选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素的制作方法
【专利摘要】本发明涉及选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素，采用分子量为2000-4000dalton、终浓度为2％×10-6(w/v)至1％×10-7(w/v)的小分子肝素(/肝素钠)配合优化设计的引物进行密闭PCR，在不影响靶特异性扩增效率的情况下，能够选择性地竞争抑制引物二聚体PD非特异性扩增；从而实现彻底杜绝引物二聚体造成的PCR假阳性结果使SYBR GreenⅠ实时荧光PCR等核酸扩增技术对临床检测分析的不利影响。
【专利说明】
选择性抑制引物二聚体扩増的小分子肝素
技术领域：
[0001] 本发明属于分子生物学及分子检验领域的核酸扩增技术领域，具体涉及选择性抑 制引物二聚体扩增的小分子肝素，通过小分子肝素竞争结合短DNA来选择性干扰引物二聚 体扩增的技术领域。
【背景技术】：
[0002] 二十世纪末诞生的多聚酶链反应PCR(美国专利US 4, 683, 202)技术模拟了天然 基因几何级数复制过程，以其独特的几何指数扩增模式能使数十个靶分子甚至单个分子放 大几百万倍直至上亿倍，加之PCR简单的操作使其成为生物世纪使用最广的基础核心技 术。并由此衍生了一系列的PCR新理论、新方法及改良操作等，尤其是从只能定性的终末检 测PCR发展为动态扩增与荧光检测同步的实时荧光定量PCR(Biot eChniqueS1997Jan22-l : 130)，实现了精确定量的飞跃，以及依赖核酸序列的扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)或转录依赖的扩增系统（Transcript-based amplification system，TAS)，环介导的等温扩增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP)等恒 温扩增技术进一步简化了操作。目前涉及PCR的相关研究及发明创造已数不胜数，多聚酶 链反应PCR已成为引用最多的科研方法和最热门的专利申请领域。截至目前全世界PCR专 利或相关的设计更是多达四至五位数以上。
[0003] 然而，PCR巨大的扩增倍数也使其非特异性指数放大而成为长期困扰并未解决的 根本性障碍。一对按常规引物设计原则优选的引物对在没加模板的本底PCR系统也会从30 个热循环开始出现引物二聚体ro非特异性扩增，这也是普通PCR -般只反应30个热循环 的主要原因。但是实时荧光定量PCR需要反应40个热循环才能使低浓度靶分子有效扩增 检测，且一对引物添加一些无关的基因组DNA也不明显增加非特异性扩增。目前PCR非特 异性研究很少，多主要集中在PCR热启动（hot start)反应方面（综述《畜牧兽医科技信 息》2009年03期12-13页）；但在PCR热变性后才加入完全成份的人工手动热启动也仅仅 能推后1-2个热循环开始非特异性扩增，低温时的优化引物结合延伸不是ro主要因素，PCR 热循环反应时的引物二聚体ro扩增仍是PCR非特异性的根本原因。
[0004] 综合一些PCR研究中的现象和各种PCR增强剂/或增效剂的研究，一般措施对 引物二聚体ro非特异性与靶模板特异性扩增作用均是平行的，缺乏特异的抑制ro扩 增选择性。采用上下游引物完全同序（或单一引物双倍量）PCR方法（Nucleic Acids Res. 1997vol25-16，p3235)虽绝对没有Η)扩增但试验也显示显著抑制靶分子扩增效率。中 国专利（CN102146432A)公开揭示了部分同序引物对的本底扩增位于30-50(或60)个 热循环之间，一对上下游6-8个base碱基同序的引物对如同序片段离3'末端3-5base位 置，则能最有效推后7-10个热循环才出现ro非特异性扩增，同时一点都不影响特异性靶分 子扩增效率。但仍需要遵守极严格的PCR操作规范以防ro产物气雾胶再污染，于PCR反应 45个热循环内尚不能完全消除PCR非特异性。
[0005] 综上，核酸扩增PCR技术非特异性高主要是由引物二聚体（Primer Dimer)反复扩 增、累积造成的，而目前采用的种种抑制引物二聚体非特异性扩增的试剂、措施对引物-引 物和靶-引物之间的作用均缺乏特异针对性，没有根本解决ro非特异性扩增的限制。因 此，亟需研究改进，以彻底杜绝引物二聚体造成的PCR假阳性结果使SYBR Green I实时荧 光PCR等核酸扩增技术对临床检测分析的不利影响。
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的是提供"选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素"，从关键的引物 作用差异化来解决特异问题。本发明根据引物与特异模板是引物全长碱基正确配对互补， 而与非特异模板为仅引物3'末端互补再借助其它区碱基错配结合力，错配结合力小于碱 基正确配对力量的推论。采用缩短的分子量为2000-4000dalton的小分子肝素，在不影响 靶特异性扩增效率的前提下，选择性地竞争抑制引物二聚体ro非特异性扩增的技术途径。
