和药物缓控释领域，具体涉及一种具有缓释作用的原卟啉-锌铝水滑石复合物及其制备方法与应用。

背景技术：

原卟啉钠(protoporphyrinsodium，prolmon，napp)，化学名为3,7,12,17-四甲基-8,13-二乙烯基-2,18-卟吩二丙酸钠，又名保肝能，是从健康牛、猪血液中提制得到的原卟啉(protoporphyrinix)的水溶性钠盐。原卟啉钠是一种常用的保肝药，具有促进细胞组织呼吸，改善蛋白质和糖代谢，抗补体结合等作用。临床用于各型病毒性肝炎的治疗，可使症状改善，肝肿缩小，氨基转移酶、浊度试验、黄疽指数等指标改善。

水滑石，又称为层状双羟基复合金属氧化物(layereddoublehydroxide，)，是具有独特层状结构的无机二维材料。水滑石其组成可表达如下：

[(m²⁺)1-x(m³⁺)x(oh)2]^x+(a^n-)x/n·mh2o

上式中，二价金属离子m²⁺可以是mg²⁺、ni²⁺、co²⁺、zn²⁺、cu²⁺等；三价金属离子m³⁺可以是al³⁺、fe³⁺、cr³⁺等；a^n-是层间可交换的阴离子，包括无机阴离子(co3^2-、no3^-、so4^2-或cl^-)、有机阴离子和杂多阴离子；x值为0.16～0.33，对应于二价阳离子m²⁺与三价阳离子m³⁺的比率为4：1～2：1；m表示层间的水分子的数目。本发明所使用的是锌铝水滑石。锌铝水滑石在甲酰胺中可以被剥离成带正电荷的二维平面纳米片。

原卟啉钠分子结构中含有coo^-，为离子型化合物，在胃中质子化转化为分子化合物后才能被人体吸收。但是弱酸性药物对胃都有比较强的刺激性，如阿司匹林、布洛芬等，原卟啉钠也具有胃酸刺激副作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种原卟啉-锌铝水滑石复合物及其制备方法和应用。原卟啉-水滑石复合物可作为原卟啉口服缓释制剂，该缓释制剂不但能够克服原卟啉的胃酸刺激副作用，并可以有效地原卟降低啉光毒性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所提供的原卟啉-锌铝水滑石复合物由锌铝水滑石和原卟啉组成，两者之间存在静电相互作用，原卟啉吸附锌铝水滑石表面；原卟啉的重量含量为0.01-50％。水滑石(包括其类似物)，为层状双羟基复合金属氧化物，是具有层状结构的无机二维材料。本发明用到的水滑石是锌铝水滑石，并且层间阴离子为no3^-，其组成为：[zn1-xalx(oh)2]^x+(no3^-)x·mh2o,x值为0.16-0.33，m值为0.5-2。

原卟啉(protoporphyrinix)，是带有阴离子取代基的卟啉配合物。原卟啉及其水溶性钠盐原卟啉钠结构如下：

本发明所述的原卟啉-锌铝水滑石复合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备锌铝水滑石：配制锌离子和铝离子的混合盐溶液、碱液以及含有硝酸根离子的水溶液；所述混合盐溶液中锌离子和铝离子的摩尔比为2:1，所述碱液中氢氧根离子的物质的量为锌离子和铝离子物质的量之和的2倍；

在温度15-30℃，氮气保护及搅拌条件下，将上述混合盐溶液和碱液同时滴入到含有硝酸根离子的水溶液中，滴加完毕后升温至50-70℃，老化1-3h，老化完毕将反应液倒入高温高压反应釜中，在110-130℃下水热反应6-12h得到粗产品，所述粗产品通过离心、洗涤、干燥后，得到硝酸根型锌铝水滑石；

(2)剥离锌铝水滑石获得纳米片凝胶：将上述硝酸根型锌铝水滑石加入甲酰胺溶液中，超声溶胀15-35min得到混合液，然后再将混合液在冰浴中(控制混合液温度不超过30℃)用超声波粉碎机强力超声15-35min，所得透明溶液静置后形成无色锌铝水滑石纳米片凝胶；

