培育抗草甘膦植物的双价表达载体的制作方法

专利名称：：培育抗草甘膦植物的双价表达载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种培育抗草甘膦植物的双价表达载体，特别是涉及含有和G2-aro4基因的双价植物表达载体。
背景技术：
：草甘膦(Glyphosate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂，其作用机制是通过抑制植物体内EPSP合酶(全称为5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)活性，干扰植物体内芳香族氨基酸的生物合成，导致植物死亡(S.R.Padgetteetal.，inHerbicide-Resiste加Cro戸JgWcwtora/,五"v/ra柳e她/,五comoto'c,Wegw/atofy,anarec/jw/ca"specte,S.O.Duke,Ed.(CRCPress,BocaRaton,FL，1996)，pp.53-84)。如果植物体内的EPSP合酶基因发生突变，产生出与草甘膦亲和性较低的EPSP合酶，不能很好的甚至根本不能与草甘膦结合，则此植物就具有了抗草甘膦能力。此外，有人利用乙酰转移酶使植物体内的草甘膦N-乙酰化。研究表明，乙酰化也可使草甘膦失去除草剂活性(Castleetal.,2004)。然而，上述两种方式的抗草甘膦效果并不十分令人满意，如草甘膦在植物体内尤其是分生组织积累(Gougler&Geiger,1981)，会影响植物生殖发育进而降低作物产量(Plineetal.,2002)。
发明内容本发明的目的是构建同时含有抗草甘膦的EPSPS基因(G2-wa4)和N-乙酰转移酶gW基因的双价植物表达载体，培育具有更优抗草甘膦能力的转基因植物。本发明利用抗草甘膦的基因(G2-wa4)和iV-乙酰转移酶g^基因，将草甘膦主动抗性途径与被动抗性途径相结合，构建了同时含有这两个基因的植物表达载体。本发明提供的含有G2-wo4基因和gW基因的重组植物表达载体，能在植物中表达降解草甘膦的EPSPS合酶和使草甘膦N-乙酰化的N-乙酰转移酶。该重组双价表达载体是指在编码G2-wo4基因和g加基因的5'端可操作地连接有一个或多个酶切位点、一个或多个不同来源的启动子序列、一个或多个不同来源的增强子序列、Q序列、Kozak序列和分泌信号序列、编码G2-wo4基因和gW基因的DNA序列、以及3'端带有多酶切位点及一个或多个不同来源的终止序列。为了使外源基因在植物细胞中在转录和翻译水平上获得高效表达，在外源基因侧翼必须连接有适当的表达调控元件。本发明中设计了为在受体植物中高效表达G2一wo4基因和g^基因所需的启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸序列、以及便于在适当的培养基中筛选被转化细胞的选择标记基因等。适于与本发明双价载体中的G2—woA基因和gW基因连接，并在植物细胞中启动该编码DNA序列转录开始的包括组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性的启动子。包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子，甘露碱合成酶(MAS)启动子，胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子，玉米乙醇脱氢酶启动子，二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基启动子、由甘露碱合成酶基因的启动子与花椰菜花叶病毒的35S启动子相融合而成的启动子、带有两个增强序列的花椰菜花叶病毒的35S启动子、以及适于在单子叶植物中表达的Ubi、Emu、Actinl启动子等。本发明优选花椰菜花叶病毒的35S启动子。所述终止子是指任何能终止结构基因在植物中表达的终止子，如包括质粒pTiA6的T-DNA7'5'双向终止子、章鱼碱合成酶基因终止子、花椰菜花叶病毒35SRNA终止子或胭脂碱合酶(Nos)基因或其他基因的终止子等等。本发明优选Mw基因的终止子。可使用本领域中已知的方法，将本发明提供的适于在植物细胞中表达的双价基因构建体，连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的载体上。