[0007] 本发明"选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素"在充分优选的一对引物基础 上，借鉴抗凝血剂-肝素，近年来发展出了不引起出血的低分子量肝素作为临床抗血栓治 疗剂。肝素也因为其高密度磺酸/硫酸负离子能强力结合DNA链而成为最毒的PCR抑制 剂，
【申请人】通过逐步降解、缩短肝素长链而逐渐降低其PCR毒性，终于实验出在其靶扩增毒 性刚消除的一狭窄范围内仍能保留抑制引物二聚体聚合、扩增的药性作用，在不影响靶特 异性扩增效率前提下，选择性地抑制ro非特异性扩增，与中间部分同序引物对联用则可完 全消除PCR本底非特异性。既不干扰靶分子特异性扩增，其本底又在PCR45个循环内基本 为一直线，没有非特异性扩增值干扰。再辅助以矿物油封闭下的一端引物分层缓释热启动 及尿嘧啶糖苷酶（UNG)修饰处理使核酸应用检测在PCR反应内没有引物二聚体累积，PCR多 重封闭没有气雾胶产生或仅没有扩增的气雾胶，假如微量的产物泄露也可进一步被UNG有 效酶解，多重保证不产生假阳性非特异性反应，使核酸扩增检测绝对可靠。
[0008] 本发明的技术方案是"选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素"，采用小分子 肝素选择性抑制引物二聚体扩增的PCR方法，逐渐降解缩短的小分子肝素（heparin)会同 比例减低其结合核酸DNA的能力，在低于引物-靶分子完全配对的结合力而高于引物-引 物间碱基错配聚合力的对应肝素作用浓度范围内选择性地抑制引物二聚体ro非特异性扩 增；其中，小分子量肝素/肝素钠_(C 12H16013NS2Na3) 4「即分子量（MW) 2000-4000dalton，纯 度达99%以上肝素，选择性抑制PCR引物二聚体扩增的浓度范围为：终浓度0. 2% X10 5 至1% X 10 7(w/v)小分子肝素能够不影响靶特异性扩增而有效抑制本底引物二聚体非特 异性扩增；选择性抑制染料法实时荧光PCR方法的非特异反应假阳性。
[0009] 在本发明所述"选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素"中，纯度达99%以上 小分子肝素/肝素钠 （MW :2000-4000d)，经其浓度梯度PCR实验对比有模板实时荧光PCR- 本底实时荧光PCR抑制效果，优化终浓度2% X105X1/16至2% X 10 5X 1/32(w/v)小分 子肝素完全不影响靶特异性扩增效率而完全抑制本底引物二聚体直至49个热循环都不扩 增。
[0010] 在本发明所述"选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素"中，对本底越低的优化 引物对，小分子肝素抑制引物二聚体作用越强；引物对序列对肝素作用效果和使用浓度均 有一定的影响，优化较好的引物对使小分子肝素作用明显更大一些；反过来说小分子肝素 与本底低的较优化引物对具有进一步协同抑制非特异性效果；不同序列优化引物对其小分 子肝素最佳作用浓度范围亦有一定变异，具体引物要由对比抑制PCR试验决定。
[0011] 在本发明所述"选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素"中，密闭PCR反应，管 底预置重比重引物使分层的PCR反应液因缺少一引物成份而热启动可控扩增，采用矿物油 封闭下的一端引物分层热缓释及UNG处理也使矿物油层面上或管壁上溅留的反应液因缺 少完全成份仅产生没有扩增的气雾胶泄露；加小分子肝素的优化引物PCR使核酸检测反应 内没有引物二聚体累积，泄露的气雾胶又是没有扩增的气雾胶，假如极微量的产物泄露就 可进一步被UNG有效酶解。
[0012] 在本发明所述"选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素"中，所述重比重的热缓 释引物是10% (w/v)蔗糖稀释引物，高比重粘性引物预先加入PCR管底，再依次加 PCR各成 份、最后加矿物油于PCR管壁，室温下不要混匀振荡（Vortex)，以免破坏缓释分层，短瞬离 心使所有反应液均沉降于管底；经PCR热变性数分钟后，管底的重引物被热混匀/热释放进 入反应液而启动扩增，而矿物油封闭层面上残留液因缺少完全的PCR成份仅产生无效扩增 的微量气雾胶，假如可能的扩增产物泄露也可进一步被UNG有效酶解，多重保证不产生假 阳性非特异性反应，使核酸扩增应用检测绝对可靠。
[0013] 在本发明所述"选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素"中，在PCR反应中，核 酸扩增系统所用的所述聚合酶Taq(5U/ μ 1)中加入10% -20%量的UDG酶，在不会过度降 解产物模板而不影响特异模板扩增效率情况下，仍有效降解进一步严控的微量气雾胶而彻 底杜绝交叉污染，进一步保证靶特异扩增可靠性。
[0014] 在本发明所述"选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素"中，其技术用于基因 检测试剂25Χ的PCR增效剂：含2. 5% X 10 5(w/v)小分子肝素 （MW :2000-4000dalton)， 20% -50% (v/v)甘油，和 0· 1% -10% (w/v)PEG_及 1% ΧΙΟ 6(v/v)次氯酸。
