专利名称：水貂巴氏杆菌病蜂胶灭活苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以蜂胶为佐剂的水貂巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备方法，属于兽医生物制品技术领域。
背景技术：
巴氏杆菌病主要是由多杀性巴氏杆菌及溶血巴氏杆菌引起的畜、禽、野生动物和 毛皮动物的细菌性出血性、败血性传染病。本病分布广泛，世界各地均有发生。近几年水貂巴氏杆菌亦有流行，它发病率高、死亡率高，对毛皮动物饲养业危害很大，经常造成严重的经济损失。目前我国对水貂巴氏杆菌病主要采用是抗生素药物治疗，但药物治疗存在一定的缺陷，一旦停药容易复发，而且容易产生抗药性。防治该病发生的有效措施是研制相应的疫苗。为增强疫苗的免疫源性，常在灭活菌疫苗的研制中加入免疫佐剂。免疫佐剂是一种免疫调节剂，可以先于抗原或与抗原混合或同时注入动物体内，能特异性地增强抗原的免疫原性，提高免疫效果。免疫佐剂可增强抗原所激发的抗体应答，可提高免疫原性，以及增强吞噬细胞的非特异性杀伤功能和特异性细胞免疫的刺激作用等。因此，佐剂是疫苗特别是灭活疫苗所必不可少的成分。蜂胶作为一种具有生物活性的免疫佐剂所显示出的优点已逐渐被认识。蜂胶具有广谱生物学活性，是一种良好的免疫增强剂和刺激剂，它既能引起特异性免疫应答，又能启动非特异性防御机制，有增强免疫抗体生成和提高白细胞吞噬能力的明显效果，使用该佐剂后可以有效保护皮毛质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以蜂胶为佐剂的水貂源巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，使其免疫水貂后副作用小，对毛皮质量影响小，免疫产生时间早，免疫力强，免疫期长。具体实施步骤
I.水貂源巴氏杆菌灭活原液的制备。I)取水貂源的多杀性巴氏杆菌接种血琼脂斜面，37°C培养24小时，经检验纯正，作为菌种使用；
2)以适量的菌种培养物接种血琼脂斜面，经37°C培养18-24小时，收取培养物进行检
验;
3)取培养菌液加入甲醛溶液，使其含甲醛的最终浓度为O.4%，37°C摇床灭活24小时。2.蜂胶溶液的制备选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的乙醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。3.成品疫苗制备按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8_15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15-20分钟，使其充分混合乳化。
4.作为本发明水貂巴氏杆菌病蜂胶灭活苗的制备方法的优选实施方式，步骤I的
3)中，在灭活后还可以对巴氏杆菌培养液进行灭活检验和毒素检验。进行灭活检验和毒素检验的作用在于对制造过程疫苗质量的控制。本发明的巴氏杆菌为购自中国兽医药品监察所菌种室的一株多杀性巴氏杆菌C52-17作为生产疫苗的菌株，血清型A:l， 2008.4.冻干，有效期10年。
具体实施方式
实施例I :
疫苗制备本品是选用本发明人于中国兽医药品监察所菌种室购买的一株多杀性巴氏杆菌C52-17作为生产疫苗的菌株，复苏后接种血琼脂斜面培养基18小时，镜检无杂菌后作为种子液，以适量的菌种培养物接种血琼脂斜面经37°C培养18-24小时，取培养菌液加入甲醛溶液，使其含甲醛的最终浓度为O. 4%，37°C摇床灭活24小时。疫苗灭活检验将甲醛灭活后的菌液取100微升接于3ml液体培养基中，一次培养取三次样，每个样品接种于三个试管中观察五天进行灭活安全检验，五天后接种的液体培养基仍澄清无混浊则安全检验合格。成品疫苗制备按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8_15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15-20分钟，使其充分混合乳化。实施例2
