专利名称：鸡传染性贫血病毒pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡传染性贫血病毒PCR检测方法。
背景技术：
鸡传染性贫血病(Chicken Infectious Anemia，CIA)是鸡传染性贫血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus，CIAV)引起的一种以再生障碍性贫血和全身淋巴器官萎缩，造成免疫抑制为主要特征的病毒性传染病。其病原—鸡贫血病毒1979年由日本学者Yuasa等首次报道以后，相继在西德、瑞典、英国、丹麦、波兰、美国、澳大利亚、荷兰及巴西等国陆续证实了本病的发生。CIAV为环状单股DNA病毒，在国际病毒分类委员会(ICTV)发表的第六次病毒分类报告中将其与猪环状病毒、鹦鹉喙羽病病毒一起设立了一个新科，即圆环病毒科(Circoviridae)。
目前可以用于鸡传染性贫血的诊断方法主要有CIAV的分离和鉴定、电镜观察、免疫荧光或过氧化物酶染色法等技术。分离病毒是鉴别病毒感染的最确凿证据，但是由于CIAV只能在少数淋巴肿瘤细胞系上生长，而且生长速度很缓慢，技术复杂，无法应用于该病的临床诊断和流行病学调查。此外，对感染鸡的组织切片或冰冻切片，可采用免疫荧光或过氧化物酶染色法检测抗原；经过特殊工艺处理后的样品，可以直接用电镜观察病毒。但这两种方法的敏感性低，需要时间长，诊断速度慢，准确率和敏感性低等原因，限制了其应用的普遍性和实用性，而且免疫荧光同样存在着假阳性的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的缺欠，提供一种鸡传染性贫血病毒PCR检测方法，目前发明的聚合酶链式反应(PCR)方法，根据CIAV全基因组序列，设计一对特异的引物，用PCR基因扩增仪，检测CIAV的基因片段。这种方法不仅可以用于检测组织中的CIAV，而且还可用于感染的MSB1细胞，或疫苗中CIAV污染的监测。达到检测快速性，特异性强和敏感性高，便于操作等目的。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是(1)CIAV DNA的提取即取100mg的组织，加入1000μL TEN缓冲液，充分研磨后，反复冻融3次，7000rpm离心10分钟，取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL，20mg/mL蛋白酶K 2.5μL，充分混合均匀后置37℃消化过夜或50℃水浴3小时。之后加入等量酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提二次，取上清液加2体积预冷的无水乙醇于-20℃30分钟，12000rpm离心15分钟。沉淀颗粒置真空干燥箱干燥后，用适量超纯水溶解，即为实验用DNA模板。提取的DNA模板于-70℃保存备用。
(2)设计并合成引物上游引物CIAVP1 5’-GAG GAG ACA GCG GTATCG TAG A-3’，下游引物CIAVP2 5’-TCT CGC CTT GTG GTG GTT G-3’，使用前用超纯水溶解，浓度为100pmol，置于-20℃保存备用。
(3)PCR反应体系采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入10×PCR缓冲液2.5μL，4dNTP(2.5mM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVP1、CIAVP2)各0.3μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水加至总体积后混合均匀。
(4)PCR反应条件将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环。反应条件是94℃，3分钟，进行预变性；然后94℃，1分钟，62℃，1分钟，72℃，3分钟共循环30～35次；最后72℃延伸10分钟。
(5)PCR扩增产物的检测PCR反应结束后，取10μL产物在0.7％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小。
(6)结果与判定在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，阳性样品可出现925bp片段。
本发明的有益效果是通过临床检测结果表明，本发明所建立的CIAVPCR方法可以特异性地扩增CIAV基因片段，而且对CIAV进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测CIAV提供了便利条件。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明本发明按以下步骤进行，(1)CIAV DNA的提取即取100mg的组织，加入1000μL TEN缓冲液，充分研磨后，反复冻融3次，7000rpm离心10分钟，取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL，20mg/mL蛋白酶K 2.5μL，充分混合均匀后置37℃消化过夜。之后加入等量酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提二次，取上清液加2体积预冷的无水乙醇于-20℃30分钟，12000rpm离心15分钟。沉淀颗粒置真空干燥箱干燥后，用适量超纯水溶解，即为实验用DNA模板。提取的DNA模板于-70℃保存备用。
(2)设计并合成引物上游引物CIAVP1 5’-GAG GAG ACA GCG GTATCG TAG A-3’，下游引物CIAVP2 5’-TCT CGC CTT GTG GTG GTT G-3’，使用前用超纯水溶解，浓度为100pmol，置于-20℃保存备用。
(3)PCR反应体系采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入10×PCR缓冲液2.5μL，4dNTP(2.5mM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVPl、CIAVP2)各0.3μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水加至总体积后混合均匀。
(4)PCR反应条件将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环，反应条件是94℃，3分钟，进行预变性；然后94℃，1分钟，62℃，1分钟，72℃，3分钟共循环35次；最后72℃延伸10分钟。
(5)PCR扩增产物的检测PCR反应结束后，取10μL产物在0.7％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小。
(6)结果与判定在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，阳性样品可出现925bp片段。