(3)制备原卟啉-锌铝水滑石复合物：将原卟啉钠溶于无水乙醇中，用naoh溶液调节体系表观ph为10，得到溶液a；

将步骤(2)得到的锌铝水滑石纳米片凝胶溶于甲酰胺中，得到溶液b；

在温度15℃-30℃，氮气保护下，将溶液a滴加到溶液b中，升温至40-50℃，继续搅拌反应1-2h，产物通过离心、洗涤、干燥处理后，即得原卟啉-锌铝水滑石复合物。

进一步，所述步骤(2)，硝酸根型锌铝水滑石与甲酰胺的比例为1000毫克∶40-60毫升。

所述步骤(3)，溶液b中锌铝水滑石纳米片凝胶与甲酰胺的体积比为1∶3。

本发明制备的原卟啉-锌铝水滑石复合物在水溶液中的粒度为180-300nm。

本发明采用以上技术方案，利用原卟啉阴离子与水滑石之间的静电相互作用，构建了一种新颖的原卟啉-水滑石复合物，发现原卟啉-水滑石复合物可作为原卟啉在胃部吸收的缓释制剂，该缓释制剂不但可克服原卟啉的胃酸刺激副作用，并可以有效地降低其光毒性，具有显著的临床应用价值。

本发明的显著优点在于：

(1)制备锌铝水滑石的原材料价格低廉，来源丰富。

(2)制备过程操作简便，重现性高。锌铝水滑石及其在甲酰胺中剥离所得的凝胶，性质稳定，便于储存，有利于在工业生产中大批量制备。

(3)水滑石类化合物通常都有很小的比表面积(5-20m²/g)。本发明将锌铝水滑石在甲酰胺中剥离成带正电荷，有二维平面属性的纳米片，可以有效地提高其比表面，进而提高锌铝水滑石与原卟啉的接触面积，使锌铝水滑石能更多更牢固地承载原卟啉。

(4)甲酰胺是有毒性的，对生物体有较大的危害。本发明通过napp与甲酰胺中的锌铝水滑石纳米片静电引力相互作用，破坏水滑石纳米片在甲酰胺中的溶胶体系，从而使复合物沉淀下来，然后用水洗掉沉淀上残留的甲酰胺就可以彻底去掉甲酰胺。

(5)锌铝水滑石在胃中被胃酸分解成无机盐，口服安全无毒。

(6)原卟啉-水滑石复合物可作为原卟啉口服缓释制剂，该缓释制剂不但可克服原卟啉的胃酸刺激副作用，并可以有效地降低原卟啉的光毒性。

附图说明

图1是硝酸根型锌铝水滑石(zn2-al-no3-ldhs)的x射线衍射(xrd)谱图。

图2是锌铝水滑石在甲酰胺中的剥离所得凝胶(zn2-al-ldhs-exfoliation)的x射线衍射(xrd)谱图。

图3是原卟啉-锌铝水滑石复合物(ppix-ldhs)、原卟啉钠(napp)、锌铝水滑石(zn2-al-no3-ldhs)的红外谱图。

图4是原卟啉钠(napp)及其与锌铝水滑石的复合物(ppix-ldhs)在二甲基亚砜(dmso)中的紫外可见吸收光谱图(napp浓度为2.3μm，ppix-ldhs为2.35μm)。

图5是原卟啉钠(napp)及其与锌铝水滑石的复合物(ppix-ldhs)在二甲基亚砜(dmso)中的荧光光谱图(napp浓度为2.3μm，ppix-ldhs浓度为2.35μm)。

图6是原卟啉-锌铝水滑石复合物(ppix-ldhs)在ph＝2.4的缓冲溶液中，ppix随时间的释放曲线。

图7是相同浓度(6.5μm)的原卟啉-锌铝水滑石复合物(ppix-ldhs)、原卟啉钠(napp)、锌铝水滑石(zn2-al-no3-ldhs)在光照下使化学探针1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)降解的曲线。

具体实施方式

本发明所述的原卟啉-锌铝水滑石复合物的制备方法包括以下步骤：

(1)制备锌铝水滑石：配制锌离子和铝离子的混合盐溶液、碱液以及含有硝酸根离子的水溶液；所述混合盐溶液中锌离子和铝离子的摩尔比为2:1，所述碱液中氢氧根离子的物质的量为锌离子和铝离子物质的量之和的2倍；

