一种具有免疫抑制功能的寡核苷酸的制作方法

专利名称：：一种具有免疫抑制功能的寡核苷酸的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种对因细菌或病毒成分引起的异常增强的免疫反应具有抑制功能的寡核苷酸及其在预防和治疗与该种异常增强的免疫反应相关疾病中作为药物的用途。
背景技术：
：DavidS.Pisetsky在1994年首先发现S-oligo(dG)2Q能抑制刀豆蛋白A(ConA)、大肠杆菌DNA、佛波酯(PMA)、钙离于载体A23187诱导的小鼠脾细胞产生1FN-y。1998年，ArthurM.Krieg研究发现，腺病毒的一个DNA基序可以抑制CpGODN引起的免疫激活。随后DavidS.Pisetsky在2000年研究发现小牛胸腺DNA和人胎盘DNA抑制大肠杆菌DNA诱导的小鼠脾细胞分泌IL-12,同时发现(dG)3()、(dA)30、(dC)3。、(dT)3。可抑制大肠杆菌DNA、脂多糖(LPS)和CpGODN诱导的[L-12产生。2003年，DennisM.Klinman实验发现，哺乳动物端粒重复序列可抑制细菌DNA和CpGODN诱导的免疫激活，这是首次在哺乳动物DNA中找到具有免疫抑制功能的序列。Toll样受体(Tolllikerec叩tors,TLRs)是一个识别微生物(细菌或病毒成分)来源的病原体相关模型分于(pathogen-associatedmolecularpattern,PAMP)的受体家族，表达TLRs的免疫细胞通过结合PAMP而被激活。近年的研究表明，TLRs的激活和败血症、扩张性心肌病、糖尿病系统性红斑狼疮、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎、动脉粥样硬化、哮喘、慢性阻碍性肺疾病和器官衰竭的发生有关(TheWritingCommitteeoftheWorldHealthOrganization(WHO)ConsultationonHumanInfluenzaA/H5.AvianInfluenzaA(H5N1)InfectioninHumans.NEnglJMed2005;353:1374-85)。其他因素引起的免疫系统激活、细胞因子风暴等也给机体带来伤害性反应。有文章报道，树突状细胞摄取凋亡细胞碎片及核酸可以激活TLRs，由此引发的IFN-a/[3大量分泌将会导致系统性自身免疫性疾病，同时B细胞也可以通过TLR被激活而增殖，可能也会加剧上述疾病过程。细菌毒素激活单核-巨噬细胞系统，进而引起的全身一系列炎症反应过程，造成脓毒症的临床表现。最新的研究资料表明，TLR9和脓毒血症密切相关，抑制TLR9的激活，可以减轻脓毒血症的致命性(PlitasG，etal.Toll-likereceptor9inhibitionreducesmortalityinpolymicrobialsepsis.JExpMed.2008Jun9;205(6):1277-83)。现有研究发现，TLR9和系统性红斑狼疮(SystemicL叩usErythematosus,SLE)关系密切。活动期的SLE患者外周血B细胞TLR9的表达水平和SLE活动指数及血.清总补体溶血活性具有显著意义的正相关，提示可以通过抑制TLR9的活性来治疗SLE(NakanoS,etal.Roleofpathogenicauto-antibodyproductionbyToll-likereceptor9ofBcellsinactivesystemiclupuserythematosus.Rheumatology(Oxford).2008Feb;47(2):145-9)。TLR9和糖尿病亦有密切关系，TLR9信号通路和自身免疫性糖尿病相关，TLR9拮抗剂(如氯喹)可zipris，etal.TLR9-SignalingPathwaysAreInvolvedinKilhamRatVirus-InducedAutoimmuneDiabetesintheBiobreedingDiabetes-ResistantRat.TheJournalofImmunology,2007,178:693—701)。其他因素引起的免疫系统激活、细胞因子风暴等也给机体带来伤害性反应，
发明内容目的发明一种对因细菌成病毒成分引起的异常增强的免疫反应或Toll样受体(TolllikeReceptor,TLR)异常激活具有抑制功能的寡核苷酸，从而达到治疗由细菌或病毒成分引起的异常增强的免疫反应或Toll样受体(TolllikeReceptor,TLR)异常激活导致的疾病的目的。技术方案及效果1、人工合成的一种寡核苷酸，其寡核苷酸序列上的特征是含有一个或多个如下所述的基本序列5'—ACCCCCTCT—3'，包括但不限于SEQNO.l成SEQNO.2成SEQNO.3序列所示的寡核苷酸，以上所述的寡核苷酸可被化学修饰，化学修饰的部位可以是磷酸骨架、核糖、碱基，修饰方式包括但不限于硫代修饰。2、上述寡核苷酸用于制备用亍治疗由细菌或病毒成分引起个体异常增强的免疫反应导致的疾病的制剂的用途(1)CpG二核苷酸是细菌基因组特征性组成成分，本发明提供的寡核苷酸可以抑制由含有CpG二核苷酸的寡核苷酸CpG2216引起的小鼠脾细胞抗病毒物质的产生；抑制含有CpG二核苷酸的寡核苷酸CpG2006、CpG684、CpGC274引起的小鼠脾细胞增殖。(2)本发明提供的寡核苷酸可以抑制灭活病毒HSV-1(单纯疱疹病毒)或灭活病毒PR8、FMl-Flu(两个流感病毒)弓I起的人外周血单个核细胞抗病毒物质的产生。3、上述寡核苷酸用于制备用于预防或治疗个体中和Toll样受体(TolllikeRec印tor,TLR)异常激活相关的疾病的制剂的用途(1)CpG226是TOLL样受体激动剂，可激活TOLL样受体9(KrugA，etal.,2001),进而引起人外周血单个核细胞产生抗病$物质。本发明提供的寡核苷酸可以抑制A型CpGODN(CpG2216)引起的人外周血单个核细胞抗病3J物质的产生，且抑制作用随该寡核苷酸浓度的增加而增强。因此，本发明提供的寡核苷酸可以抑制TOLL样受体9激动剂CpG2216对TOLL样受体9的激活作用。(2)CpG2006为TOLL样受体激动剂，可激活TOLL样受体9(HartmannG,etal.,2000),进而引起人外周血单个核细胞增殖。本发明提供的寡核苷酸可以抑制B型CpGODN(CpG2006)引起的人外周血单个核细胞增殖，且抑制作用随该寡核节酸浓度的增加而增强。因此，本发明提供的寡核苷酸可以抑制TOLL样受体9激动剂CpG2006对TOLL样受体9的激活作用。(3)CpG684为TOLL样受体激动剂，可激活TOLL样受体9(WangX，BaoM,etal.,2008)，进而引起人外周血单个核细胞增殖。本发明提供的寡核昔酸可以抑制B型CpGODN(CpG684)引起的人外周血单个核细胞增殖，且抑制作用随该寡核苷酸浓度的增加而增强。闪此，本发明提供的寡核昔酸可以抑制TOLL样受体9激动剂CpG684对TOLL样受体9的激活作W。