[0015] 本发明还提供了一种选择性抑制PCR引物二聚体扩增的方法，在PCR反应中， 采用小分子肝素，所述小分子肝素分子量为2000-400()dalt〇n，所述小分子肝素浓度为 2% X106(w/v)至1% X107(w/v)。优选地，采用小分子肝素抑制本底引物二聚体非特异 性扩增；所述小分子肝素浓度为2% X 10 5X 1/16 (w/v)至2% X 10 5X 1/32 (w/v);所述小 分子肝素与本底低的优化引物对协同抑制非特异性扩增；在密闭PCR反应中，管底预置重 比重热缓释引物使分层的PCR反应液因缺少一引物成份而热启动可控扩增，采用矿物油封 闭下的一端引物分层热缓释及UNG处理使矿物油层面上或管壁上溅留的反应液因缺少完 全成份仅产生没有扩增的气雾胶泄露；所述重比重热缓释引物为10% (w/v)蔗糖稀释引 物；进行所述密闭PCR反应，将所述重比重热缓释引物预先加入到PCR管底，再依次加 PCR 各成份、最后加矿物油于PCR管壁封闭，室温下不要混匀振荡，以免破坏缓释分层，短瞬离 心使所有反应液均沉降于管底；经PCR热变性后，管底的重比重热缓释引物被热混匀或者 热释放进入反应液而启动扩增；在PCR反应中，在核酸扩增系统所用的聚合酶Taq中加入 UDG酶，所述UDG酶在聚合酶Taq中的体积含量为10 % -20 %。
[0016] 本发明还提供了一种基因检测试剂，所述基因检测试剂为25X的PCR增效剂，所 述PCR增效剂含有如下组分：小分子肝素、甘油、PEG6。。。和次氯酸；其中，小分子肝素分子 量为 2000-4000dalton，浓度为 2% X105X1/16(w/v)至 2% X 10 5X 1/32(w/v);甘油为 20% -50% (v/v) ;PEG6_S〇. 1% -10% (w/v);次氯酸为 1% ΧΙΟ 6(v/v)次氯酸。
[0017] 首先，PCR非特异性主要源于系统内引物二聚体ro几何倍数地扩增，核酸扩增系 统一般由模板、引物、底物和聚合酶及相应的缓冲液组成，其中引物不仅决定着检测的特异 性，而且扩增产物直接从引物延伸而来，靶核酸扩增数百万倍至上亿倍是由于过量的千亿 倍的引物作用所致，一对扩增引物往往使用5 μ M/L或5ρΜ/ μ 1浓度（反应终浓度0. 1 μ M/ L或0. ΙρΜ/ μ 1)，折算成分子数为5 X 6. 02 X 1017/L或5 X 6. 02 X 1011/ μ 1，其数目远远过 量于模板浓度，甚至较最终扩增产物分子数目也高出数千倍以上。一对引物每条浓度必须 3-5 μ M/L或3-5ρΜ/ μ 1才能有效的特异性扩增靶模版，如此极过量的一对引物3'末端彼 此间有互补即相互杂交延伸产生二聚体，再大量被非特异性扩增。引物二聚体形成一般是 借助其3'末端壹至多个互补碱基反向配对、互为引物延伸形成二聚体，引物对之间多个连 续反向互补碱基可通过常规引物设计方法规避。但碱基仅四种组成排列，引物3'末端与非 特异性模板有1-2个互补序列不可避免，同时DNA单链有一定柔性弯曲度，引物3'末端少 数碱基互补就可借助其互补区外的多个断续配对碱基的合力结合、延伸一些序列，延伸了 的引物对之间易多个碱基互补杂交、延伸产生二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板被 游离引物大量非特异性扩增、并结合染料，在不加模板的基于染料SYBR Green I实时荧光 PCR本底对照实验中，引物二聚体非特异性扩增一般在30个左右热循环开始进入对数增长 期，非特异性扩增开始严重起来，对于一般PCR而言，30个热循环扩增产物量足够用了，大 多PCR可以结束了，如果没有二聚体扩增产物的污染以及污染被反复扩增，引物二聚体对 于大多数30个热循环以内的PCR影响不太大。绝大多数一对引物产生二聚体的本底循环阈 值（Ct值）一般在30个循环附近，实时荧光PCR第30-38个热循环仍位于5000-5拷贝靶 分子检测范围或黄金检测窗口期，因此严重干扰低浓度靶分子精确定量和弱阳性标本准确 定性。引物形成二聚体理论上是低于引物间杂交Tm值温度时耐热聚合酶部分催化作用，但 是热变性热启动PCR的本底引物Ct值也仅推后1-3个循环数，多在Ct32个循环左右。因 此热启动仅能破坏一对引物3'末端个别1-2个碱基杂交，引物二聚体大部分成因还应该是 源于热循环引物退火温度54°C时末端少数互补碱基再借助3'末端外的引物间多个不连续 配对互补碱基的合力结合、而延伸产生二聚体。
[0018] 其次，任何一丁点PCR系统外的交叉污染也是几何级放大PCR所不能容许的，而实 时荧光PCR"闭管分析"多数情况下并不完全密闭，也存在扩增产物气雾胶再污染的难题，除 螺旋盖毛细管外，大多数0. 2ml PCR试管或96孔板，在热循环95°C变性时变软，高温高压下 就会有一些气雾胶溢（挤）出管盖，一个气雾胶颗粒就含有1〇 5个分子拷贝，气雾胶不仅含 高浓度已扩增阳性靶分子，更多的是过量一对引物间产生的引物二聚体扩增或引物-探针 聚合体的扩增，且每一个检测反应管/孔都会产生引物二聚体非特异性指数扩增。随着重 复同一PCR，泄漏的污染物会得到反复地指数扩增、积聚，随后的实时荧光PCR不是从0循环 开始而是从上次PCR结束循环数开始，污染物越来越多。