这样的载体例如包括衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19(Yanisch-perronetal.，Gene33:103-119，1985)，尤其是植物表达载体pBI101,pBI121，pBI131系统(Jefferson,etal"EMBOJ.16:3901，1987)及pCamBia系统(Hajdukiewiczetal.，PlantMolBiol25:989-994,1994;Hieietal.，ThePlantJ6:271-282，1994)等等。在本发明的优选实施方案中，携带G2—"raA基因和g加基因构建体的载体是pBlueScriptSK、pUC18、pUC19、pCamBia2301等，后者特别适于作为制备植物双价表达载体的工具质粒载体。当然，如前所述，为了正确地选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组表达载体还应含有可选择标记基因。所使用的选择标记基因的两侧可带有各自的调节序列，以促使它们在植物中的表达。适用的选择标记是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化时同时应用的不同的载体中。本发明优选的选择标记基因是^/^//基因，并一同包含于同一个重组表达载体内，从而保证了对被转化细胞或植株选择的可靠性。归纳起来，本发明提供的适于在植物细胞中表达的G2—wo^基因和g"堪因植物双价表达载体包含1)G2—araA基因表达盒；a)CaMV35S启动子；b)编码G2—woA基因的核苷酸序列；c)Nos终止子。2)g"/基因表达盒a)CaMV35S启动子；b)编码g加基因的核苷酸序列；c)Nos终止子。3)来源于pCamBia2301的载体部分a)NPTII表达盒；b)起始复制子及与植物转化相关的T-DNA左右边界序列等功能结构。为了在植物细胞中，特别是整株植物中表达外源基因，必须使用适当的方法将携带G2—araA基因和g加基因的重组双价表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内。将携带外源基因的重组载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但并不仅限于1)农杆菌介导的转化法(_4gro6ac/e〃'ww-mediatedtransformation);2)物理法，如基因枪法(Particlebombardment或Particlegun或Genegun)、电击法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声波法(Ultrasonic)、激光微束法(Lasermicrowave)、碳化硅纤维介导法(Siliconcarbidefiber)、电泳法(Electrophoretictransfection)等；3)化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等；4)种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法(子房注射法)、浸泡法等；5)以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法等等。本发明所述的植物既包括完整植株，也包括植物种子、植物体的器官、组织和细胞，还包括双价转基因植物的后代，以及由被转化的细胞或愈伤组织再生的植物。在本发明给出的一个实例，所述植物是烟草。通过农杆菌介导法转入烟草，得到了草甘膦抗性更强更稳定的双价转基因烟草。本发明的优点和效果通过将G2—wo4和ga堪因同时转入植物，不但避免了草甘膦在植物体内积累所产生的负面影响，同时还提高了转基因植物抵抗草甘膦的能力，在抗草甘膦植物基因工程中具有重要的应用前景。图1是p2301G2-gat酶切分析。图中，M:入DNAH/EMarker;1:￡coRI;2:^boRI+历.77dlII;3:历'/7dni+J^OTl;4:^boRI+J^M;5:5aT7HI+尸Stl;6:AcoRI+J6al。图2是转基因烟草的PCR检测。