(4)CpGC274是TOLL样受体激动剂，可激活TOLL样受体9(MarshallJD,etal.，2003)，进而引起人外周血单个核细胞增殖。本发明提供的寡核昔酸可以抑制C荆CpGODN(CpGC274)引起的人外周血单个核细胞增殖，且抑制作用随该寡核苷酸浓度的增加而增强。闪此，本发明提供的寡核苷酸可以抑制TOLL样受体9激动剂CpGC274对TOLL样受体9的激活作用。(5)灭活病^HSV-1是TOLL样受体激动剂，可激活TOLL样受体9(BarratFJ,etal.，2005)，进而引起人外周血单个核细胞产生抗病苗;物质。本发明提供的寡核昔酸可以抑制灭活病毒HSV-1引起的人外周血单个核细胞抗病3J物质的产生。闪此，本发明提供的寡核tJ酸可以抑制TOLL样受体9激动剂灭活病3JHSV-1对TOLL样受体9的激活作HJ。(6)灭活流感病^PR8是TOLL样受体激动剂，可激活TOLL样受体7(BarratFJ,etal.，2005)，进而引起人外周血单个核细胞产生抗病^物质。本发明提供的寡核t酸可以抑制灭活病毒PR8引起的人外周血单个核细胞抗病^物质的产生。闪此，本发明提供的寡核tJ酸可以抑制TOLL样受体7激动剂灭活病;:5PR8-Flu对TOLL样受体7的激活作W。本发明中的术语"化学修饰"与C]然的DNA相比，本发明中的寡核苷酸可以有各种化学修饰，修饰的部位可发生在核tr之间的磷酸二酯键，核糖单位成/和冇机碱基(A、T、C、G)。在寡核n酸的合成期间成合成后都可以进行修饰。在合成期间的化学修饰可以在寡核tr酸的内部成5'端进行修饰。合成后的寡核昔酸可以但不限T在活性基团(如5'成3'端的磷酸成羟基)进行化学修饰。和相同序列的Q然形态的寡核tr酸相比，木发明中的寡核昔酸的化学修饰可以位丁/RJ部的磷酸—酯键成/和局部的核糖单位或/和局部的核昔碱基。木发明中的化学修饰包括寡核苷酸的骨架修饰。在这里，寡核昔酸的骨架修饰包括但不限于磷酸骨架修饰。磷酸骨架修饰可以是在核tr酸分于的一个稳定的磷酸骨架中，其中至少一个核苷酸间键合中的非桥性磷酸氧原于被硫原于取代。在本发明中的寡核苷酸中，核tr酸间键合中的非桥性磷酸氧原子可以部分成全部被硫原子取代。本发明中的寡核苷酸的骨架也可发生非离子DNA类似物，如烷基、芳香-碳磷酸盐化合物(带屯荷的碳磷酸盐化合物氧原于被烷基、芳香基取代)修饰，再如磷酸二酯和烷基磷酸二酯中的氧原于部分被烷基化修饰。本发明的寡核苷酸可以是磷硫酰和磷酸二酯的嵌合体。在本发明的寡核苷酸中，化学修饰还包括碱基替代，如C-5丙炔嘧啶和7-deaza-7替代喂呤替代。替代的嘌呤和嘧啶包括但不限丁腺喂呤、^嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、其它的ci然的和ir-ci然出现的碱基。在本发明的寡核苷酸中，化学修饰还包括碱基修饰。修饰的碱基在化学上不同丁典型的tl然中的碱基(如A、T、C、G。)，但贝.冇它们基本的化学结构。本发明中的寡核tJ酸还可以HJ胞嘧啶衍生物成胸腺嘧啶核苷衍生物修饰。这里胞嘧啶衍生物是指胞嘧啶样核苷(除外胞嘧啶)。胸腺嘧啶核苷衍生物是指胸腺嘧样核昔(不包括胸腺嘧啶)。另外，本发明中的寡核tr酸的修饰可以是在寡核昔酸的两个成一个末端连接连接一个二元醇，如四乙二醇或六乙'.醇。"微生物过强刺激宿土免疫系统引起的疾病"微生物入佼如果非常严重，有时可以在一个个体弓I起全身性炎症反应，导致微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病。如感染流感病毐A(H5N1)成SARS病毒的个体的血液中可山现高水平的下列物质TNF-a、IL-1、IL-6、IL-12、1FN-a、IFN-p、1FN吖、化学闪子干扰素诱导蛋A10、单核细胞趋化蛋A1、IL-8、IL-1-P。这种由于微生物感染而引起的血液中细胞闪子水平显巧升高，被称为细胞闪子血症成细胞闪于风暴。研究表明，感染禽流感病^成SARS病^的病人，除了需耍抗病SJ的药物外，还需耍抑制免疫反应的药物。微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病可表现为脓毒病综合征(sepsis)、急性呼吸窘迫综合扯(ARDS)和多器官衰竭(TheWritingCommitteeoftheWorldHealthOrganization(WHO)ConsultationonHumanInfluenzaA/H5.AvianInfluenzaA(H5N1)InfectioninHumans.NEngUMed2005;353:1374-85)。引起这类疾病的微生物包括病毒、细齒、寄生虫和哀.齒和海绵状脑病致病原。引起微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病的病毒包括SARS病毒、流感病毒、禽流感病^、HTV-1、脊髓灰质炎病^、甲型肝炎病^、肠道病^、人柯萨奇病^、鼻病SS属、埃可病^、马脑炎病毒、风疹病^、登革热病^、脑炎病毒、黄热病病毒、冠状病毒、疱疹性口炎病森、狂犬病病毒、埃博拉病^、副流感病^、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、汉坦病毒、bunga病毒、静脉病毒、Nairo病^、山血热病^、呼肠病毒、orbiviurses、轮状病毒、乙肝病毒、细小病毒组、乳头瘤病^、多瘤病毒、腺病3J、I刑单纯疱疹病^、II荆单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病3J、抱珍病毒、类天花病2J、痘苗病毒、痘病毒、非洲猪霍乱病毒、海绵状脑病致病原、丁荆肝炎病毒、丙.刚肝炎病為、口蹄疫病^。引起微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病的细齒包括幽门螺旋杆齒、Bordiaburgdorferi嗜肺性军团病齒、分枝杆齒、金黄色葡萄球齒、淋病双球齒、脑膜炎双球齒、单核细胞增多性李司忒(氏)齒、A组链球齒属、B组链球齒属、链球齒属、粪链球菌、牛链球齒、链球齒属(厌氧的链球齒)、肺炎链球齒、致病性Campylobacter链球齒、肠道球齒、流感(嗜血)杆齒、antracis杆齒、白喉梓状杆幽、棒状杆齒属、猪红斑丹^5丝齒、产气:黄膜芽孢梭齒、破伤风杆菌、肠道细菌(属)aerogeytes、肺炎杆齒、Pasturellamultocida、类杆齒属、A核梭杆齒、念珠状链杆菌、密螺旋体属、细弱密螺旋体、细螺旋体和放线齒属。引起微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病的真菌包括但不限于:隐球齒属新荆细球齒、夹膜组织胞浆菌、粗球孢子齒、皮炎芽生齒、沙服衣原体、A色念珠菌。引起微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病的真齒包括但不限丁恶性n原虫、鼠弓形体。"