一种检测食源性病毒的基因芯片及试剂盒的制作方法

专利名称：：一种检测食源性病毒的基因芯片及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测食源性病毒的基因芯片及试剂盒，属于检验检疫
技术领域：
。技术背景食品安全问题一直是国际社会和各国政府关注的热点问题，据估计美国每年由于食物中毒导致76，000，000人发病，5000人死亡。目前已知有200种以上的疾病可通过食物传播，并且有一半以上的食物中毒案例没有找到病因，表明引起食物中毒的病因大大超过200种。在食品微生物中毒因素中，一直以来由于检测手段的限制，通常只检测细菌指标，而不能对食品中的病毒污染进行有效的监控和中毒分析，据美国FDA估计，由病毒引起的食物中毒每年导致近10，000，000个病例，128人死亡；2006年日本发生诺瓦克病毒流行，导致300多万人发病。今年以来，我国的广东、北京、香港等地相继出现诺瓦克病毒中毒事件，引起社会和我国政府的高度关注和重视。除了诺瓦克病毒外，食物源性病毒还包括甲肝病毒、轮状病毒、肠道病毒和星状病毒，主要存在于贝类等水产品和通过水源污染的食品中。据报道香港进口的贝类产品中约10%含有诺瓦克病毒，美国已多次从我国进口的水产品中检出甲肝病毒(HAV)和诺瓦克病毒(Norovimses)，严重影响我国食品的正常出口，同时表明我国食品存在病毒污染问题。可以说，食源性病毒污染是一个世界性问题。由于食源性病毒的体外培养和分离非常困难，如食品中毒中最为常见和重要的诺瓦克病毒和甲肝病毒中，只有甲肝病毒能在寄主细胞内繁殖，利用寄主细胞进行复制，但由于甲肝病毒在细胞中生长缓慢，需要培养3-4代才有可能出现可见病变，并且食品中往往病毒含量很低，因此，用培养法往往需要30-60天才能分离出甲肝病毒，不适合用于食品中甲肝病毒的检测。诺瓦克病毒更不能在体外繁殖，也无动物模型，不能用组织培养法或动物实验进行分离检测，同时其感染剂量非常低，估计为10、1(^感染单位，常规的电子显微镜法的检出限量为105-106病毒颗粒/1111，其灵敏度不能满足确保食品安全的要求。最近基于ELISA技术的放射免疫法(EIA)已经用于诺瓦克病毒的临床诊断，但由于检测限量的限制不适合于食品中病毒的检测。因此，建立快速、有效、可靠的食品中病毒检测方法非常必要。
发明内容本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、经济实用的检测食源性病毒的基因芯片。本发明的另一个目的是提供一种检测通量大、灵敏度高、检测时间短、便于使用的检测食源性病毒的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案-一种检测食源性病毒的基因芯片，在固相载体表面固定有若干检测探针和质控对照探针，检测探针由检测甲肝病毒、星状病毒、诺瓦克病毒G1型、诺瓦克病毒G2型、轮状病毒、脊灰病毒1型、脊灰病毒2型和脊灰病毒3型的探针组成；质控对照由点样阳性质控探针、芯片杂交阳性质控探针和芯片阴性质控探针组成。所述检测探针具有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.11所示的核苷酸序列，5'AminolinkerC6修饰。所述点样阳性质控探针具有序列表SEQIDNo.12所示的核苷酸序列，5'端进行HEX修饰。所述芯片杂交阳性质控探针具有序列表SEQIDNo.13所示的核苷酸序列，5'AminolinkerC6修饰。所述芯片阴性质控探针为1X点样液。这里我们的定义固定在基质载体上的DNA被称为探针(probe),而来自生物样品的核酸被称为耙标(target)。探针的设计原理是:病毒基因组一般都有高保守而且种特异的区域，比如衣壳蛋白等。可以针对这些区域设计特异探针，达到检测病毒所属种的目的。根据基因型和血清型的已知对应关系，可通过判读探针对应的基因型来进一步确定此病毒的血清型。本发明从从NCBI的Taxonomybrowser中下载5种指定病毒的所有序列(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.htm1/)J吏用的数据截至2005-10-14。1.Astrovirus星状病毒TaxonomyID:12702;Rank:species;共368条。从其中10条全长序列的比对结果看，病毒在ORF2区域序列的保守性不好，而ORFl区域的保守性远高于ORF2，适合用来设计此病毒的探针。ORF2区域更适合用来区分此病毒的不同血清型。星状病毒的序列中与0RF1相关的序列有68条，这些序列大致定位于ORF1区域上6个独立的序列片段。针对其中序列保守性较好的一个区域设计了一对引物，进而针对PCR产物的同一个位置设计了4条探针，分别针对不同的序列亚型。2.rotavirus轮状病毒:TaxonomyID:10941/10942/10943;分别是1741,42,89;还有3条HumanrotavirusADRV-N的，共1875条。未见报道能同时扩增三组rotavirus的通用引物，经过分析，认为很难找到rotavirus的A，B，C各组的共有探针，只能按三个种来做，根据发病率，先考虑A组。3.Poliovirus脊髓灰质炎病毒TaxonomyID:138953;共1784条。