图中，A:转g^基因M:Molecularmarker;CK+:p2301GAT质粒DNA为模板;l-ll:转基因植株，CK-:受体NC89基因组DNA为模板；B:转G2-ara^基因M:Molecularmarker;CK+:p2301G2质粒DNA为模板;l-6:转基因植株，CK-:受体NC89基因组DNA为模板；C:转gat和G2-aro^4基因M:Molecularmarker;CK+:p2301G2-gat质粒DNA为模板;l-ll:转基因植株，CK-:受体NC89基因组DNA为模板。图3是转基因烟草的Southern杂交检测。图中，A:转g^基因烟草的Southern检领"M:MolecularMarker;CK+:p2301GAT质粒DNA;1~6:转基因烟草2#，5#，9#，6#，10#，31#;CK-:NC89B:双价转基因烟草的Southern检测，M:MolecularMarker;CK+:p2301G2-gat质粒DNA;1~6:转基因烟草2#，3#，5#，11#，17#，21#;CK-:NC89，其中2.6kb片段为包含完整G2-oTO^基因的杂交条带，而0.8kb与0.9kb杂交条带中分别包含gat基因的320bp与121bp大小的片段。图4是转基因烟草的RT-PCR检测。图中，A:转g加基因烟草的RT-PCR检测，M:Molecularmarker;CK+-p2301GAT质粒DNA为模板；2-6:转基因植株2#，5#，9#，6#，10#，31#;7:Non-RT;CK-:Non-transgene植株；B:转G2-ar"基因烟草的RT-PCR检测，M:Molecularmarker;CK+:p2301G2质粒DNA为模板；2-6:转基因植株2、5#，9*，6#，10#，31*;7:Non-RT;CK-:Non-transgene植株；C:双价转基因烟草gW和G2-ara^基因RT-PCR检测，M:Molecularmarker;CK+:p2301G2-gat质粒DNA为模板；2-6:转基因植株2#，5#，9#，6、10#，31#;7:Non-RT;CK-:Non-transgene植株。图5是转烟草的westernblot检测。其中，A:转gat基因烟草的westernblot检测，CK+:EGAT表达产物CK-:Non-transgene植株；1-5:转基因植株2弁，5#，9#，6#，10#;B:双价转基因烟草的westernblot检测，CK+:EGAT与MEPS表达产物CK-:Non-transgene植株;1-5:转基因植株2#，3#，5#，11#，17#。图6是喷施草甘膦剂(l升/公顷剂量的Roundup除草剂)后，4种不同的烟草(包括转基因和非转基因)的生长情况，作为对草甘膦抗性分析，4种烟草分别是(a)GAT和EPSPS双价转基因，(b)GAT单价转基因，(c)EPSPS单价转基因，(d)非转基因受体NC89烟草。具体实施例方式以下实施例中所举的质粒、菌株、植物等只是用于对本发明的方法作进一步举例说明，并不对本发明的实质内容加以限制。实施例中使用的质粒、菌株来源如下植物表达载体pBI121为Clontech公司市售产品；植物表达载体pCamBia2301、质粒pGAT、质粒pG2和质粒p4A:来源于中国农业科学院生物技术所林敏实验室构建保存；克隆载体pBluescriptII(SK)(-):为Stratagene公司市售产品克隆载体T-载体和受体菌E.coliDH5a为TaKaRa公司市售产品；受体菌LBA4404:为Gibco公司市售产品。实施例l双价植物表达载体的构建1)以pGAT质粒为模板，以5'GCTCGAGATGATTGACGTGAACCCAAT3'与5，GGTTAACTTATGCGATCCTCTTGTACA3'为引物(加A^oI和/pfll位点)利用PCR扩增得到两端分别带有^oI和/z;^I限制性位点的基因片段，与T-载体连接；2)1)中的连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，命名为pGAT-T;3)p4A和pSK质粒经与历miIII消化后分别回收1.4kb和2.7kb的DNA条带，连接后转化大肠杆菌DH5ct，挑选阳性克隆，命名为pSK4A;4)pSK4A和pGAT-T质粒经力ol与消化后分别回收4.1kb和435bp的DNA条带，连接后转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，命名为pS4AGAT;5)pS4AGAT和pCAMBIA2301质粒经K戸I与户M消化后分别回收1.8kb禾Q11.6kb的DNA条带，连接后转