TOLL样受体激动剂"CpGODN是Toll样受体(Tolllikereceptors)9的激动剂。Toll样受体是--个识别微生物来源分于结构(病原体相关分子模荆)的受体家族。表达Toll样受体的免疫细胞通过结合这种病原体相关分子模型而被激活。在人类，Toll样受体家族共冇11个成员。Toll样受体可以识别很多病原微生物来源的物质，这些物质都是TOLL样受体激动剂。如，TLR4可以识别细齒脂多糖(LPS);TLR2和TLR6的双体可以识别脂磷壁酸和双酰脂肽;TLR2和TLR1的双体可以识别二酰脂肽;TLR9可以识別合成的成来源丁-细齒和病5i含CpG寡核tr酸(CpGODN);TLR5可以识别细菌鞭毛蛋A;TLR2和TLR6的双体还可以识别酵母多糖；TLR4可以识别呼吸道合胞病毒F蛋ft;TLR3可以识别聚肌昔酸胞嘧啶核Tj"酸(polyIC)，合成的成来源丁病^的双链RNA;TLR7和TLR8可以识别单链病毒RNA;TLR4可以识别原虫产物，如GPI锚定蛋白；TLR4还可以识别炎症组织的产物，如HSP60和纤维原片段(FooY.Liew，etal.NegativeregulationoftolllikereceptormediatedimmuneresponsesNatureReviewsImmunology.Vol5,June2005,446-458)。己经有研究证实，TLR9激动剂可以激活大然免疫反应和获得性免疫反应(ArthurM.Krieg.TherapeuticpotentialofToll-likereceptor9activation.NatureReviewsDrugDiscovery,Vol5.June2006,471-484)。在人类的免疫系统中，B细胞和浆细胞样树突细胞(pDCs)表达TLR9。含冇CpG的寡核tT酸(CpGODN)是TLR9的激动剂(D.M.Kli誦an,lmm画therapeuticusesofCpGoligodeoxy薩leotides,428Nat.Rev.,Immunol.4(2004)249-258)。TLR9激动剂可以被胞吞到细胞间隙而激活TLR9。在浆细胞样树突状细胞中，TLR9激活可以启始一个快速的大然免疫反应，其特征是分泌人呈的促炎K子如IL-6，肿瘤坏死闪子-a(TNFa)、I荆干扰素(IFN-a/p)和千扰素诱导的趋化闪子。通过干扰素依赖和干扰素非依赖两条通路，此浆细胞样树突细胞可以继发激活天然免疫细胞如NK细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。通过TLR9的刺激，B细胞增强了对抗原刺激的敏感性，可以有效地分化成抗体分泌细胞。因此，TLR9的刺激有助T获得性免疫应答，特别是体液免疫应答。"药物学上可接受的载体"药物学上可接受的载体是指一种或多种尚体或液体的填充剂、稀释剂成包封物质，此载体适合将本发明中的寡核tl酸应用于个体。该载体可以是有机的、无机的、大然的成合成的。该载体包括各种溶液、稀释剂、溶剂、分散剂、脂质体、乳剂、糖衣、抗菌剂、抗真齒剂、等渗的和延缓吸收的试剂、和其他的适合本发明中的寡核tJ酸应川的载体。药物学上可接受的载体的选择决定7:本发明中寡核苷酸应W方式。可注射HJ的载体包括水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖溶液、甘油等。对rl古l体混合物(如粉末、丸、片剂、胶囊形式)而,,常川的非5J性问体载体包括A有药理学纯度的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸镁等。另外，作为生物学上中性的载体，应W的药理学组分中可以含有非岛性的辅助物质，包括湿化成乳化剂、防腐剂、PH缓冲试剂，醋酸钠和单月桂酸酯等。"治疔有效剂呈"本发明中的寡核1J酸每次应MJ到个体的剂量范围从1)ag到100mg。为了达到理想的治疗效果，本领域技术熟练人员可以对应川的剂呈作调整，如主治医师在可靠的医疗判断的基础上，做山的剂量调整，其剂呈范围可以是前述范ffl的10倍到1000倍。"药物组合物"药物组合物指的是本发明中治疗有效剂呈的寡核苷酸或其与药物学上可接受的载体组成的混合物。药物组合物分可以包含一个成多个本发明中的寡核苷酸。药物组合物可以但不限于是水溶液、盐溶液、颗粒、气溶胶、片剂、粉剂、糖衣片剂、胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、悬胶液、乳育、滴剂和其它合适的物质。药物新.合物的应W方式可以是经肠外、经口、经直肠、经阴道、经股膜内、经力,)部(粉剂、软膏剂、凝胶剂、滴剂、透辟贴剂)、含服成口腔和鼻腔喷雾^。在各种情况卜'，药物组合物必须是无齒和稳定的。本发明的注射剂药物组合物包括药学上可接受的水溶液、言水溶液、分散剂、悬浊剂、乳剂成粉剂，注射前W无齒的注射W水或分散剂溶解。本发明中的寡核苷酸可以用水相载体溶解，比如叫pH3.0到pH8.0的3渗的缓冲液，pH值范,也可为pH3.5-pH7.4，pH3.5-pH6.0，pH3.5-pH5.0。缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液。口服的药物组合物可以和可食HJ的载体按配方制成粉剂、片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂或悬浊剂邻。常规的非染性l古l体载体作为l古l体组分可以是药物学级别的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸镁等。口腔含化给药法的药学药学药物纟R合物可以是传统方式的片剂和锭剂。作为吸入法的药学药学药物组合物是喷雾剂，相关领域技术熟练人员可以选择使W压力赛、喷雾器成干粉。在一些情况卜'，为了延长本发明中寡核苷酸的作MJ效果，药物组合物可被处理于合适的持续籽放系统后应w。发明中的寡核t酸成药物组合物可以被处理成带冇结品的悬胶液成水分较少的非结品物质，米稳定地延缓籽放。注射川的本发明中寡核苷酸的延缓释放可以通过川疏水物质(如，可接受的油性载体)来溶解寡核tr酸来实现。WT注射形式的药物组合物，可以是脂质体包裹的寡核苷酸成乳粒，成可生物降解的卞透性聚合物，如多乳酸化合物、多正酯类成聚酐。"活性物质"活性物质包括1卜类向醇类的抗炎试剂、类向醇、非特异性免疫抑制剂、生物反应调节齐U、化合物、小分于、核酸分子、TLR拮抗剂等。活性物质还指通过如下方式抑制免疫活性的试剂拮抗趋化闪子.诱导产生调节T细胞(CD4+CD25+T细胞)，抑制补体系统，抑制基质金属蛋內酶，抑制NO合成酶，阻断协同刺激分子，抑制免疫细胞的信5转导。非类向醇类的抗炎试剂的包括但不限丁-双氯芬酸、双敏尼酸、乙哚乙酸、氟吡洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮基布洛芬、痛力克、萘普酮、甲氧蔡闪酸、吡罗昔康、舒林酸、tohnetin、塞来考昔、罗非考昔。