扩增产物气雾胶防污染一般采用 dUTP代替dTTP产物再结合尿嘧啶-DNA-糖基酶（UDG/UNG，美国专利US 6, 090, 553)选择 性降解污染产物，UDG/UNG随后PCR热变性失活，但在实际工作中微量酶对大量的引物二聚 体含dUTP扩增产物降解作用有限，并不能消除或推后SYBR Green I实时荧光PCR本底引 物Ct值，过量酶又会过度降解模板从而抑制特异模板扩增效率。防止气雾胶溢出扩散的关 键是采用螺旋盖PCR管、加矿物油封闭等密闭措施，但即使PCR反应液表面加一层矿物油也 因加样/矿物油时溅出的或液面管壁上残留的PCR混合液仍然能在热盖条件下有效PCR扩 增，并有产物气雾胶溢出，造成下次同一重复PCR交叉污染，且仍不能够被微量UDG有效降 解。防止这种污染的一个措施是矿物油封闭下结合采用PCR -成份热缓释而使溅起矿物油 面上或管壁上残留反应液因缺少PCR完全成份而产生无效扩增的气雾胶，一般使用高比重 10%蔗糖溶解一端引物预先加入PCR管底，再依次小心加入反应液层和封闭矿物油层，PCR 反应液进入热循环后分层被打破而混匀开始热启动扩增，同时仍采用dUTP代替dTTP的底 物和UDG酶降解更进一步严控的微量产物就能彻底杜绝扩增气雾胶交叉污染。
[0019] 核酸扩增系统的引物、底物和聚合酶及相应的缓冲液（buffer)和Mg2+离子成份均 是长期实验优化结果，允许变化的范围非常窄，简单的浓度改变对引物二聚体非特异性扩 增和靶特异性扩增的效果基本均是平行的作用。如使用降低一半浓度的常规引物能显著降 低二聚体的形成量，但也同时平行急剧降低特异性靶模板扩增数量，使正常PCR不能进行。 改变聚合酶及相应的缓冲液（buffer)和Mg 2+、K+离子效果基本也是同样结果。但对于扩增 100-300bp短模板常规实时荧光PCR尤其TaqMan探针法而言，使用降低一半常规浓度dNTP 底物可提高部分扩增效率。核酸扩增技术常常采用多种PCR增强剂，如甜菜碱（Betaine)， 二甲基亚砜（DMS0)，甲/乙酰胺和二甲基甲酰胺（DMF)等增加扩增效率、平行推前约1-2个 Ct值，更主要还是有效增进模板二级结构解链而增加扩增效率，但也都平行增加引物二聚 体本底Ct值；单链结合蛋白SSB等显著抑制引物二聚体ro本底扩增但也干扰靶特异性扩 增效率，使定量线性紊乱；均对靶特异扩增和引物二聚体非特异性扩增没有特异选择性。最 后只得探寻最强的PCR抑制剂，从引物的靶特异配对扩增和引物间碱基错配非特异性扩增 的差异化抑制去探索。
[0020] 尽管各种PCR增效剂及添加物质实验显示对特异靶扩增效率与引物间非特异扩 增的影响均是平行的，导致引物二聚体非特异性主要原因还是过量引物对序列自身结合延 伸的作用，设计选择出一对本底扩增尽量低的优选引物一直是定量PCR成功的首选前提。 但是仔细分析引物与靶分子互补、对比引物-引物间的结合延伸作用，还是存在着质的差 另IJ。弓丨物与特异的靶分子之间是碱基遵循G-C、A_T法则完全配对互补的结合；由于引物设 计原则已排除了引物对之间的连续碱基互补，引物对之间是借助碱基错配结合的；引物二 聚体扩增是由于引物对极度过量经反复热循环反应才达到低浓度靶分子的扩增程度。引物 间碱基错配结合力应该显著低于引物-靶分子间配对互补结合力，这就为选择性抑制引物 二聚体ro的结合、扩增而不影响引物-靶特异性结合、扩增而提供了差异化理论依据。
[0021] 肝素是小肠肥大细胞产生的一类硫酸化粘性戊多糖，广泛作为抗凝血剂。近年来， 提取或降解的小分子肝素/肝素钠，其抗凝血活性显著降低，在不引起总凝血指标变化情 况下，具有明显的抗血栓治疗作用而不会引起出血。肝素多聚糖链构型类似于核酸多糖链， 且其高密度硫酸/磺酸负离子能强力结合DNA链碱基而成为最毒的PCR抑制剂，极微量（抗 凝血量的万分之一）就足以彻底杀灭PCR反应。同理借鉴，逐渐降解缩短的小分子肝素亦 会同步减低结合核酸DNA的能力，在低于引物-靶分子结合力而高于引物-引物间聚合力 的狭窄窗口范围内选择性地抑制引物二聚体ro非特异性扩增。
[0022] 肝素（h印arin)结构是以
（其中 R1= SO 3H/H，R2= SO 3H/ C0-CH3)基本构架的一组多样性变异重复双糖，分子式：-(C12H160 13NS2Na3)n-，小分子肝素/ 肝素钠分子量一般为2000-400()dalt〇n不等，平均每个肝素双糖单元含有2. 7个硫酸基。 大分子肝素采用肝素酶降解法（美国专利US 5106734)或肝素季胺化β消除降解（美国 专利US 5389618)法制备小分子肝素，不同浓度醇溶剂分级沉淀较大分子肝素，DEAE阴离 子交换色谱精制，最终产品采用凝胶色谱（GPC)进行分子量测定。小分子量肝素/肝素 钠 _(C12H16013NS2Na3) 4 s-即分子量 2000-4000dalton，纯度达 99% 以上肝素（h印arin)，经其 浓度梯度PCR实验对比有模板实时荧光PCR-本底实时荧光PCR抑制效果，小分子肝素对 PCR抑制浓度增加100倍量以上仍不抑制靶特异性扩增效率，而1 % (w/v) X 10 6终浓度选 择性地抑制ro扩增。
[0023] 小分子肝素作用实时荧光PCR :