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，命名为p2301GAT;6)以pG2质粒为模板，以5，GCTCGAGATGGCGTGTTTGCCTGATGA3，与5，GGTTAACTCAGTCGTTTAGGTGAACGCC3'为引物(加入力al和feci位点)利用PCR扩增得到两端分别带有力fll和Sad限制性位点的基因片段，与T-载体连接转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，命名为pG2-T;7)pSK和pBI121质粒经五coRI和///"dill双切，分别回收2.7kb和2.9kb的DNA条带，连接后转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，命名为pSK121;8)pSK121和pG2-T质粒经Wfll和Sacl双切，分别回收3.7kb和1.35kb的DNA条带，连接后转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，命名为pSKG2;9)pSKG2和pCAMBIA2301质粒经K/wI和五coRI双酶切，分别回收11.6kb和2.5kb的DNA条带，连接后转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，命名为p2301G2;10)p2301G2首先用^wnHI酶切，回收大片段后用T4DNA聚合酶(Takara公司)进行粘性末端的补平，然后经《;wl酶切消化后回收大的DNA条带；pS4AGAT经与双切后回收1.8kb的DNA条带，与前面片段连接后转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，命名为pG2-GAT;11)pG2-GAT经多种酶切鉴定，证明构建的载体是正确的。酶切鉴定见图l。实施例2农杆菌介导法获得双价转基因烟草本实施例利用农杆菌介导法，成功的获得了具有G2—37"oA基因和gat基因的转基因烟草。采用的烟草受体材料为NC89，农杆菌为LBA4404，具体操作步骤如下1)根癌农杆菌LBA4404感受态的制备(1)从平板上挑取单菌落，接种到5mlYEB液体培养基(含链霉素Strep125mg/L)，28°C、250rpm振荡培养过夜(2)取2ml菌液，加入50mlYEB液体培养基(含Strep125mg/L)中，28°C、250rpm振荡培养至0D6(X)约0.6左右(3)将菌液转至50ml无菌离心管中，冰浴30min。5000rpm离心5min(4)弃上清，沉淀用2ml20mMCaCl2重悬，每份100pi分装到1.5ml离心管中，液氮中保存备用。2)重组质粒DNA转入农杆菌HlLBA4404感受态细胞中，混匀，冰浴5min(2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37°C水浴中温浴5min(3)加入lmlYEB液体培养基，在28°C摇床上250rpm复苏4-5h(4)取适量菌液涂布到含Strep250-300mg/L、Rif(利福平)250-300mg/L和Kan(卡那霉素)100mg/L的YEB固体培养基上，置28°C培养24-48h。3)叶盘法转化烟草品种NC89(1)农杆菌的活化从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5mlYEB液体培养基中(Kan100mg/L,Strep100mg/L，Rif300mg/L),振荡培养过夜；取1ml菌液接种到50mlYEB液体培养基(Kan100mg/L,Strep100mg/L，Rif300mg/L)中，剧烈振荡培养至OD600为0.4-0.5(约3-4h);5,000rpm离心5min，菌体用MSo培养基(不含激素)重悬，使0D6(K)为0.1-0.2(2)烟草的遗传转化a)共培养将侵染过的叶块摆放在铺有2层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA2mg/L)上，25°C暗培养4天b)抗性芽的筛选将经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培养基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA2mg/L+Kan100mg/L+Cef(噻孢霉素)500mg/L)上，23周后即可生芽生根待抗性芽长到1cm左右时，将其转移到生根培养基(MS+Kan100mg/L+Cef500mg/L)上，1~2周后即有不定根形成。