类问醇包括但不限于肾上腺皮质素、地塞米松、氢化可的松、甲基氢化泼尼松、去氢氢化可的松、泼尼松和氢羟强的松龙。非特异性免疫抑制剂是指W来抑制免疫介导的疾病的试剂，包括但不限于环磷酰胺、环孢霉素A、氨甲喋呤、类W醇、FK506、他克莫—n]、霉酚酸和两罗莫司。生物反应调"'剂包括m'组IL-l受体拮抗剂(Kineretoranakima)、可溶性p75、TNF-a受体gG,融合蛋白(etanerceptorEnbrel)、抗TNF-a单克隆抗体(infliximaborRemicadeX)，还包括千扰素e-la、白细胞介素-10和TGF(3。"递送载体"本发明中的寡核U酸可以用递送载体递送应W。递送载体包括但不限T:类问醇(如胆l古l醇)、络和物、乳化物、免疫刺激复合物(lSCOMs)、脂质(如阳离于脂质和阴离于胎质)、胎质体、活的细齒载体(如沙门氏齒、人肠杆齒、分枝杆幽贺(氏)杆齒、乳酸杆齒)和活的病毒载体(如牛痘齿、腺病毒、单纯疱疹病毒)、病毒小体、病毒样颗粒、微球、核酸疫苗、高分子材料(如羧甲基纤维素、脱乙酰壳多糖)、环状多聚物。递送载体也可以通过特异性受体识别靶细胞的靶向性配体分子。图l:寡核苷酸mt01a、mt01b、mt01抑制人外周血单个核细胞(PBMC)在CpG2216刺激K抗病^物质的产生。相同浓度(16吗/ml)的寡核仃-酸mt01a、mt01b、mt01成对照寡核苷酸ms9(16|ig/ml)丄jCpG2216(2^ig/ml)共同作W于人外周血单个核细胞48小时，收取培养上清，观察此上洁保护VeraE6抵抗10XTC1D50VSV病毒攻击的作HJ。图中横坐标表示培养液及各种寡核tr酸作W下人PBMC培养上清，纵坐标表示Vero细胞经结品紫染色法在578nm处检测的A值。4/对照寡核苷酸msl9相比，寡核苷酸mt01a、mt01b、mt01均可以抑制在CpG2216刺激下人外周血单个核细胞抗病毒物质的产生，使Vero细胞在VSV病毒攻击.卜'死亡数呈增多。图2:寡核tT酸mt01a、mt01b、mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG684刺激下的增殖。相同浓度(8昭/ml)的寡核苷酸mt01a、mt01b、mt01或对照寡核苷酸msl9(8lag/ml)与CpG684(1吗/ml)共同作W于人外周血单个核细胞48小时，掺入卩H]胸腺嘧啶共孵育16小时后收取细胞检测细胞增殖怙况。图中横坐标表示作W丁人PBMC的寡核昔酸种类，纵坐标表示cpm值(每分钟脉冲数)，HJcpm士SD-农示各寡核仃酸作W下细胞的增殖情况。与对照寡核tr酸msl9相比，寡核tr酸加01a、mt01b、mt01可以抑制在CpG684刺激卜人外周血单个核细胞的增殖。图3:不同浓度的寡核昔酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG2216刺激下抗病毒物质的产生。不同浓度(16、8、4、2、1、0吗/ml)的寡核苷酸mt01丄j'CpG2216(2^ig/ml)共同作W丁'人外周血单个核细胞48小时，收取培养上清，观察此上清保护VeroE6抵抗10XTCID50VSV病毒攻击的作W。图中横坐标表示培养液及不同浓度寡核苷酸mt01作用下人PBMC培养上清，纵坐标表示Vera细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。寡核昔酸mt01可以抑制在CpG2216刺激下人外周血单个核细胞抗病3S物质的产生，且抑制作用随mt01浓度的增加而增强。图4:mt01抑制人外周血单个核细胞在灭活病2JHSV-1刺激下抗病毒物质的产生。寡核贷酸mt01(8吗/ml)成对照寡核昔酸ms19(8吗/ml)与灭活病毒HSV-1共同作用丁人外周血单个核细胞48小时，收取培养上清，观察此上清保护VeroE6抵抗10XTCID50VSV病毒攻m的作14J。图中横坐标表示培养液及两种寡核昔酸作川卜'人PBMC培养上清，纵坐标表示Vero细胞经结品紫染色法在578nm处检测的A值。与对照寡核tr酸ms19相比，寡核苷酸mt01可以抑制灭活病毒HSV-1刺激卜人外周血单个核细胞抗病^活性。图5:mt0抑制人外周血单个核细胞在灭活病^PR8-Flu刺激K抗病毒物质的产生。寡核苷酸mt01(8吗/ml)成对照寡核tr酸msl9(8吗/ml)丄j灭活病^PR8-Flu共同作用T人外周血单个核细胞48小时，收取培养上清，观察此上洁保护VeroE6抵抗10XTCID50VSV病毒攻击的作用。图中横坐标表示培养液及两种寡核^酸作川K人PBMC培养上清，纵坐标表示Vero细胞经结品紫染色法在578nm处检测的A值。-Lj对照寡核昔酸msl9相比，寡核U酸mt01可以抑制灭活病毒PR8-Flu刺激下人外周血单个核细胞抗病毒活性。图6:mt01抑制人外周血单个核细胞在灭活病毒FM1刺激下抗病毒物质的产生。寡核U酸mt01(8)ag/ml)成对照寡核tJ酸msl9(8pg/ml)与灭活病毒FM1共同作WT人外周血单个核细胞48小时，收取培养上淸，观察此上洁保护VeroE6抵抗10XTCID50VSV病毒攻击的作川。图中横坐标表示培养液及两种寡核昔酸作用下人PBMC培养上清，纵坐标表示Vero细胞经结品紫染色法在578nm处检测的A值。与对照寡核昔酸msl9相比，寡核苷酸mt01可以抑制灭活病^FM1刺激卜人外周血单个核细胞抗病毒活性。图7:寡核tr酸mt01抑制小鼠脾细胞在CpG2216刺激K抗病^物质的产生。寡核苷酸mt01(8吗/ml)成对照寡核U酸msl9(8吗/ml)与CpG684(1pg/ml)共同作川丁'小鼠脾细胞48小时，收取培养上清，观察此上清保护L929细胞抵抗10XTCID50VSV病毒攻击的作HJ。图中横坐标表示培养液及CpG2216作W下人PBMC培养上清，纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。与对照寡核tJ酸msi9相比，寡核苷酸mt01可以抑制在CpG2216刺激卜小鼠脾细胞抗病毒物质的产生。图8:不同浓度的寡核昔酸mtOl抑制人外周血单个核细胞在CpG2006刺激下的增殖。不同浓度(64、32、16、8、4、2、1、0吗/ml)的寡核苷酸mt01或对照寡核苷酸与CpG2006(1吗/ml)共同作用T人外周血单个核细胞48小时，掺入^H]胸腺嘧啶共附育16小时后收取细胞检测细胞增殖情况。图中横坐标表示作WT人PBMC的不同浓度的寡核苷酸mt01，纵坐标表示cpm值(每分钟脉冲数)，Wcpm士SD表示寡核苷酸mtOl作W下细胞的增殖情况。与对照寡核苷酸msl9相比，寡核1J酸mt01可以抑制在CpG2006刺激K人外周血单个核细胞的增殖，且抑制作W随mt01浓度的增加而增强。图9:不同浓度的寡核昔酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpGC274刺激下的增殖。