[0024] 实时荧光PCR是通过实时检测扩增产物量（即产物标记荧光强度）与起始靶基 因分子数目直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号达到对数期的循环数定为(；值 (Cycle threshold)，其与祀模板起始分子拷贝数的对数存在负相关线性关系，即起始革巴模 板稀释一倍达到同样扩增产物强度所需的扩增循环就要增加一个循环数（C t值），扩增产物 增加的信号既可通过产物DNA结合荧光染料显示，如基于荧光染料SYBR Green I的实时荧 光PCR(美国专利US6, 569, 627);又可采用带淬灭基团的荧光探针TaqMan和荧光标记引物 来检测。染料法实时荧光PCR不仅便宜简便，其灵敏度和重复线性均要明显好于探针法，但 受限于更严重的引物二聚体非特异性扩增干扰。实时荧光PCR -般以25 μ 1-50 μ 1反应体 积作为其标准反应体系，本发明采用染料法实时荧光PCR25 μ 1反应体系，依次按以下比例 吸取PCR反应成份加入PCR反应管为标准配方：
[0025]
[0026] 最后，每管相应加入5 μ 1标本模板或对照检测，进行40-45个循环：变性 94°C 20-30秒，退火54°C 30秒，延伸72°C 20-30秒并读取荧光值。
[0027] 为了试验找出小分子肝素在不影响靶特异扩增效率的浓度时仍然能够有效抑制 ro扩增的肝素作用浓度范围，以乙型肝炎病毒HBV的引物（序列同后面实施例）染料法实 时荧光PCR为试验工具，进行不同浓度梯度小分子肝素对比靶模板组与不含靶模板的本底 PCR组对比试验。按上面提到的标准配方，但实验对象肝素梯度体积加大为5 μ 1，以便检测 的灵敏度更准确一些，配Α组10次PCR反应混合液加1 μ 1的1 μ g/ml X 10 2靶模板质粒， 而B组10次不含模板的本底反应混合液，反应液20 μ 1分别加入2 X 10个PCR反应管并按 下表依次加5 μ 1不同肝素梯度，进行49个热循环反应，试验结果见附图1和CT值如下表：
[0028]
[0029] 由上述实验及其结果可见，加 5μ1的1% ΧΙΟ 4X 1/16至1% ΧΙΟ 4X 1/32小分 子肝素完全不影响A组靶特异性扩增效率而完全抑制B组本底引物二聚体直至49个循环 都不扩增。
[0030] 配制25 X倍PCR增效剂的小分子肝素含量计算：换算成加 ΙμL的小分子肝素增 5Χ 倍，5X1% ΧΙΟ 4Χ1/16 至 5X1% ΧΙΟ 4Χ 1/32 = 3. 125% Χ10 5 至 1. 56% Χ10 5,取 中点平均数，即配25Χ倍增效剂含2. 5% X 10 5(w/v)肝素，加增效剂1 μ 1于25 μ 1反应 液，小分子肝素于PCR反应终浓度1% X 10 6 (w/v)不影响靶特异性扩增效率而最有效抑制 引物二聚体扩增。
[0031] 由于肝素钠盐溶解度明显好于酸性肝素，所以，肝素生产一般取钠盐形式，稀释成 PCR增效剂时以酸性肝素形式抑制引物二聚体扩增较好一些，但低浓度需要添加一定的甘 油和聚乙二醇PEG保护剂以增加其稳定性，再配合一定微量的次氯酸消解ro气雾胶产物 组成配方PCR增效剂抑制PCR非特异扩增效果更佳。同时引物对序列对肝素作用效果和 使用浓度均有一定的影响，优化较好的引物对使小分子肝素作用明显更大一些；反过来说 小分子肝素与本底低的较优化引物对具有进一步协同抑制作用，配合使用实时荧光PCR使 40-45个热循环内不加模板的本底PCR系统反应为一条直线，绝对没有引物二聚体非特异 性扩增。
[0032] 长期以来PCR非特异性得不到控制解决主要是由于内源性引物二聚体ro持续产 生、外源性气雾胶交叉污染、和一丁点产物污染的几何级数放大所致。在没有找到绝对有效 的控制外源污染前，任何的抑制内源ro探索都是徒劳的；相反没有彻底抑制内源ro扩增就 找不到控制外源污染有效方法。一般法定PCR严格操作规程只是减少了 PCR污染程度但对 几何级数放大而言作用极有限，本发明采用一引物重比重分层一热缓释配合矿物油密闭法 是保障肝素抑制内源ro作用前提。因而一般实时荧光PCR加热盖并不能封闭扩增反应，仍 需要加矿物油封闭，但在矿物油面上的残留反应液PCR时会挥发至管顶而挡住荧光光路， 所以有矿物油时PCR仪仍需要设置热盖，而热盖条件下残留反应液留在矿物油面上仍能有 效热循环扩增，所以设置热盖但不要等热盖升温就开始PCR，首先变性95°C 2-5分钟使矿物 油面上的残留反应液尽量挥发挤出管外再等热盖升温至105°C，同时配合管底预置的重比 重缓释引物使矿物油面上的残留反应液因缺少一引物成份而绝不会扩增导致扩增产物气 雾胶交叉污染；含蔗糖缓释引物还使矿物油下面PCR反应液热启动，避免低温时启动非特 异性扩增。PCR多重封闭没有气雾胶产生或仅没有扩增的气雾胶，万一可能的扩增产物泄露 也可进一步被UNG有效酶解，多重保证不产生假阳性非特异性反应，使核酸扩增应用检测 绝对可靠。
[0033] 本发明"选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素"PCR实验操作，除PCR增效剂 不同，和分层热缓释配合矿物油密闭外与一般常规PCR基本一样，标本核酸提取纯化，采用 常规方法制备，没有特殊要求。样本DNA提取制备方法包括煮沸法，PEG沉淀法，酒精沉淀 法，碱裂解法，蛋白酶K消化法，酚氯仿抽提法，离心结合柱法，及胍盐抽提磁微珠结合法。 样本总RNA提取制备一般采用异硫氰酸胍一步法或Trizol试剂快速抽提，一般不用纯化 mRNA，必要时采用PolyA纤维素或磁微珠固相法纯化。反转录（RT)即可分步反应，亦可与 PCR -步反应。快速检测选择一步RT-PCR单管反应，单管加入两种不同的酶，即用于RT的 反转录酶（如AMV或M-MLV突变体、Superscript ΙΙ/SuperScript反转录酶等），常规PCR 时DNA聚合酶没有限制，用于实时PCR采用热稳定DNA聚合酶（如Taq、Taq Plus等）。热 稳定DNA聚合酶活性在反转录过程中被其抗体所抑制，进入PCR过程的高温变性使反转录 酶失活，同时也使热稳定DNA聚合酶抑制抗体失活，使扩增反应顺利进行。还有一种策略是 使用既具有反转录酶活性，又具有DNA聚合酶活性的Tth耐热聚合酶。其PCR反应体系的 底物和聚合酶及相应的缓冲液（buffer)和Mg 2+离子浓度能够与一般普通PCR反应体系相 同或通用。
