一种人脐血来源的调节性巨噬细胞及其分离纯化和培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及调节性巨噬细胞的来源、分离纯化及培养的技术领域。具体涉及一种利用人脐带血诱导培养得到的具有免疫抑制能力的调节性巨噬细胞，及其分离纯化和培养方法。
【背景技术】
[0002]尽管现在已有广谱的免疫抑制剂用于阻止急性移植后器官排斥的发生，但是终生使用免疫抑制药物，将引起的众多不良副反应，如肾毒性，代谢紊乱，心血管疾病以及导致感染或者肿瘤发生风险增加。因此寻找合适的长效免疫抑制方法仍然是现在的研究热点。调节性巨噬细胞是近年来研究发现的一组高度分化具有高效抑制T细胞应答潜能的巨噬细胞亚群，它能够用于预防和治疗免疫排斥，目前已经在临床实验上开展，在器官移植后诱导移植物免疫耐受。调节性巨噬细胞是从外周血中CD14+单核细胞诱导而来，在特殊培养基中培养6天后加入γ干扰素刺激24小时，分化后的调节性巨噬细胞具有均一性表型为CD14-/low HLADR+CD80-/low CD86+⑶16-，能够通过直接接触吞噬T细胞，或者增强吲哚胺2，3双加氧酶(ID0)表达剥夺色氨酸，间接抑制T细胞的增值(Hutchinson JA, Riquelme P ,Sawitzki B,et al.Cutting edge:1mmunologicalconsequences and trafficking ofhuman regulatory macrophages administeredto renal transplant recipients.JImmunol 2011; 187:2072-2078)。在欧洲多中心合作的One Study临床研究中，已经开始在肾移植后使用供体来源的调节性巨噬细胞，经过一年多的追踪随访，认为其在肾移植上的使用是安全及有效的(James A.Hutchinson,Paloma Rique Ime , and EdwardK.GeissIer.Human regulatory macrophages as a cell—based medicinalproduct.Curr Opin Organ Transplant2012; 17:48-54)。因此在临床应用中，使用调节性巨噬细胞将成为一种很有潜力的预防移植后免疫排斥的干预措施。
[0003]但是供体来源的调节性巨噬细胞必须在供体经过外周血动员后培养7天才能得到足够移植的量，而如果使用DCD供体来源的器官，则较难得到这种免疫调节细胞，这使其在移植免疫上的应用大大受到限制。脐血内含有丰富的造血干/祖细胞，自上世纪90年代以来，脐血干细胞移植技术在全世界得到快速发展，世界各国脐血库应运而生，将原本自然流失的脐带血，经分离检测深低温保存，以备临床应用。现在已有多种细胞可以从脐血中获得，如间充质干细胞，调节性T细胞等。从脐血中获得的细胞因其来源广泛、无创伤性、并且免疫原性低，十分适合在临床使用。如人脐血来源的调节性T细胞就比从外周血来源调节性T细胞的在第三方移植受体中存活时间更长，发挥的功能更加强大。因此，如果我们能够从脐血中分离并诱导得到调节性巨噬细胞，并确定纯度和功能，将大大有助于其在临床上的使用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的旨在提供一种具有良好的免疫抑制能力的人脐血来源的调节性巨噬细胞，并建立一种稳定的从人脐血中分离获取以及培养该种调节性巨噬细胞的方法。本发明确立了人脐血来源的调节性巨噬细胞在产量、纯度、功能等方面相对于常规来源于成体外周血的调节性巨噬细胞存在一定优势。
[0005]—种人脐血来源的调节性巨噬细胞。
[0006]所述的人脐血来源的调节性巨噬细胞的分离纯化方法，用密度梯度离心法分离得到脐血单个核细胞，通过⑶14+免疫磁珠阳性分离获得富含调节性巨噬细胞的⑶14+胞群。
[0007]具体包括以下步骤:
[0008]I)脐血单核细胞分离:以1ml人淋巴细胞分离液置于50ml离心管下层，然后收集抗凝脐带血用PBSl:1稀释后得到的40ml血细胞悬液轻柔加在上层，两层之间有明显界限，20°C，1800-2000rpm离心30分钟，吸取中间云雾层获得单个核细胞，PBS洗涤2次后计数；
[0009]2)CD14+阳选:
[0010](I)收集步骤I)得到的细胞，然后用分选缓冲液Sorting buff er以1.25 X 15个cells/ul重悬，每16个细胞加入2μ1的CD14 MicroBeads微磁珠，4°C孵育10-15分钟；