不同浓度(64、32、16、8、4、2、1、0ng/ml)的寡核苷酸mt01成对照寡核苷酸ms19与CpGC274(1吗/ml)共同作用于人外周血单个核细胞48小时，掺入pH]胸腺嘧啶共孵育16小时后收取细胞检测细胞增殖情况。图中横坐标表示作WT人PBMC的不同浓度的寡核苷酸mt01，纵坐标表示cpm值(每分钟脉冲数)，川cpm士SD表示寡核Tf酸mt01作用下细胞的增殖情况。与对照寡核苷酸msl9相比，寡核苷酸mt01可以抑制在CpGC274刺激K人外周血单个核细胞的增殖，且抑制作用随mt01浓度的增加而增强。阁10:不同浓度的寡核1J酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG684刺激下的增殖。不同浓度(64、32、16、8、4、2、1、0吗/ml)的寡核苷酸mt01成对照寡核苷酸msl9与CpG684(1吗/ml)共同作用T人外周血单个核细胞48小时，掺入^H]胸腺嘧啶共孵育16小时后收取细胞检测细胞增殖情况。图中横坐标表示作片J丁-人PBMC的不同浓度的寡核苷酸mtO，纵坐标表示cpm值(每分钟脉冲数)，川cpm士SD表示寡核苷酸mt01作)4J下细胞的增殖情况。与对照寡核苷酸msl9相比，寡核tT酸mtOI可以抑制在CpG684刺激卜'人外周血单个核细胞的增殖，且抑制作W随mt01浓度的增加而增强。图11:寡核苷酸mt01抑制小鼠脾细胞在CpG2006、CpGC274或CpG684刺激下的增殖。寡核苷酸mt0(8叫/ml)成对照寡核tr酸(8"g/ml)与CpG2006(1Mg/ml)、CpGC274(1吗/ml)成CpG684(1pg/ml)共同作用T小鼠脾细胞48小时，掺入[^]胸腺嘧啶共孵育16小时后收取细胞检测细胞增殖情况。图中横坐标表示作W丁人PBMC的不同CpGODN，纵坐标表示cpm值(每分钟脉冲数)，川cpm士SD表示寡核苷酸mt01作W下细胞的增殖情况。勾对照寡核昔酸ms9相比，寡核苷酸mt01可以抑制在CpG2006、CpGC274成CpG684刺激卜小鼠脾细胞的增殖。图12:寡核苷酸mt01ij其突变序列mtoic、mt01d、mt01f抑制人外周血单个核细胞在CpG2216刺激下抗病毒物质的产生。相同浓度(8吗/ml)mt01、mt01c、mt01d、mt01f或对照寡核苷酸(8jag/ml)与CpG2216(2iig/ml)共同作用T人外周血单个核细胞48小时，收取培养上清，观察此上清保护VeroE6抵抗10XTCID50VSV病毒攻击的作用。图中横坐标表示培养液及各种寡核tr酸作用下人PBMC培养上清，纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。寡核tJ酸mt01及其突变序列mt01c、mt01d、mt01f均能抑制人外周血单个核细胞在CpG2216刺激卜抗病^物质的产生。图13:寡核苷酸mtOl、mt01a、mt01b、mt01c、mt01d、mt01e、mt01f抑制人外周血单个核细胞在灭活病$FM1刺激下抗病溢物质的产生。相同浓度(8|ig/ml)mt01、mt01c、mt01d、mt01f成对照ODN勾灭活病毒FM1共同作W于人外周血单个核细胞48小时，收取培养上洁，观察此上清保护VeroE6抵抗10XTCID50VSV病毒攻7t的作W。图中横坐标表示培养液及各种寡核苷酸作W卜'人PBMC培养上清，纵坐标表示Vero细胞经结晶紫染色法在578nm处检测的A值。寡核tT-酸mtOI及其突变序列mt01c、mt01d、mt01f均能抑制人外周血单个核细胞在灭活病^FM1刺激卜抗病毒物质的产生。具体的实施方式表实验中所用寡核立酸序列(由人连宝生物.i:程冇限公司合成,硫代修饰)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例1含不同基序(ACCCCCTCT)个数的寡核tr酸对CpGODN刺激的人外周血单个核细胞产生抗病^活性的抑制作用的比较材料96孔细胞培养板(Costar公司)，Ficoll试剂(TBD公司)、热灭活的胎牛血清(Hyclone)、IMDM培养液(美国Gibco)、靑霉素(华北制药股份有限公司)、链霉素(大连美罗大药厂)、台酚兰、结晶紫、结晶紫脱色液、人外周血浓縮A细胞(吉林省血液中心)、VeroE6细胞(非洲绿猴肾细胞系，美国TypeCultureCollection),寡核昔酸mt01、mt01a、mt01b、msl9、CpG2216序列见表1。Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓縮白细胞中分离人外周血单个核细胞。台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。VeroE6细胞HJ含10%(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和聽U/ml链霉素)的IMDM培养液在37。C、5%032的细胞孵箱内培养。采川VeroE6细胞病变法检测经处理的人外周血单个核细胞培养上清的抗病3S活性。方法介绍如下人外周血单个核细胞以5><105个/孔的密度接种到U:刚底96孔板，在存在相同浓度(16呢/ml)的3种寡核tr酸mt01、mt01a、mt01b成对照寡核昔酸msl9的情况>'，将人外周血单个核细胞与CpG2216(2吗/ml)共同培养48小时，收集上清。将VeroE6细胞(2"04/孔)接种到平底96孔板，培养12小时后加入100nl上述收集的上洁培养18小时，再加入10xTCID50(TCID50，T.数组织感染剂呈)的VSV病森继续培养48小时。培养结束后，用0.5%的结晶紫37°C染色15分钟，弃结晶紫染色液，流水轻柔冲洗残存的结品紫染色液，拍干平板，每孔加入结晶紫脱色液10041，摇床上脱色lh，W酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔，结果经统计学检测。如图l所示，与对照组相比，寡核tr酸mt01、mt01a、mt01b可以抑制由CpG2216刺激下的人外周血单个核细胞产生抗病^物质，从而降低了CpG2216刺激的人外周血单个核细胞培养上清对VSV病3J攻^的VeroE6细胞的保护作川(pO.Ol)。结论寡核苷酸mt01、mt01a、mt01b可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细齒基冈组免疫刺激序列CpG2216刺激下的人免疫细胞(人外周血单个核细胞)分泌免疫活性物质(包括抗病^物质如IFN5、)。实施例2含不同基序(ACCCCCTCT)个数的寡核tT酸对CpGODN诱导人外周血单个核细胞(PBMCs)增殖的抑制作用的比较材料3H-胸腺嘧啶(NewEnglandNuclear,Boston,MA)，其余材料同实施例1中材料。用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓縮A细胞中分离人外周血单个核细胞。