将实施例I制备好的三批疫苗单剂量、单剂量重复和超剂量注射健康水貂，后肢内侧肌肉接种。通过14d观察，接种水貂体温和食欲正常，接种局部无肿胀和炎症，未出现局部和全身反应每批疫苗选择3只，剖杀后切开注射部位皮肤观察注射局部病理变化，水貂接种部位皮下无异常变化，后肢内侧肌肉接种部位肌肉组织正常，仅见到注射部位呈深褐色，有玉米粒大小，与周围红褐色肌肉相区别，注射部位未见炎症反应。60-70日龄貂继续观察至接种后30d，貂发育良好。说明疫苗对不同年龄的水貂具有较好的安全性。实施例3
三批水貂巴氏杆菌病蜂胶灭活疫苗分别免疫16-18g小白鼠20只，实验组和对照组各10只，O. 2mL/只，免疫后21d连同对照组小白鼠20只分别用巴氏杆菌攻毒，观察7日，三批疫苗免疫组小白鼠均80%获得保护，对照组小白鼠均100%发病。三批水貂巴氏杆菌病蜂胶灭活疫苗分别免疫2-3月龄的健康水貂，每批疫苗肌肉接种水貂10只，ImL/只，免疫后21日连同对照组水貂10只用巴氏杆菌通过气管内滴入攻毒(每个组别5只)，观察7日，三批疫苗免疫组水貂均80%获得保护，对照组水貂均100%发病。实施例4
采用三批蜂胶灭活疫苗进行免疫保护期测定。分为实验组和对照组，实验组分六组，每组30只水貂，用本发明所述三批蜂胶灭活疫苗免疫，每批疫苗免疫10只水貂，每后肢内侧肌肉注射ImL ;对照组分为六组，每组10只水貂，后肢内存肌肉注射生理盐水对lmL，免疫后的第1-6个月，每月用巴氏杆菌分离毒株攻毒，测定疫苗对毒株的保护力。实验结果表明，本发明所述蜂胶灭活疫苗对水貂巴氏杆菌的保护期为6个月，免疫保护率在80%以上。
权利要求
1.一种水貂巴氏杆菌病蜂胶灭活疫苗，其特征在于该疫苗是将水貂源巴氏杆菌经血琼脂培养，用其菌液经灭活与蜂胶混合制成灭活苗。
2.权利要求I所述的灭活疫苗的制备方法，主要包括如下步骤 1)水貂源巴氏杆菌灭活原液的制备； 2)蜂胶溶液的制备； 3)成品疫苗制备按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8-15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15-20分钟，使其充分混合乳化。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的水貂源巴氏杆菌灭活原液的制备步骤包括取水貂源的多杀性巴氏杆菌接种血琼脂斜面，37°C培养24小时，经检验纯 正，作为菌种使用；以适量的菌种培养物接种血琼脂斜面，培养物取样检验合格，培养物加入甲醛溶液，使其含甲醛的最终浓度为O. 4%，37°C灭活24小时。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其特征在于蜂胶液制备由以下步骤完成选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的乙醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。
5.根据权利要求2-3任一项所述的制备方法，其特征在于，成品疫苗为黄褐色混悬液，密封保存于4-8 °C中。
6.权利要求I所述的水貂巴氏杆菌病蜂胶灭活疫苗的用途，主要是用于水貂巴氏杆菌的免疫。
全文摘要
本发明提供了一种水貂巴氏杆菌病蜂胶灭活苗及其制备方法。本发明的实质内容是取水貂源巴氏杆菌接种血琼脂斜面，37℃，培养24小时，检验纯正，作为种子菌液接种血琼脂培养基，经灭活后制成水相与蜂胶佐剂充分混合制成水貂源巴氏杆菌病蜂胶灭活疫苗。本疫苗能够有效预防水貂源巴氏杆病的发生，并能显著减少注射疫苗后的不良反应和对毛皮质量的影响，为毛皮动物疾病的控制创造条件。
文档编号A61K39/39GK102614511SQ20121009584
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者单虎, 张传美, 张启迪, 王述柏, 秦志华, 蔡秀磊 申请人:青岛农业大学