实验例l转基因烟草的分子检测1.1烟草DNA的提取I)25-50mg新鲜烟草叶片于1.5mlEppendorf管内研磨2)加入700pi65°C预热的DNA提取缓冲液(2%(W/V)CTAB,1.42MNaCl,20mMEDTA，100mMTris-HCl，2%巯基乙醇，pH8.0)3)加入7piRAase(20mg/ml),65°C水浴1h4)常温离心10min5)取上清，加等体积氯仿-异戊醇抽提6)常温离心10min7)取上清，加2倍体积无水乙醇和1/10体积的3MNaAc(pH5.2)，-20。C沉淀30min8)12000rpm、4'C离心10min9)沉淀用70%乙醇漂洗一次，离心，晾干10)加适量TE溶解II)测定DNA的浓度，取少量样品电泳，Agarose胶的浓度为1%12)样品在4'C保存备用。1.2转基因烟草的PCR检测1)gfl遂因PCR以Fl(5'ATGATTGACGTGAACCCAAT3，)与Rl(5，TTATGCGATCCTCTTGTACA3')为引物，基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增条件94'C预变性5min，94°C30sec，60°C30sec,72°C30sec,25个循环，72。C延伸5min。2)G2-ara^基因PCR以F2(5'ATGGCGTGTTTGCCTGATGA3，)与R2(5'TCAGTCGTTTAGGTGAACGCC3')为引物，基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增条件94'C预变性5min，94°C30see,58°C30sec,72°C90sec，25个循环，72。C延伸5min。结果见图2。1.3转基因烟草的Southernblot检测分别取三类转基因烟草PCR阳性植株基因组DNA10pg经适当限制性酶切消化，毛细管法转移到HybondTM-N+膜上，以ga/基因与G2-araJ基因DNA片段为模板制备探针，利用DIG-HighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII(购自BoehringerMannheimBiochemicals)进行Southernblot检测。其中基因单价转基因烟草DNA采用賴'wdlII与&oRI双切，双价转基因烟草采用五coRI与AT;wI双切。具体操作如下1)转膜(1)DNA电泳后，将凝胶转移到一玻璃烤盘中。用刀片修去凝胶边缘无用的部分，包括加样孔上方的凝胶。在凝胶上保留足够的加样孔以使DNA转移结束后将加样孔的位置标记于膜上，在凝胶左下角切去一小三角形(加样孔一端为下)，作为凝胶方位的标记(2)将凝胶浸入200ml变性液中，室温下放置45min，并轻轻振荡；用去离子水短暂浸泡凝胶，然后将凝胶浸于200ml(或IO倍于凝胶体积)中和缓冲液中，室温放置30min，并轻轻振荡。换一次中和缓冲液继续浸泡凝胶15min(3)当对凝胶进行浸泡处理时，准备杂交膜。戴干净手套，剪下一块膜，膜的大小，应该比凝胶长lcm宽lcm。将膜漂浮于盛有去离子水的皿中直到膜从下往上完全浸湿，然后将膜浸入转移缓冲液中至少5min。用干净的刀片切下膜的一角，与凝胶切下的一角相一致。剪出6片与膜面积相等的滤纸，将其中的2片滤纸用转移缓冲液浸泡(4)DNA进行变性的过程中，将一张厚的吸水纸放在一片树脂玻璃板或玻璃皿上形成比凝胶长且宽的支持物，吸水纸的两端浸入转移液中，皿中放入适当的转移缓冲液直到液面几乎与支持物表面平齐，当支持物上的吸水纸完全湿润后，用一只玻璃棒赶走气泡(5)取出凝胶并倒转使原来的底面向上，把倒转的凝胶小心地滑到支持物上并位于滤纸中央，确保滤纸和凝胶之间无任何气泡(6)用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶四周，但不要覆盖凝胶(7)用适当的转移缓冲液将凝胶湿润。将湿润的膜置于凝胶上并使两者切角相重叠。为避免产生气泡，应当先使膜的一角与凝胶接触再缓慢的将膜放到凝胶上。