用台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。川3H-胸腺嘧啶掺入法检测人外周血单个核细胞的增殖情况。方法介绍如下人外周血单个核细胞以5xl0V孔的密度接种到U荆底96孔板，在存在相同浓度(16|ag/ml)的3条寡核苷酸mt01、mt01a、mt01b成对照寡核苷酸msl9的情况卜，将人外周血单个核细胞与CpG684(1^g/ml)共孵育48小时，之后加入3H-胸腺嘧啶(0.5pCi/孔)培养16小时。在玻璃纤维滤器上收获细胞，W闪烁计数器检测结果。每组均设3复孔，结果经统计学检测。。如图1所示，丄J对照组相比，寡核tr酸mt01、mt01a、mt01b可以抑制由CpG2006刺激卜'的人外周血单个核细胞增生，从而降低了CpG2006刺激的人外周血单个核细胞的增生作用(pO.Ol)。结论寡核昔酸时Ol、mt01a、mt01b可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细齒基闪组免疫刺激序列CpG2006刺激K的人免疫细胞(人外周血单个核细胞)增殖。实施例3不同浓度的寡核昔酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG2216剌激卜'抗病毒物质的产生材料同实施例l中材料。WFicoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓縮白细胞中分离单个核细胞。由台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。VeroE6细胞HJ含10%(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和1001U/ml链霉素)的IMDM培养液在37。C、5。/。C02的细胞孵箱内培养。采片jVeroE6细胞病变法检测经处理人外周血单个核细胞培养上清的抗病毒活性。方法介绍如K:在存在不同浓度mt01(16、8、4、2、1、0.5、Opg/ml)的情况下，将人外周血单个核细胞与CpG2216(2吗/ml)共同培养48小时，收集上清。将VeroE6cells(2xl0"L)接种到平底型％孔板，培养12小时后加入IOO)J上述收集的上洁继续培养18小时，再加入10xTCID50(TCID50，'1'.数组织感染剂量)的VSV病3i培养48小时。培养结束后，川0.5%的结晶紫37°(:染色15分钟，弃结晶紫染色液，流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液，拍干平板，每孔加入结晶紫脱色液100ul，摇床上脱色lh，W-J酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔，结果经统计学检测。如图3所示，与对照组相比，mtOl对由CpG2216刺激下的人外周血单个核细胞抗病森作用的抑制能力随浓度的加大而增强(pO.Ol)。寡核苷酸mt01可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细齒基闪组免疫刺激序列CpG2216刺激卜'的人免疫细胞(人外周血单个核细胞)分泌免疫活性物质(包括抗病^物质如1FN等)，抑制能力随寡核苷酸mt01浓度的加大而增强。实施例4mt01抑制人外周血单个核细胞在灭活病^HSV-、灭活病毒PR8-Flu、灭活病^FM1刺激下抗病毒物质的产生。材料HSV病^(单纯疱疹病^，本室0行保存)、PR8-Flu(流感病毒PR8毒株，本室0行保存)、FM1(流感病毐亚甲荆鼠肺适应株，本室Q仃保存)，其余实验材料同实施例l中材料。用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓缩A细胞中分离单个核细胞。由台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。Vero细胞培养扩增HSV-1，鸡胚扩增PR8-Flu，鸡胚扩增FM。分别测定50%组织细胞感染呈(TCID50)。7(TC水浴10min灭活HSV-1，56。C水浴30min灭活PR8-Flu，56。C水浴30min灭活FM1。将处理后的HSV-1、PR8-Flu、FM1分别加入Vero细胞培养体系中，稳定传代3次，未见细胞被病毒感染，即判定病^完全灭活。VeroE6细胞川含10%(v/v)热灭活的胎牛血淸和抗生素(1001U/ml青霉素和1001U/ml链霉素)的1MDM培养液在37。C、5%032的细胞孵箱内培养。采用VeroE6细胞病变法检测经前述二种灭活病^处理的人外周血单个核细胞培养上淸的抗病3i活性。方法介绍如下在存在mt01(8pg/ml)或对照寡核苷酸msl9的情况下，将人外周血单个核细胞与灭活病毒HSV-1、灭活病^PR8-Flu、灭活病毒FM1分别培养48小时，收集上清。将VeroE6cells(2x104/孔)接种到平底荆96孔板，培养12小时，加入00pl上述收集的上清继续培养18小时，再加入lOxTCID50(TC1D50,T-数组织感染剂呈)的VSV病毒培养48小时。培养结束后，用0.5%的结晶紫37°C染色15分钟，弃结晶紫染色液，流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液，拍干平板，每孔加入结晶紫脱色液100ul，摇床上脱色lh，W酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔，结果经统计学检测。如图4、图5、图6所示，lj对照组相比，mt01可以抑制由灭活病毒HSV-l、灭活病毒PR8-Flu、灭活病毒FM1刺激下的人外周血单个核细胞产生抗病毒物质，从而降低了灭活病毒HSV-1、灭活病毒PR8-Flu、灭活病毒FMl刺激的人外周血单个核细胞培养上洁对VSV病毒攻击的VeroE6细胞的保护作川(pO.Ol)。结论寡核t酸mtOl可以抑制由病3J成分(灭活病毒HSV-1、灭活病毒PR8-Flu、灭活病^FM1)刺激下的人免疫细胞(人外周血单个核细胞)分泌免疫活性物质(包括抗病毒物质如1FN等)，同时，由r灭活病^HSV-1是Toll样受体9激动剂，灭活病毒PR8-Flu、灭活病毒FM1是Toll样受体7激动剂，所以寡核苷酸mt01可以抑制由Toll样受体7、9介导的免疫激活。实施例5寡核苷酸mt01抑制小鼠脾细胞在CpG2216刺激下抗病毒物质的产生。材料L929细胞(小鼠成纤维细胞株，美国TypeCultureCollection)、BALB/c鼠(吉林人学基础医学院动物室)，其余材料同实施例1。常规分离小鼠脾细胞。用台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%，99%。L929细胞用含10。