在温度15-30，℃氮气保护及搅拌条件下，将上述混合盐溶液和碱液同时滴入到含有硝酸根离子的水溶液中，滴加完毕后升温至50-70，℃老化1-3h，老化完毕将反应液倒入高温高压反应釜中，在110-130℃下水热反应6-12h得到粗产品，所述粗产品通过离心、洗涤、干燥后，得到硝酸根型锌铝水滑石；

(2)剥离锌铝水滑石获得纳米片凝胶：将上述硝酸根型锌铝水滑石加入甲酰胺溶液中(1000毫克锌铝水滑石需要甲酰胺40-60毫升)，超声溶胀15-35min得到混合液，然后再将混合液在冰浴中(控制混合液温度不超过30℃)用超声波粉碎机强力超声15-35min，所得透明溶液静置后形成无色的锌铝水滑石纳米片凝胶；

(3)制备原卟啉-锌铝水滑石复合物：将原卟啉钠溶于无水乙醇中，用naoh溶液调节体系表观ph为10，得到溶液a；

将步骤(2)得到的锌铝水滑石纳米片凝胶溶于其3倍体积的甲酰胺中，得到溶液b；

在温度15℃-30℃，氮气保护下，将溶液a滴加到溶液b中，升温至40-50℃，继续搅拌反应1-2h，产物通过离心、洗涤、干燥处理后，即得原卟啉-锌铝水滑石复合物。

步骤(1)制备的锌铝水滑石的组成表达为：[zn1-xalx(oh)2]^x+(no3^-)x·mh2o，x值为0.16-0.33，m值为0.5-2，所得原卟啉-锌铝水滑石复合物中原卟啉的重量含量为0.01-50％。复合物在水溶液中的粒度为180-300nm。

测得原卟啉-锌铝水滑石复合物的表面电位为30-40mv，克服了因原卟啉呈弱酸性而具有胃酸副作用的不足。

在胃液环境条件下的缓释实验表明，原卟啉-锌铝水滑石复合物可在1小时左右缓释出原卟啉，原卟啉-锌铝水滑石复合物可作为有效的原卟啉缓释制剂，可改善原卟啉的胃酸副作用。

光敏毒性实验表明，原卟啉-锌铝水滑石复合物可完全抑制原卟啉的光敏毒性。

为了进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的说明。

实施例1

(1)硝酸根型锌铝水滑石的合成：称取1.19gzn(no3)2·6h2o(4mmol)，0.75gal(no3)3·9h2o(2mmol)，溶于40ml煮沸除去二氧化碳的水中，配成混合盐溶液。称取0.486g(12mmol)naoh,溶于40ml去二氧化碳水中，配成碱液。称取1g无水nano3，溶于20ml去二氧化碳水中，配成水溶液。常温(15℃-30℃)，在氮气保护及强力机械搅拌的条件下，将混合盐溶液与碱液缓慢滴入nano3水溶液中，严格控制滴速，使混合盐溶液与碱液的滴加速度完全一致。滴加完毕后，提高反应液温度至50-70℃，老化1-3h。老化完毕，将反应液倒入高温高压反应釜中，在120℃下水热6-12h，再用去二氧化碳水洗三次，洗掉盐分。将亮白色沉淀在40℃下真空干燥，得到的白色固体即为锌铝水滑石。最后将所得白色固体用研钵研磨至细粉状，隔绝空气保存在放有变色硅胶的干燥器内。

(2)锌铝水滑石在甲酰胺中的剥离：称取步骤(1)得到的锌铝水滑石0.4g倒入玻璃试管内，加入20-30ml甲酰胺，放到数控超声波清洗器内超声15-35min，然后再将试管放置在冰浴中，控制温度不超过30，℃用细胞超声波粉碎机强力超声15-35min，所得透明溶液静置后，形成无色的锌铝水滑石纳米片凝胶。