膜的一条边缘应恰好超过凝胶上部加样孔一线的边缘(8)将转移缓冲液浸湿的两张滤纸置于湿润的膜上，用吸管赶走滞留的气泡，继而在上面铺4张干的滤纸(9)剪切一个5-8cm高的面巾纸塔，其大小和滤纸基本相同或略小，将纸塔放在滤纸上面，在纸巾顶部放一块玻璃板然后用400g重物压实(10)DNA转移需进行8-24h，当纸巾湿润后更换新的纸巾，尽量避免整叠纸巾都被缓冲液浸湿。除去凝胶上的纸巾以及吸水滤纸。翻转凝胶以及与之接触的膜，凝胶向上。(11)平放于干燥的吸水纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔标记加样孔的位置；将凝胶从膜上剥离，弃去凝胶；将膜浸于6xSSC中，5min(12)真空烘烤固定DNA:将膜从6xSSC中取出并使多余的液体流净。将膜放在纸巾上室温下晾干30min，然后将膜夹在两张干燥的吸水纸中间，在真空炉中80°C烘烤30-120min。2)标记探针(1)向500pl离心管中加入l吗的模板DNA，加超纯水至16^(2)沸水中加热10min后，迅速用冰/盐浴冷却使DNA变性(3)加4piDIG-HIGHPrimer，混匀，瞬时离心(4)37。C过夜(5)加入2pl0.2mol/1EDTA(pH8.0)或65。C加热10分钟终止反应。3)杂交(1)力卩200nlNBT/BCIP浓縮液到10mlDetectionbuffer(0.1MTris-HCl，0.1MNaCl,50mMMgCl2，pH9.5)中(2)预热适当体积的DIGEasyHyb液(37-42°C)(10ml/100cm2膜)(3)在杂交管中预杂交膜30分钟(4)煮沸DIG-labeledDNAprobe(约25ng/mlDIGEasyHyb)5分钟变性后迅速置于冰上冷却(5)加入变性的DIG-labeledDNAprobe于预热的DIGEasyHyb液中G.5ml/100cm2膜)混匀(注意不要产生气泡)，杂交4小时或过夜。4)洗膜(1)用2xSSC,O.P/。SDS在15-25。C洗涤，2次5分钟。(2)用0.5xSSC，0.1%SDS(提前预热)在65-68t)洗涤，2次15分钟。5)检测(所有孵育均在25-5(TC下进行)(1)洗完膜后，用Washingbuffer(Maleicacidbuffer(0.1mol/lmaleicacid，0.15mol/lNaCl,用NaOH调至pH7.5)加0.3%的Tween20(v/v))轻轻洗膜一次(1-5分钟)(2)在100mllxBlockingsolution(用Maleicacidbuffer稀释lOxblockingsolution(试剂盒所带)1:10)中孵育30分钟(3)在20mlAntibodysolution(Anit-Digoxigenin-AP1:10000inBlockingsolution)再孵育30分钟(4)用100mlWashingbuffer洗涤2次15分钟(5)用20mlDetectionbuffer平衡2-5分钟(6)将膜面朝上放入杂交袋中，立即加入lmlCSPDready-to-use(bottle5)，15-25'C孵育5分钟(7)赶出气泡和多余液体，封上杂交袋(8)37。C孵育10分钟(9)X-ray片曝光15-25分钟(15-25。C)。6)硝酸纤维素膜上洗去探针(1)准备数百毫升洗脱液0.05xSSC，0.01MEDTA(pH8.0)煮沸(2)将洗脱液从加热器上移下，加入SDS至终浓度0.P/。(w/v)(3)将膜浸入上述热洗脱液15分钟，期间轻轻摇动(4)新配制洗脱液重复步骤2-3(注意所有过程不能使膜干燥)(5)用0.01xSSC于室温下短暂漂洗滤膜，在滤纸上控去大部分液体(6)X-ray检测探针是否去除干净(7)晾干滤膜，铝箔包好，室温、真空下保存。结果见图3。1.4转基因烟草的RT-PCR检测烟草叶片总RNA的提取(RNA提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司W6771)1)烟草叶片的裂解液氮冷冻条件下将组织捣碎成粉末。待液氮自然挥发后，加入500plTCP液，用移液器抽打5次以悬浮样品。移入1.5ml离心管，立即用带针头的一次性5ml注射器抽打裂解物10次。12，000rpm离心3min，将上清移入另外一个离心管中2)加入250nl75。/。乙醇。彻底混匀后，全部移入吸附柱中。离心30sec。倒掉收集管中的液体。将吸附柱移入同一个收集管中3)加入500plRP液，离心30sec。