/。(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(1001U/ml青霉素和100IU/ml链霉素)的1MDM培养液在37。C、5。/。C02的细胞孵箱内培养。采川L929细胞病变法检测经处理人外周血单个核细胞培养上洁的抗病毒活性。方法介绍如下在存在mt01(16吗/ml)或对照寡核苷酸msl9的情况下，将小鼠脾细胞勾CpG2216(2吗/ml)共同培养48小时，收集上清。将L929细胞(2xl0VL)接种到平底型96孔板，培养12小时，加入上述收集的上洁培养18小时，丙加入10xTCfD50(TC1D50,T:数组织感染剂呈)的VSV病毒继续培养48小时。培养结^后，HJ0.5n/。的结晶紫37。C染色15分钟，弃结晶紫染色液，流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液，拍干平板，每孔加入结品紫脱色液lOOul，摇床上脱色lh，用酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔，结果经统计学检测。如图7所示，mt01可以抑制由CpG2216刺激下的小鼠脾细胞产生抗病毒物质，从而降低了CpG2216刺激的小鼠脾细胞培养上清对VSV病毒攻击的VeroE6细胞的保护作用(pO.Ol)。结论寡核苷酸mt01可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细齒基ra组免疫刺激序列CpG2216刺激K的小鼠免疫细胞(小鼠脾细胞)分泌免疫活性物质(包括抗病毒物质如IFNf)。实施例6不同浓度的寡核tr酸mt01抑制人外周血单个核细胞在CpG2006、CpGC274成CpG684刺激卜'的增殖。材料同实施例2。用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓縮A细胞中分离人外周血单个核细胞。川台酚^染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。川3H-胸腺嘧啶掺入法检测人外周血单个核细胞的增殖情况。方法介绍如下人外周血单个核细胞以5xl0"孔的密度接种到U刑底96孔板，在存在mt01(8吗/ml)或对照寡核普酸msl9的情况卜'，丄jCpG2006(1吗/ml)、CpGC274(1吗/ml)或CpG684(1吗/ml)共孵育48小时，之后加入3H-胸腺嘧啶(0.5pCi/孔)培养16小时。在玻璃纤维滤器上收获细胞，用闪烁计数器检测结果。每组均设3复孔，结果经统计学检测。如图8、图9、图10所示，与对照组相比，寡核tr酸mt01可以抑制由CpG2006、CpGC274成CpG684刺激下的人外周血单个核细胞增殖(/<0.01)。结论寡核苷酸mt01可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细菌基因组免疫刺激序列CpG2006、CpGC274成CpG684刺激卜'的人免疫细胞(人外周血单个核细胞)增殖。实施例7寡核苷酸mt01抑制小鼠脾细胞在CpG2006、CpGC274、CpG684刺激卜'的增殖。材料L929细胞(小鼠成纤维细胞株，美国TypeCultureCollection)、BALB/c鼠(吉林人学基础K学院动物室)，其余材料同实施例2。常规分离小鼠脾细胞。川台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。用3H-胸腺嘧啶掺入法检测人外周血单个核细胞的增殖情况。方法介绍如下小鼠脾细胞以5"05/孔的密度接种到U荆底96孔板，在存在mt01或对照寡核苷酸msl9的情况下，与CpG2006(1pg/ml)、CpGC274(1ng/ml)、CpG684(1叱/ml)成CpG2395(1吗/ml)共孵育48小时，之后加入3H-胸腺嘧啶(0.5nCi/孔)，培养16小时。在玻璃纤维滤器上收获细胞，川闪烁计数器检测结果。每组均设3复孔，结果经统计学检如图1所示，与对照组相比，寡核昔酸mt01可以抑制由CpG2006、CpGC274或CpG684刺激下的小鼠脾细胞增殖(pO.Ol)。结论寡核苷酸mt01可以抑制由Toll样受体9的激动剂即含有细齒基因组免疫刺激序列CpG2006、CpGC274成CpG684刺徵卜的小鼠免疫细胞增殖(小鼠脾细胞)增殖。实施例8寡核苷酸mt01及其突变序列mt01c、mt01d、mt01f抑制人外周血单个核细胞在CpG2216刺激卜抗病毒物质的产生。材料寡核苷酸mt01c、mt01d、mt01f序列见表l，其中，将mt01a序列中的两个碱基突变后串联:iE复3次而获得mt01c;将mt01a序列中的二个碱基突变后串联重复3次而获得mt01d;将mt01a序列中的一个碱基突变后串联重复3次而获得mt01f。其余材料同实施例l。WFicoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓縮白细胞中分离单个核细胞。由台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。VeroE6细胞W含10%(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和薩U/ml链霉素)的1MDM培养液在37。C、5%032的细胞孵箱内培养。采用VeroE6细胞病变法检测经处理人外周血单个核细胞培养上清的抗病3J活性。方法介绍如下在存在相同浓度(8pg/ml)的mt01、mt01c、mt01d、mt01f成对照寡核苷酸ms19的情况下，将人外周血单个核细胞与CpG2216(2pg/ml)共同培养48小时，收集上清。将VeroE6cells(2"04/孔)接种到平底荆96孔板，培养12小时后加入10(^1上述收集的上洁继续培养18小时，再加入10x丁CID50(TC1D50,卞数组织感染剂m)的VSV病毒培养48小时。培养结束后，WJ0.5y。的结晶紫37"C染色15分钟，弃结品紫染色液，流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液，拍干平板，每孔加入结晶紫脱色液100u1，摇床上脱色lh，川酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔，结果经统计学检测。如图12所示，与对照寡核苷酸msi9相比，寡核哲'酸mt01及其突变序列mt01c、mt01d、mt01f均可以抑制由CpG2216刺激卜'的人外周血.单个核细胞产生抗病毒物质，从而降低了CpG2216刺激的人外周血单个核细胞培养上清对VSV病^5攻击的VeraE6细胞的保护作用(^<0.01)。结论将基本序列mt01a进行卜3个碱基序列突变，突变后的寡核苷酸仍然贝.有抑制人外周血单个核细胞在CpG2216刺激K抗病^物质产生的作HJ。