(3)原卟啉-锌铝水滑石复合物的制备：称取12.4mg原卟啉钠溶于20ml无水乙醇中，并用0.01mol/l的naoh溶液调表观ph＝10，得到原卟啉的无水乙醇溶液。用移液枪取步骤(2)制备好的锌铝水滑石纳米片凝胶5ml(凝胶浓度20mg/ml)，溶于15ml甲酰胺中，得到锌铝水滑石的甲酰胺溶液，将锌铝水滑石的甲酰胺溶液倒入100ml三径烧瓶，固定在带有磁力搅拌装置的恒温油浴锅内。将原卟啉的无水乙醇溶液倒入50ml恒压滴液漏斗中。常温(15℃-30℃)，在氮气保护并在磁力搅拌下，将原卟啉的无水乙醇溶液液缓慢滴加到锌铝水滑石的甲酰胺溶液中。滴完后，将混合液温度提升至40-50℃，反应1-2h。反应完毕，将所得的棕红色泥浆液，通过高速离心机用纯水清洗，直至上清液无色。将沉淀物在40℃真空干燥12h，得到的棕红色固体即为原卟啉-锌铝水滑石复合物。最后将该棕红色固体用研钵研磨至细粉状，置于棕色干燥器内避光保存。

实施例2

本实施例测试了硝酸根型锌铝水滑石和剥离后锌铝水滑石纳米片凝胶的x射线衍射峰，分别见图1和2。从图1看出，所制得的材料是典型的锌铝水滑石。

根据文献《chemicalcommunications》,2014,50(70):10130-2，可知水滑石如果在甲酰胺中成功的被剥离成单片，对所形成的凝胶做x射线衍射，水滑石特征峰(003)、(006)会消失，并且在2θ等于25°左右会出现一个宽而强度较弱的衍射峰。将形成的凝胶均匀的涂抹在载玻片上，尽量保证凝胶面平滑，做xrd表征，所得结果见图2，与文献报道完全一致，说明已获得锌了铝水滑石纳米片。xrd表征的测试参数全部为：cu靶，kα射线，扫描速度10°/min。

实施例3

原卟啉钠napp含有的阴离子基团-coo^-是弱酸根离子。如果溶液的ph值太低，大量的-coo^-就会转化为cooh。就算在中性溶液，-coo^-也会发生水解作用，部分转化为-cooh。必须保证有足量的-coo^-，才能和带正电荷的锌铝水滑石纳米片发生静电吸附作用，而制备出复合物。为了保持-coo^-解离度，溶液必须调成偏碱性，但是如果溶液碱性太强，锌铝水滑石(zn2-al-no3^--ldhs)结构会被破坏。

为了探索溶液ph值对锌铝水滑石-卟啉复合物合成的影响，分别将napp无水乙醇溶液的表观ph值调到9、10、11，与锌铝水滑石纳米片进行三组平行实验。如果napp无水乙醇溶液的表观ph值为9，离心(离心速度15000r/min)所得反应液并不能得到沉淀，如果用激光笔照射反应混合液，会有明显的丁达尔效应，说明napp中-cooh就没有足够的解离度，不能有效地和水滑石纳米片发生静电引力破坏水滑石纳米片的胶体体系。如果napp无水乙醇溶液的表观ph值为11，将反应多得的红棕色粉末做x射线衍射，几乎没有xrd衍射峰，说明该粉末基本没有晶体结构，水滑石已经遭到破坏。只有当napp无水乙醇溶液的表观ph值为10时，既能保证ppix中-cooh有足够的解离度，又能保护水滑石特有的层状晶体结构不受破坏。

实施例4

图3是原卟啉-锌铝水滑石复合物(ppix-ldhs)、原卟啉(napp)、锌铝水滑石(zn2-al-no3-ldhs)粉末与无水kbr压片所作的ft-ir光谱图。在3400cm^-1处出现的宽而强的峰是水滑石层间水分子或者层板上-oh伸缩振动的特征峰，napp是钠盐，故无此峰。在1383cm^-1处是no3^-的特征吸收峰。在700cm^-1和616cm^-1位置的吸收峰归属于zn-o和al-o的晶格振动。424cm^-1是水滑石类化合物的特征吸收峰。napp上的1617cm^-1和1563cm^-1吸收峰分别来自c＝o和芳香环上的伸缩振动。