【附图说明】：
[0034] 图1为肝素浓度梯度抑制PCR反应曲线，对比有模板实时荧光PCR组A-本底实时 荧光PCR组B的Ct值，两组扩增曲线中，加5μ1的1% X104X1/16至1% Χ104Χ1/32 小分子肝素完全不影响A组靶特异性扩增效率而完全抑制B组本底引物二聚体直至49个 循环都不扩增；图2为乙肝HBV添加肝素增效剂SYBR Green I法实时荧光PCR分析，结果 pUHBcore标准定量曲线梯度较好，本底对照Ct值在45循环内基本为一直线，在PCR反应内 几乎没有扩增Ct值。 具体实施例：
[0035] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于 本发
[0036] 明的范围。
[0037] 人乙型肝炎病毒SYBR Green I实时荧光PCR:
[0038] 乙型病毒性肝炎（简称乙肝）由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV)引起 的一种世界性的传染性疾病。在中国人群中乙肝感染率非常高，极大的危害了人们的身体 健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法、放免法、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增 (PCR)荧光定量法等。酶免疫法应用较广，但是实时荧光PCR分析法能够精确测定乙型肝炎 病人的病毒基因，对感染者病毒复制水平的判断，病情传染性及抗病毒药物疗效监测具有 无法替代的重要作用。
[0039] 乙型肝炎病毒（HBV)为部分双链DNA病毒，主要有三段种型特异保守区，分别位于 表面抗原（HBsAg)区，X区和核心（Core)区，大部分HBV实时荧光PCR研究集中选择核心 (Core)区和表面抗原（HBsAg)区。HBV核心（Core)区有正负双链DNA，表面抗原（HBsAg) 区仅含负链DNA单链，且大量二级结构亦集中于此区域，影响PCR扩增效率。比较大多数发 表的核心（Core)区PCR引物序列，仍存在一些明显的引物间形成二聚体碱基互补序列，甚 至不符合一般引物设计通用原则，试用PCR实际引物二聚体大都在Ct值30循环处。
[0040] 本发明精选乙型肝炎病毒（HBV)核心（Core)区（CDR :2308-2442) -段序列作为 HBV同序引物置换的核酸扩增靶特异序列，展示两端各20碱基Core区（nt :2308-2442)序 列如下：
[0041] AB540584 Core 区（nt :2308-2442)
[0042] AATGCCCC TATCTTATCAAC------GTCGCAGAAGA TCTCAATC
[0043] HBVcore实时荧光PCR引物设计：
[0044] 本发明根椐一般引物选取原则以尽量减少引物二聚体来综合考虑、设计：
[0045] (1)选取含种型特异保守序列的100_300bp片段作为靶保守区；(2)引物长 16-24base，解链温度Tm在52-60°C，引物间差小于2-3°C; (3) -对引物GC含量50%，分布 均匀；（4) 一对引物间不要有连续3个以上碱基互补序列，避免4个以上重复序列和二级结 构；（5)引物3'末端最后5个碱基避免连续3个以上G/C碱基；(6)引物3'最末端一般选 择单个G或C碱基，如选T减少引物二聚体但也降低了特异性结合；（7)引物3'最末端绝 对不能选"GC或CG夹"结尾，产生严重引物二聚体非特异性扩增。（8) -对引物中间部分 6-8base相同序列能减缓引物二聚体非特异性扩增值。
[0046] HBVc引物序列如下：
[0047] HBVcF :5' -at gcc cct ate tta tea ac_3'
[0048] HBVcR :5,-g att gag ate tta tgc gac_3'
[0049] 其中，F代表上游特异引物序列，R代表下游特异引物序列，粗体代表同序碱基。
[0050] 另以临床检验的已知HBV阳性标本血清煮沸法上清为模板，选定全长Core区 (1900-2450)片段两侧序列合成带酶切位点引物扩增模板550bp片段，将该片段酶切并克 隆至pUC 19载体作为乙肝模拟定量对照DNA (pHBVc)，并且CPG酶甲基化后以pUC 19 (lng/ml) 液从0. 01 μ g/ml点开始作10倍稀释6-7次生成10倍梯度定量标准品，最后加2% (v/v) 甘油冻存。
[0051] 聚合酶Taq(5U/ μ 1)中加入10% -20%量的UDG酶，在不会过度降解产物模板而 不影响特异模板扩增效率情况下，仍有效降解进一步严控的微量气雾胶，从而彻底杜绝交 叉污染，进一步保证靶特异扩增可靠性。