弃收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管中14)加入500液，静置lmin后，离心15sec5)将吸附柱移入一个干净的收集管中，加入500plW3液，离心15sec6)倒掉收集管中的液体，再将吸附柱移入同一个收集管中，离心lmin7)将吸附柱移入另一个干净的1.5ml离心管中。在吸附膜中央加入50pl纯水，室温静置1min后，离心1min。将1.5ml离心管(RNA)置于-70。C保存备用。提取Southernblot阳性植株总RNA，总RNA经DNAaseI作用去除DNA的污染。反转录按试剂盒说明进行操作(ProtoScript第一链cDNA合成试剂盒，NEB)。其中基因，G2-ara^基因反转录引物分别为Rl(5'TTATGCGATCCTCTTGTACA3，)，R2(5，TCAGTCGTTTAGGTGAACGCC3');双价转基因烟草反转录引物分别为Rl与R2。RT-PCR反应条件为g加基因94。C预变性5min，94°C30sec,64°C30sec，72°C30sec，30个循环，72。C延伸5min;G2-aro^基因94。C预变性5min，94°C30sec，62°C30sec，72°C90sec，25个循环，72。C延伸5min。结果见图4。1.5转基因烟草的Westernblot检测提取RT-PCR阳性植株叶片蛋白取lOOmg新鲜烟草叶片，加入液氮和石英砂，充分研磨；将粉末转入1.5ml离心管，待液氮完全挥发后，加入800u1蛋白提取buffer(200mMTris-HCl(pH8.0)，lOOmMNaCl，400mM庶糖，14mMP—巯基乙醇，1mMPMSF，0.05%Tween20)，振荡5min;12500rpm，4'C离心20min，取上清即为叶片粗蛋白，进行Westernblot检测。Westernblot分析溶液配制a)Transferbuffer:1L25mMTris192mMGlycinePH8.3称取3.03gTris,14.4gGlycin定容至1Lb)10xAP显色Buffer:50ml1MTris-HCLPH9.51MNaCl50mMMgCl26.057gTris加浓盐酸300^左右调pH至9.52.922gNaCl4MMgCL21.25ml定容至50ml用时稀释10倍c)10xTBS:画mMTris-HCLpH8.01.5MNaCld)TBST:lxTBS+0.05%Tween20e)封闭液:TBST+5%脱脂奶粉(或3%BSA)实验步骤1)PVDF膜剪成与胶等大，甲醇浸泡30sec，放入转移Buffer(25mMTris，192mMGlycinepH8.3)中平衡，海绵片，滤纸片，电泳胶及PVDF膜放在转移Buffer中平衡20min2)三明治方法海绵，滤纸，膜，胶，滤纸，海绵，黑色夹板依次排好，确保胶与膜之间没有气泡，夹紧装置，黑色板与黑色电极相对，放入转移槽中，冷却槽在冰箱内冻成冰，放入转移槽里,加入Buffer3)插好电极，正，负/红，黑相对，负—正转移4)稳流350Ma电压约80-130V之间。随时间推移，电压会下降。若转膜装置发热，将其置于装满冰的盒中冷却。转膜ih5)卸下装置，PVDF膜用转移Buffer漂洗一下，室温封闭2h(封闭液:3。/。BSA35ml)6)将胶放入染色液中染色，无任何蛋白条带则转膜完全7)封闭液10ml+10nl抗血清(1:1000)室温结合l-2h8)用TBST(lxTBS(10xTBS100mMTris-HCLpH8.0，1.5MNaCl)+0.05%Tween209)洗膜3次，每次50ml，每次10-30min，摇动10)加入TBST20ml加入0.7pl二抗(1:30000)室温轻轻摇动1h11)用TBST洗膜3次，每次50ml，15min12)取5mlAPBuffer(1MTris國HCLpH9.51MNaCl，50mMMgCl2)加入33piNBT贮存液，混匀后立即加入16.5^BCIP混匀，将膜放入轻柔晃动，暗处显色10min。待显色到所需强度后，倒出显色液，加入ddH20终止反应。结果见图5。实验例2To代转基因植株采用叶面喷施草甘膦法抗性分析1、0.8升/公顷剂量的Roundup除草剂喷施处理方法选取长势良好、均一的转ga/、G2-flroJ以及g""G2-m^4双价基因的烟草各30株，当植株长至6-8叶期时以0.8升/公顷剂量的Roundup除草剂喷施处理，以10株受体烟草(NC89)为对照，观察其受害状况。