分析此红外光谱，可以观察到：(1)ppix-ldhs在1383cm^-1处no3^-的特征吸收峰比zn2-al-no3-ldhs要弱；(2)ppix-ldhs上并没有c＝o的特征吸收峰，只剩下位于1580cm^-1处芳香环的伸缩振动峰；(3)ppix-ldhs和zn2-al-no3-ldhs都具有在424cm^-1处水滑石类化合物的特征峰。我们可以得出以下结论：napp取代部分ldhs上的no3^-，使其的特征吸收峰变弱，napp上的c＝o与ldhs上的-oh产生氢键，使ppix-ldhs上c＝o伸缩振动消失，napp被成功的复合到了ldhs上。

实施例5

滴加一定量ppix-ldhs到2ml的dmso内，测uv-vis光谱。加入20μl1mol/l的盐酸将水滑石破坏，再加入20μl1mol/l的氢氧化钠，再测uv-vis光谱，先加酸是破坏水滑石结构，再加碱是将释放出来的ppix转化为钠盐napp。附图4可见，ppix从ppix-ldhs释放出来后，其紫外可见吸收光谱不会发生任何改变，说明其性质不会发生任何的改变。用相同方法，做荧光光谱实验，会得到相似结果，见，图5。结合图4，可以充分的证明，napp与zn2-al-no3-ldhs形成了稳定的复合物。同时，此方法也是标定ppix-ldhs溶液中所含ppix浓度的方法。

实施例6

负载率的测定是进行后续ph释放实验的前提。具体方法是：称取1mg的复合物粉末，分散在dmso中，加一定体积1mol/l的盐酸破坏水滑石，再加一定体积的1mol/l的氢氧化钠调节ph值，然后稀释一定倍数测吸光度。根据方程式：w％＝navm/εm计算出负载率。其中w％是药物在复合物中的质量百分比(即负载率)，n是稀释倍数，a是测量的吸光度，ε是摩尔吸光系数，m是药物的相对分子量，v是比色皿中液体的体积，m是所称取复合物的质量

实施例7

在饭后，胃内的ph值在2.0-3.0之间。配制ph＝2.4的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲溶液，称取5mgppix-ldhs倒入30ml缓冲溶液中，放在磁力搅拌器上充分搅拌，并控制温度在37.5。℃取时间点5min、10min、20min、30min、40min、50min，分别取2ml液体，在16000r/min的转速下，离心2min，取上清液10μl加到dmso中测紫外吸收光谱，测q带吸光度。通过上述方法测得的ppix在复合物中的负载量，可以计算出复合物中ppix全部释放时q带的吸光度，进而计算出释放百分比。结果见附图6，可以看到，ppix-ldhs在ph＝2.4的环境下，能够维持50min才能全部释放。所以把原卟啉钠(napp)与锌铝水滑石制备成复合物，饭后服用，在胃里具有较好的缓释性能，可以有效地降低对胃部的刺激。

实施例8

原卟啉在光照下可以产生单线态氧，而单线态氧具有较强的细胞毒性，所以原卟啉具有光毒性。我们采用dpbf探针法来测试原卟啉-锌铝水滑石复合物的光毒性。dpbf的中文名称叫1,3-二苯基异苯并呋喃，它对于单线态氧极为不稳定，在单线态氧存在的环境中会迅速分解。

使用紫外分光光度计测量相同浓度的原卟啉钠在复合前后，能使同一浓度的dpbf降解的情况。为了减小系统误差，额外加上(1)只加dpbf，(2)加dpbf以及根据负载量换算的相同浓度的锌铝水滑石，(3)只加napp三组空白对照。实验在二甲基亚砜(dmso)中进行，用日光灯投过绝热水池照射，选取30s、60s、90s、120s、150s五个时间点，测量dpbf在最大吸收波长(415nm)处的吸光度。并通过dpbf的紫外吸收光谱的变化计算出dpbf的残存百分比。

napp在dpbf最大吸收波长415nm处有较强的吸收峰，只要napp对光稳定，并不会影响实验的结果，只需要减掉它的固定吸收值即可。实验结果表明，在150s内napp自身并不会因为光照而降解，因此可以断定415nm处吸收峰强度的变化，全部来自于dpbf。为了直观地看到napp在复合前后，遇光产生单线态氧能力的变化，以dpbf的残留百分比为纵坐标，以照射时间为横坐标作图7。可以看到napp和zn2-al-no3-ldhs形成复合物以后，产生单线态氧的能力降低了77.9％。因此napp与zn2-al-no3-ldhs形成复合物以后，可以有效地降低其光毒性。