[0052] 25Χ 的 PCR 增效剂：含 2. 5 % X 10 5(w/v)小分子肝素 （MW :2000-4000dalton)， 50% (v/v)甘油，和添加少许PEG6。。。及1% X10 6(v/v)次氯酸。
[0053] (1)标本处理：
[0054] 采用一步煮沸法，取50 μ 1-100 μ 1血清加等量的煮沸缓冲液（用前充分混匀微 珠，剪大口吸头吸取），轻混，置沸水浴10分钟，经4°C短暂冷却后高速离心10分钟，取上清 加样5 μ 1。
[0055] 弱阳性标本采用PEG沉淀HBV，取血清500 μ 1加500 μ 1 16 % (w/v) PEG盐液，振荡 (Vortex)混匀，高速离心10分钟，弃上清950 μ 1，浓缩沉淀留50 μ 1加50 μ 1煮沸缓冲液， 余同上煮沸法，加样5μ1。但PEG沉淀回收率平均为60%，定量检测必须计算损失。或另 购商业提取盒。2X 煮沸缓冲液：0· 02N Na0H，0. 02% SDS(w/v)，25mM KoAc，10mM(NH4)2S04， 0· 5% G25 (v/v)，0· 5M Betaine，0· 5% Glycerol (v/v)和 0· 05% Gelatin (w/v) 〇
[0056] (2) SYBR Green I 荧光 PCR 反应：
[0057] 采用25 μ 1反应体系，由于SYBR Green I对单链和低于0· 1 μ g/ml (101°拷贝数） DNA结合率极低，荧光本底很低，但对进入对数期扩增的高浓度DNA结合率增加数千倍，荧 光信号强烈使SYBR Green I PCR系统灵敏度高于探针法PCR-个数量级，（反应体系25 μ 1 荧光信号已大大过剩，还能够减低至纳升级，更加适合高通量的微纳PCR芯片反应）。
[0058]
[0059] 首先每个PCR管先加 2 μ 1含10%蔗糖的缓释引物HBVeF (1. 25 μ Μ)于管底，不必换 吸头；再加 5 μ 1样本或标准品于PCR管的近管底处，每管换一加样吸头；再加反应混合液 18 μ 1于相应PCR管壁中部，小心就不必换吸头；最后，每反应管再沿上部管壁小心加 30 μ 1 石蜡油，不要混匀，以防破坏缓释，短瞬离心；预加样的缓释引物常温下不进入PCR反应液 使扩增不能进行，热变性后引物完全释放入PCR反应液启动PCR运行。
[0060] 每个检测可平行2份X25 μ 1计平均Ct值，分析统计结果。
[0061] 在上述进行的实验中，实时荧光PCR仪（西安天隆公司TL988型和MJ Inc.DNA Engine 0ption?2,仪器激发光波长：480nm，检测光波长：520nm)，按使用说明书操作。首先 预反应50 °C 2分钟-95 °C 2分钟，然后45个循环：94°C 20-30秒，54°C 30秒，72 °C 20-30秒。 于72 °C读取荧光值。
[0062] 上述实验中，也可不加 SYBR Green I的反应液进行常规终末PCR35次热循环反 应，扩增条件相同，矿物油代替热盖，产物用1. 5% -2%琼脂糖凝胶电泳检测（电泳时荧光 染料影响电泳迀移率）。
[0063] (3)实验结果分析：
[0064] 模拟阳性基因质粒pHBcore定量标准品作10倍稀释梯度，其系列浓度与拷贝数的 换算及SYBR Green I实时荧光PCR产生的Ct值线性关系见下表：
[0065]
[0066] SYBR Green I实时荧光PCR实时结果见附图2,作10倍稀释模板的标准定量曲线， 表左边第一条扩增曲线为〇. 01 μ g/ml模板约109拷贝，随之10倍稀释，最后一条扩增曲线 为没有模板的本底对照，本底对照Ct值在45PCR循环内几乎没有扩增Ct值。
[0067] 血清样本加等量煮沸缓冲液后上样5 μ 1，较标准品5 μ 1稀释了一倍。根据标准曲 线ct值所得样本拷贝数或国际单位须乘两倍，按下表样本换算。Ct值〈38为阳性，Ct>39 为阴性，一般不必作溶解曲线分析，阳性Tm值87°C，Tm〈78°C为阴性。
[0068]
[0069] 通过大量培养乙型肝炎病毒（HBV)的检测和1000余例所收集的临床标本实验， 40%阳性标本病度滴度分布于10 3_109IU/ml范围内，同TaqMan探针法比较、和上海复星公 司、广洲达安公司试剂比较，同样拷贝数标本DNA的检测Ct值要早2-3个循环数，灵敏度高 出一个数量级。尤其对弱阳性标本和大量阴性血清的重复检测结果非常稳定，远好于其它 方法和试剂。
[0070]
【主权项】
1. 选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素，其特征在于，采用小分子肝素选择性抑 制引物二聚体扩增的PCR技术方法，逐渐降解缩短的小分子肝素会同比例减低其结合核酸 DNA的能力，在低于引物-靶分子完全配对的结合力而高于引物-引物间碱基错配聚合力的 对应肝素作用浓度范围内选择性地抑制引物二聚体非特异性扩增；其中，小分子肝素分子 量为2000-4000dalton，选择性抑制PCR引物二聚体扩增的小分子肝素浓度范围为：终浓度 2% X 10 6(w/v)至1% X 10 7(w/v)，小分子肝素能够不影响靶特异性扩增而有效抑制本底 引物二聚体非特异性扩增。2. 