实例1某鸡场的鸡出现精神沉郁、衰弱、消瘦、体重减轻、死亡率高等临床症状。经病理剖检可见喙、肉髯和可视黏膜苍白；血液稀薄，血凝时间延长；骨髓呈黄白色。我们采取了5份病鸡的肝脏、脾脏和骨髓等组织样品，每只鸡的肝脏、脾脏和骨髓混合为一份样品，(1)CIAV DNA提取每份样品取100mg加入1000μL TEN缓冲液，充分研磨后反复冻融3次；然后7000rpm离心10min；取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL和蛋白酶K(20mg/mL)2.5μL，充分混合均匀后置37℃温箱消化过夜。次日加入500μL饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，抽提二次，取上清液350μL加700μL无水乙醇于-20℃30分钟，然后12000rpm离心15min。倒掉上清液，沉淀颗粒置真空干燥箱干燥1h后，用20μL超纯水溶解，即为实验用DNA模板。(2)在0.2mL PCR反应管内分别加入10×PCR缓冲液2.5μL，4dNTP(2.5mM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVP1、CIAVP2)各0.3μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水加至总体积。(3)5000rpm离心1min使上述试剂混合均匀，然后置于PCR扩增仪中进行循环，反应条件是94℃，5分钟，进行预变性；然后94℃，1分钟，62℃，1分钟，72℃，3分钟共循环30次；最后72℃延伸10分钟。(4)PCR反应结束后，取10μL产物在0.7％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，并与标准分子量相对照，结果显示，5份样品均出现大小均为925bp的扩增片段。证实该鸡体内感染有鸡传染性贫血病毒。
实例2某鸡场的鸡发生死亡，经剖检发现，股骨的骨髓被脂肪组织取代，呈脂肪色、淡黄色。胸腺萎缩甚至完全退化，颜色呈深红褐色，法氏囊的外壁呈半透明状态，肝脏肿胀、褪色，腺胃黏膜出血，疑似为鸡传染性贫血。我们采取了6只病死鸡的肝脏、脾脏和骨髓组织样品，每只各取肝脏、脾脏和骨髓组织混合样品共100mg放入1.5mL离心管，各加入1000μL TEN缓冲液，充分研磨后，反复冻融3次，7000rpm离心10分钟，取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL，20mg/mL蛋白酶K 2.5μL，充分混合均匀后置37℃消化过夜。之后加入等量酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次，取上清液加2倍体积预冷的无水乙醇于-20℃30分钟，12000rpm离心15分钟。沉淀颗粒置真空干燥箱干燥后，用适量超纯水溶解，即为实验用DNA模板。在每个0.2mLPCR反应管内分别加入10×PCR缓冲液2.5μL，4dNTP(2.5rmM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVP1、CIAVP2)各0.3μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，混合均匀。将PCR反应管置于PCR扩增仪中，反应条件为94℃，3分钟，进行预变性；然后94℃，1分钟，62℃，1分钟，72℃，3分钟共循环35次；最后72℃延伸10分钟。PCR反应结束后，取10μL产物在0.7％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，并观察与标准分子量的对照。结果表明6个样品均出现大小约925bp的片段，说明6只病死鸡均感染有鸡传染性贫血病毒。
权利要求
1.一种鸡传染性贫血病毒PCR检测方法，其特征是，(1)CIAV DNA的提取即取100mg的组织，加入1000μL TEN缓冲液，充分研磨后，反复冻融3次，7000rpm离心10分钟，取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL，20mg/mL蛋白酶K 2.5μL，充分混合均匀后置37℃消化过夜或50℃水浴3小时。之后加入等量酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提二次，取上清液加2体积预冷的无水乙醇于-20℃30分钟，12000rpm离心15分钟。沉淀颗粒置真空干燥箱干燥后，用适量超纯水溶解，即为实验用DNA模板。提取的DNA模板于-70℃保存备用。(2)设计并合成引物上游引物CIAVP1 5’-GAG GAG ACA GCG GTATCG TAG A-3’，下游引物CIAVP2 5’-TCT CGC CTT GTG GTG GTT G-3’，使用前用超纯水溶解，浓度为100pmol，置于-20℃保存备用。(3)PCR反应体系采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加人10×PCR缓冲液2.5μL，4dNTP(各2.5mM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVP1、CIAVP2)各0.3μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，混合均匀。(4)PCR反应条件将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环，反应条件是94℃，3分钟，进行预变性；然后94℃，1分钟，62℃，1分钟，72℃，3分钟共循环30～35次；最后72℃延伸10分钟。(5)PCR扩增产物的检测PCR反应结束后，取10μL产物在0.7％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小。(6)结果与判定在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，阳性样品可出现925bp片段。
全文摘要
本发明公开了一种鸡传染性贫血病毒PCR检测方法，采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入缓冲液，上、下游引物，DNA聚合酶以及提取的DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，将试剂混合均匀后，置于PCR扩增仪中，进行变性、退火、延伸共循环30～35次；PCR反应结束后，取10μL产物在琼脂糖凝胶上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，并与标准分子量相对照，阳性样品可出现925bp片段。本发明对CIAV进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测CIAV提供了便利条件。
文档编号C12Q1/04GK1680595SQ200510013128
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月24日 优先权日2005年1月24日
发明者梁智选, 王志成, 刘建文, 李颖 申请人:天津市禽病诊断培训中心