[0011 ] (2)以每16个细胞加入0.2-0.3mlSorting Buffer终止微磁珠与细胞的结合，1200rpm离心10分钟，每18个细胞用500μ1的Sorting Buffer重悬待用；
[0012](3)选择LS分离柱，将分离柱安装入磁场中，每次加入Iml Sorting Buffer缓冲液洗柱，洗3次，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；
[0013](4)将细胞悬液加入分离柱中，在重力作用下自然流尽，收集流出分离柱的液体，此时流出来的细胞为CD14-细胞；
[0014](5)将LS分离柱移出磁场，在分离柱下接无菌离心管，往分离柱中加入5mlSorting Buffer缓冲液，用活塞将附在分离柱上的细胞压入离心管中，继续往分离柱中加入5ml Sorting Buffer缓冲液重复该步骤一遍，计数细胞后1200rpm离心10分钟，得到的细胞为⑶14+细胞；
[0015](6)将步骤(5)得到的细胞以每18个细胞用500μ1的Sorting Buffer重悬；重复操作步骤(3)—(5)—次；
[0016](7)分离⑶14+细胞用PBS洗涤2次后待培养。
[0017]所述的人脐血来源的调节性巨噬细胞的培养方法，包括以下步骤:
[0018]I)用新鲜配制的调节性巨噬细胞培养基重悬细胞浓度为16个cellS/3-5ml，放入促进细胞贴壁的培养皿中37°C，5 % CO2培养，隔天换液;所述的调节性巨噬细胞培养基是在RPM1-1640培养中添加10-12%的人AB血清、5-10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子M-CSF、1%青霉素和链霉素双抗；
[0019]2)培养至第6天时加入终浓度为25-50ng/ml的干扰素IFN-γ刺激18-24小时；
[0020]3)培养至第7天，获得调节性巨噬细胞。
[0021]本发明的优点在于:确定了脐血来源的调节性巨噬细胞的分离诱导纯化以及培养方法，通过将成体外周血来源的调节性巨噬细胞与其在形态、产量、表型、功能等方面作对比。发现脐血来源的调节性巨噬细胞表型与成体外周血来源的调节性巨噬细胞类似，功能优于外周血来源的调节性巨噬细胞，因此可以建立在临床上供第三方使用的调节性巨噬细胞库。
【附图说明】
[0022]图1为两种不同来源调节性巨噬细胞显微镜下形态，放大倍数；
[0023]外周血来源(左)及本发明的调节性巨噬细胞(右)细胞形态放大倍数(100X);
[0024]图2为外周血来源及本发明脐血来源的调节性巨噬细胞在单个核细胞中分选诱导后的得率；
[0025]图3为流式细胞术检测成体外周血来源及本发明脐血来源的调节性巨噬细胞表型；
[0026]图4脐血来源调节性巨噬细胞抑制效应细胞的效果；
[0027]图5外周血来源及本发明脐血来源的调节性巨噬细胞对淋巴细胞抑制效果的比较分析。
【具体实施方式】
[0028]为了更清楚地说明本发明，列举以下实施例，但其对本发明的范围无任何限制。
[0029]在以下实施例中，获取30例正常分娩足月胎儿的脐静脉血，结扎剪断脐带后立即进行脐静脉穿刺采血，肝素抗凝。该实验得到了中南大学湘雅三医院伦理委员会的批准。进行实验时，所采用的操作方法和操作步骤等，都是依据本技术领域的普通技术人员熟知的方法设计和实施。
[°03°] 如无特殊说明，细胞培养用的培养基和营养因子均购自Life technology和Sigma等全球各大生物试剂公司。所述焚光标记的鼠抗人抗体购自美国613；[08(^61186或130公司；Ficoll-Plus人淋巴细胞分离液购自GE生物公司，FC500流式细胞仪为美国贝克曼-库尔特公司，分选CD 14+细胞的磁珠选用MACS Milteny B1tec公司的CDl4+Microbeads(human)磁珠分离试剂盒。
[0031 ]材料:磷酸缓冲液PBS、人血白蛋白、Cro-A(含腺嘌呤的柠檬酸-磷酸-葡萄糖溶液，购于Sigma公司)、CD14 MicroBeads微磁珠(取自MACS Milteny B1tec公司的CD14+Microbeads(human)磁珠分离试剂盒)、TrypLE Express?酶、BSA(牛血清白蛋白)、NaN3、FcR-block(Fc受体封闭剂)、IFN- γ ( γ干扰素)、RPMI_1640培养基、人AB血清、M-CSF巨细胞集落刺激因子、青霉素和链霉素(双抗)、Ficoll-PluS人淋巴细胞分离液；
[0032]Sorting buffer分选缓冲液(PBS中含有10_12%CPD_A和0.5%人血白蛋白)
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