根椐权利要求1所述的选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素，其特征在于，经 小分子肝素浓度梯度PCR实验，对比有模板实时荧光PCR和本底实时荧光PCR的抑制效果， 优化终浓度为2% X 10 5X 1/16 (w/v)至2% X 10 5X 1/32 (w/v)的小分子肝素完全不影响 靶特异性扩增效率而完全抑制本底引物二聚体直至49个热循环都不扩增。3. 根椐权利要求1所述的选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素，其特征在于，对 本底越低的优化引物对，小分子肝素抑制引物二聚体扩增作用越强；引物对序列对肝素作 用效果和使用浓度均有一定的影响，优化较好的引物对使小分子肝素作用明显更大一些； 反过来说小分子肝素与本底低的较优化引物对具有进一步协同抑制非特异性效果；不同序 列优化引物对其小分子肝素最佳作用浓度范围亦有一定变异，具体引物要由对比抑制PCR 试验决定。4. 根椐权利要求1所述的选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素，其特征在于，在 密闭PCR反应中，管底预置重比重引物使分层的PCR反应液因缺少一引物成份而热启动可 控扩增，采用矿物油封闭下的一端引物分层热缓释及UNG处理也使矿物油层面上或管壁上 溅留的反应液因缺少完全成份仅产生没有扩增的气雾胶泄露；加小分子肝素的优化引物 PCR使核酸检测反应内没有引物二聚体累积，泄露的气雾胶又是没有扩增的气雾胶，万一极 微量的产物泄露就能够进一步被UNG有效酶解。5. 根椐权利要求4所述的选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素，其特征在于，所 述重比重的热缓释引物是10% (w/v)蔗糖稀释引物，高比重粘性引物预先加入PCR管底，再 依次加 PCR各成份、最后加矿物油于PCR管壁，室温下不要混匀振荡，以免破坏缓释分层，短 瞬离心使所有反应液均沉降于管底；经PCR热变性后，管底的重引物被热混匀或者热释放 进入反应液而启动扩增，而矿物油封闭层面上残留液因缺少完全的PCR成份仅产生无效扩 增的微量气雾胶，万一可能的扩增产物泄露也能够进一步被UNG有效酶解，多重保证不产 生假阳性非特异性反应，使核酸扩增应用检测绝对可靠。6. 根椐权利要求5所述的选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素，其特征在于，在 PCR反应中，核酸扩增系统所用的聚合酶Taq(5U/yl)中加入10% -20%量的UDG酶，在不 会过度降解产物模板而不影响特异模板扩增效率情况下，仍有效降解进一步严控的微量气 雾胶而彻底杜绝交叉污染，进一步保证靶特异扩增可靠性。7. 根椐权利要求1所述的选择性抑制引物二聚体扩增的小分子肝素，其特征在于， 小分子肝素用于构成基因检测试剂25 X的PCR增效剂，所述PCR增效剂含有如下组 分：2 % ΧΙΟ 5X1/16 至 2 % X 10 5X 1/32(w/v)小分子肝素，20 % -50 % (w/v)甘油， 0· 1% -10% (w/v)PEG6。。。及 1% ΧΙΟ 6(v/v)次氯酸。8. -种选择性抑制PCR引物二聚体扩增的方法，其特征在于，在PCR反应中，采用小分 子肝素，所述小分子肝素分子量为2000-4000dalton，所述小分子肝素浓度为2% X 10 6(w/ v)至 1 % X 10 7 (w/v)。9. 根据权利要求8所述的选择性抑制PCR引物二聚体扩增的方法，其特征在于，采用小 分子肝素抑制本底引物二聚体非特异性扩增； 所述小分子肝素浓度为2% X105X1/16(w/v)至2% X 10 5X 1/32(w/v); 所述小分子肝素与本底低的优化引物对协同抑制非特异性扩增； 在密闭PCR反应中，管底预置重比重热缓释引物使分层的PCR反应液因缺少一引物成 份而热启动可控扩增，采用矿物油封闭下的一端引物分层热缓释及UNG处理使矿物油层面 上或管壁上溅留的反应液因缺少完全成份仅产生没有扩增的气雾胶泄露； 所述重比重热缓释引物为10% (w/v)蔗糖稀释引物；进行所述密闭PCR反应，将所述 重比重热缓释引物预先加入到PCR管底，再依次加 PCR各成份、最后加矿物油于PCR管壁 封闭，室温下不要混匀振荡，以免破坏缓释分层，短瞬离心使所有反应液均沉降于管底；经 PCR热变性后，管底的重比重热缓释引物被热混匀或者热释放进入反应液而启动扩增； 在PCR反应中，在核酸扩增系统所用的聚合酶Taq中加入UDG酶，所述UDG酶在聚合酶 Taq中的体积含量为10% -20%。10. -种基因检测试剂，其特征在于，所述基因检测试剂为25X的PCR增效剂，所述 PCR增效剂含有如下组分：小分子肝素、甘油、PEG_。和次氯酸；其中， 小分子肝素分子量为2000-4000dalton，浓度为2 % X10 5X1/16(w/v)至 2% X 10 5X 1/32(w/v)； 甘油为 20% -50% (v/v); PEG_S〇. 1% -10% (w/v); 次氯酸为1% ΧΙΟ 6(v/V)次氯酸。
【文档编号】C12N15/10GK105985947SQ201510090536
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月28日
【发明人】江洪, 岳素文, 何玉贵
【申请人】北京万达因生物医学技术有限责任公司