结果对照植株喷施后l-3天，全部对照植株表现出受害症状，部分叶片及茎尖开始稍有萎蔫，5天后全部严重萎蔫并有失绿发生，一周后全部死亡。转g^基因烟草处理两周后有烟草24株存活，没有明显的受害症状，其余6株处理5天后开始萎蔫，两周后逐渐死亡；转ar^基因烟草处理两周后只有4株存活且有3株表现受害症状，部分叶片失绿；双价转基因烟草26株生长正常，具有草甘膦耐受能力，没有明显的受害症状，仅4株处理5天后开始萎蔫逐渐失绿死亡。2、1升/公顷剂量的Roundup除草剂喷施处理方法同上。但以1升/公顷剂量的Roundup除草剂喷施处理。结果两周后，所有单价转基因烟草均不能存活，而双价转基因烟草仍有两株存活，且表现轻微受害症状(图6)。表明双价转基因烟草较单价转基因烟草具有更高的草甘膦耐受能力。实验例3子一代转基因烟草种子发芽实验草甘膦抗性分析方法未经转化的受体烟草种子经表面灭菌后，接种于含不同浓度草甘膦(0，30，50，80，100，150，200pM)MSo培养基上，在25。C、1200Lx暗光照下萌发。4周后观察幼苗生长状况，确定使烟草完全白化的最低草甘膦浓度。转基因烟草种子经同样处理，接种于含(高于使受体烟草完全白化的最低浓度草甘膦)不同浓度草甘膦U00nM，200pM，lmM，5mM，10mM)MSo培养基上相同条件萌发，4周后观察幼苗生长状况。以幼叶完全绿，或大部分绿只有一些白化部位为草甘膦抗性苗;白化死亡为非抗性苗。结果三种类型转基因烟草子一代种子在含有不同浓度草甘膦的MSO培养基上存活率比较结果见表l。当草甘膦浓度为100pM时，转卵t、G2-arW基因单价与卵t+G2-ara/J基因双价烟草子均具有耐受能力，种子萌发后的存活率间无明显差异，分别为74%，74%和77%;当草甘膦浓度达到lraM时含有G2-a^^基因的单价转基因烟草，巳经无抗性植株存活，卵t卓份与卵t+G2-s/^l基因双价转基因烟草的存活率无明显差异，分别为73%和74%;当草甘膦浓度达到lOmM时，含有《st基因的单价转基因烟草全部植株白化死亡，而含有gat+G2-ard基因的双价转基因烟草仍有14%的植株存活，差异达极显著水平。表l转基因烟草在不同草甘膦浓度培养基上的存活率比较<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注1、表中的百分数表示存活百分率；2、多重比较采用LSD法，不同大写字母表示差异达到O.Ol的显著水平。结论以上结果表明，双价转基因烟草L代种子草甘膦抗性好于gat和G2-arM单价转基因烟草Tt代种子。权利要求1.一种重组双价表达载体，其特征是含有G2-aroA基因和gat基因。2.根据权利要求1所述的重组双价表达载体，适于与所述载体中的G2—srM基因和卵t基因连接，并在植物细胞中启动该编码DNA序列转录开始的启动子是花椰菜花叶病毒的35S启动子。3.根据权利要求1所述的重组双价表达载体，终止结构基因在植物中表达的终止子是/Vos基因的终止子。4.根据权利要求1、2、3中任一权利要求所述的重组双价表达载体，携带G2—arW基因和卵t基因构建体的载体选自pBlueScriptSK、pUC18、pUC19或pCamBia2301之一。5.根据权利要求1所述的重组双价表达载体的用途，是在植物中表达可降解草甘膦的EPSPS合酶和使草甘膦N-乙酰化的N-乙酰转移酶。6.根据权利要求5所述的重组双价表达载体的用途，是培育耐受草甘膦的转基因植物。7.—种耐受草甘膦转基因植物的培育方法，是利用权利要求1所述的重组双价表达载体，将G2-arW基因和卵t基因转化至受体植物。8.根据权利要求7所述的耐受草甘膦转基因植物的培育方法，所述受体植物既包括完整植株，也包括植物种子、植物体的器官、组织和细胞，还包括双价转基因植物的后代，以及由被转化的细胞或愈伤组织再生的植物。9.根据权利要求7或8所述的耐受草甘膦转基因植物的培育方法，所述受体植物为烟草。全文摘要本发明涉及一种培育高抗草甘膦转基因植物的双价植物表达载体。本发明构建了同时含有抗草甘膦的EPSPS基因(G2-aroA)和N-乙酰转移酶基因(gat)的双价植物表达载体，用该载体转化的植物比含单个基因的转基因植物具有更优的抗草甘膦能力。用本发明的方法可培育多种高抗草甘膦的转基因植物。文档编号C12N15/54GK101100676SQ200710118968公开日2008年1月9日申请日期2007年6月15日优先权日2007年6月15日发明者敏林,王旭静,顿宝庆申请人:中国农业科学院生物技术研究所