实施例9寡核tT酸mtOl与其突变序列mt01c、mt01d、mt01f抑制人外周血单个核细胞在灭活病^FM1刺激卜抗病毐物质的产生。材料同实施例4.用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血浓縮白细胞中分离单个核细胞。由台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95%-99%。鸡胚扩增FM1后测定50%组织细胞感染呈(TCID50)。FM1。将56'C水浴30min灭活后的FM1加入Vero细胞培养体系中，稳定传代3次，未见细胞被病毒感染，即判定病毒完全灭活。VeroE6细胞HJ含10%(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素)的1MDM培养液在37。C、5y。C02的细胞孵箱内培养。采WVeroE6细胞病变法检测经前述二种灭活病3i处理的人外周血单个核细胞培养上清的抗病^活性。方法介绍如下在存在mt01(8吗/ml)成对照寡核昔酸msl9的情况下，将人外周血单个核细胞与灭活病毒FM1培养48小时，收集上清。将VeraE6cells(2"04/孔)接种到平底型96孔板，培养12小时，加入100^1上述收集的上清继续培养18小时，再加入10xTCID50的VSV病毒培养48小时。培养结來jfT，Mj0.5%的结晶紫37°<:染色15分钟，弃结晶紫染色液，流水轻柔冲洗残存的结晶紫染色液，拍干平板，每孔加入结晶紫脱色液100tU，摇床上脱色lh，用酶标仪测定578nm的A值。每组均设3复孔，结果经统计学检测。如图13所示，勾对照寡核tT酸msl9相比，寡核仃酸mt01及其突变序列mt01c、mt01d、mtOlf均W以抑制由灭活病毒FM1刺激下的人外周血单个核细胞产生抗病毒物质，从而降低了灭活病毒FM1刺激的人外周血单个核细胞培养上洁对VSV病毒攻击的VeraE6细胞的保护作川(pO.Ol)。结论将基本序列mt01a进行l-3个碱基序列突变，突变后的寡核苷酸仍然贝.冇抑制人外周血单个核细胞在灭活病毒FM1刺激卜抗病^物质产生的作用。序列表<110>长春华辨生物技术冇限公司<120>—种贝-有免疫抑制功能的寡核tr酸<160>3<210>1<211>9<212>DNA<213>人i:合成的<400>1ACCCCCTCT9<210>2<211>18<212>DNA<213>人:1:合成的<400>2ACCCCCTCTACCCCCTCT]8<210>3<211>27<212>DNA<213>人:1:合成的<棚>3ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT2权利要求1、人工合成的一种寡核苷酸，其寡核苷酸序列的特征是含有一个或多个如下所述的基本序列5’-ACCCCCTCT-3’，包括但不限于SEQNO.1或SEQNO.2或SEQNO.3序列所示的寡核苷酸，以上所述的寡核苷酸可被化学修饰，化学修饰的部位可以是磷酸骨架、核糖、碱基，修饰方式包括但不限于硫代修饰。2、如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述的基本序列5'—ACCCCCTCT—3'所示的寡核苷酸是允许进行突变的寡核苷酸，这里的"允许进行突变的寡核苷酸"是指将基本序列5'—ACCCCCTCT—3'所述的寡核苷酸内部进行的一个或二个或多个单核苷酸的突变而产生的寡核苷酸，突变的方式包括在基本序列5'—ACCCCCTCT—3'所示的寡核苷酸内进行的一个或几个核苷酸的删除、添加、置换。3、以如权利要求1所述的寡核苷酸为核心结构的寡核苷酸，即在权利要求1所述寡核苷酸两侧可以添加一个或二个或多个单核苷酸而产生的寡核苷酸，也指在5'—ACCCCCTCT—3'这一基本序列的两侧添加一个或二个或多个单核苷酸而产生的寡核苷酸。4、以权利要求2所述的允许进行突变的寡核苷酸为核心结构的寡核苷酸，即在权利要求2所述允许进行突变的寡核苷酸两侧可以添加一个或二个或多个单核苷酸而产生的寡核苷酸，也指在5'—ACCCCCTCT—3'这一基本序列的两侧添加一个或二个或多个单核苷酸而产生的寡核苷酸。5、权利要求1-4任一所述的寡核苷酸用于制备用于治疗由细菌或病毒成分引起个体异常反应包括但不限于异常免疫反应导致的疾病的制剂的用途。6、如权利要求5所述的用途中，其中所述的病毒是DNA病毒，包括但不限于疱疹病毒。7、如权利要求5所述的用途中，其中所述的病毒是RNA病毒，包括但不限于流感病毒。8、如权利要求7所述的用途中，其中所述的病毒包括但不限于人流感病毒和禽流感病毒。9、如权利要求5所述的用途中，其中所述的疾病是下列疾病中的一种自身免疫性疾病、微生物过强刺激宿主免疫系统引起的疾病、超敏反应和移植物排斥反应。10、如权利要求9所述的用途中，其中所述的微生物刺激宿主免疫系统引起的疾病是流感病毒或SARS病毒引起的疾病。11、权利要求1-4任一所述的寡核苷酸用于制备用于预防或治疗个体发生的和Toll样受体(TolllikeRec印tor，TLR)异常激活相关的疾病的制剂的用途。12、如权利要求11所述的用途中，其中所述的Toll样受体异常激活相关疾病包括但不限于败血症、扩张性心肌病、糖尿病、系统性红斑狼疮、自身免疫性脑脊髓膜炎、动脉粥样硬化、哮喘、慢性阻碍性肺疾病和器官衰竭。13、如权利要求10所述的用途中，其中所述的Toll样受体异常激活相关疾病尤指Toll样受体9异常激活的相关疾病，包括但不限于脓毒血症、I型糖尿病、活动期的系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、器官衰竭。14、如权利要求5或11所述的用途中，其中所述的个体是人或脊椎动物。15、如权利要求5或11所述的用途中，其中所述的寡核苷酸在用于制备用于治疗由细菌或病毒成分引起个体异常免疫反应导致的疾病的制剂可以单独应用或与药物学可接受的载休一起应用。16、如权利要求5或11所述的用途中，其中所述的寡核苷酸给予个体是经肠内、肠外，外月j和吸入等途径施行。17、如权利要求5或11所述的用途中，其中所述的寡核苷酸是作为在药物组合物中的有效成分进行应用。18、如权利要求5或11所述的方法，其中所述的寡核苷酸在给予个体时可单独应用、或自身联合应用、或与-一种或几种其他的活性物质联合应用。19、如权利要求5或11所述的方法，其中所述的寡核苷酸在给予个体时可单独应用或和递送载体联合应用。20、如权利要求5或11所述的方法，其中所述的寡核苷酸在给予个体时的应用剂量为治疗冇效剂量。全文摘要本发明涉及一种具有免疫抑制功能的寡核苷酸，对因细菌或病毒成份引起的异常增强的免疫反应具有抑制功能，其在预防和治疗与该种异常增强的免疫反应相关疾病中具有作为药物的用途。文档编号C07K7/00GK101643496SQ200810135458公开日2010年2月10日申请日期2008年8月7日优先权日2008年8月7日发明者于永利,光杨,王丽颖申请人:长春华普生物技术有限公司