在结构蛋白VP1设计引物和探针。引物序列系文献报道，经检验，认为符合种特异型引物的要求。然后在此引物扩增区设计出一条探针。4.HumanhepatitisAvirus甲肝病毒TaxonomyID:208726;共76条。序歹U库其中注释为"5'non-codingregion"的序列普遍在100bp左右，不便于设计，所以使用注释为"polyprotein"的长度约为1700bp的18条序列进行引物、探针设计。5.Norovirus诺瓦克病毒Norovirusgenogroup1，TaxonomyID:122928;共76条；Norovirusgenogroup2，TaxonomyID:122929;共357条。根据InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses网站上的病毒分类，下载了NCBI上的Norwalkvirus种下面的Hawaiicalicivirus、Norovirusgenogroup1、Norovirusgenogroup2的全部序歹(J，同时也根据ICTV网站的注释下载了Mexicovirus的序列U22498。在设计探针的时候基于上面的序列进行。引物系文献报道，然后直接针对genogroup1和genogroup2分别设计了特异探针，其中针对genogroup2设计的探针也能与Hawaiicalicivirus、Mexicovirus杂交。委托英骏生物技术有限公司合成探针。要在醛基化表面固定的DNA分子必须具有一个伯胺基。5'-氨基，又称为连接氨基，具有通过6-12个碳原子间隔臂连接在5'核苷酸的磷酸基团上的一个伯胺基。而为了使探针分子在芯片上伸展开来，利于靶标探针的杂交，故合成时在每个探针的5'加上了一个氨基和15个T。合成好的探针先溶解在双蒸水中，终浓度为40pM，然后加入到晶芯^基因芯片点样液(博奥生物，产品目录号440010)中。使用方法1.配制寡聚核苷酸水溶液G060^M);2.转5nl上述核酸溶液到384孔板或96孔板中，加入5pl2X基因芯片点样液，并用移液器充分混合后，即可用于基因芯片点样；3.带DNA样品的点样板使用完毕可置于-2(TC保存。合成的寡聚核苷酸探针使用5'连接氨基直接连接在醛基化载体表面上。键合发生于连接氨基上的非键电子对亲核进攻醛基基团上电正性的碳原子时。随后的脱水步骤在多数芯片点样过程(如，湿度<40%时)均会发生，使得在氨基化DNA分子和芯片表面间形成共价键连接。所述固相载体(用于固定DNA探针的基质载体)选自尼龙膜、纤维素膜、玻片、金属片、硅片、陶瓷片或有机高分子制作的薄膜，优选玻片。玻片的优点在于来源方便；其表面经过化学处理后，能够共价结合DNA;玻片能耐受高温、高离子溶液环境；玻片表面光滑，对液体来说是非浸透性的，故杂交体系的体积可以很小，有利于探针和耙标的结合；玻片的背景荧光低，不会给检测带来较大的噪音。所述固相载体表面进行了醛基修饰。玻片表面要经过化学修饰后，才能牢固地固定DNA。现有的玻片表面化学修饰主要有氨基修饰、醛基修饰和巯基修饰。在与PCR产物、cDNA和蛋白质等较大分子的实验中，使用氨基化表面问题不大。而与寡聚核苷酸(5-10个核苷)或多肽(5-20个氨基酸)的实验中，非特异的吸附会带来空间排列上的缺陷。因为目标分子是吸附在表面上，整个分子长度的非特异吸附会阻碍其与耙标分子进行有效的相互作用，因此我们此次选用的是醛基修饰的基片。是醛基修饰的一般过程是将硅羟基化的玻片用3-氨丙基三乙氧基硅烷处理，使玻片表面带上一层末端氨基，然后用戊二醛处理，戊二醛分子两端的醛基可以和玻片表面的氨基形成希夫碱，将它们以长链碳桥的形式连接起来。再用NaBH4或NaCNBH3还原希夫碱形成稳定的双键。选择光学载玻片(玻片)作为醛基基片制备的原材料，尺寸为75.5mmx25.2mmx1.0mm。根据大批量的玻片测定结果和点样仪对点样基片的要求，要求长宽尺寸误差S±0.2mm，厚度误差S士0.05mm。同时要求外观无划痕、无缺损。亲疏水性能力、荧光背景能力及固定能力检测项目均合格的基片为合格基片。探针和对照样品以点阵(微阵列)的形式分布在芯片上。每个芯片上有四个点阵(图1)。因此一个芯片可以同时检测四份样品。四个点阵的设计完全相同。各有五种病毒的探针，同时设置核酸固定阳性对照、实验阳性和阴性对照。各点阵上探针的分布如图2。表1探针名称、序列及縮写对应表探针名称符号縮写序列点样阳性质控探针QC(Hex)GTCACATGCGATGGATCGAGCTCCTTTATCATCGTTCCCACCTTAATGCASEQIDNo.12芯片杂交阳性质控探针PCCTCATGCCCATGCCGATGCSEQIDNo.13芯片阴性质控探针NCix点样液—甲肝病毒HAVCATTGGAACAGGAACTTCAGCGSEQIDNo.1星状病毒HasV-lGAGATCCGTGATGTTAATGGSEQIDNo.2星状病毒HasV-2GAGATCCGTGATGCTAATGGSEQIDNo.3星状病毒HasV-3GAGATACGTGATGCTAATGGSEQIDNo.4诺瓦克病毒Gl型NV陽G1GTAAATGATGATGGCGTCTAASEQIDNo.5诺瓦克病毒G2型NV-G2AGGGCGATCGCAATCTGGCTSEQIDNo.6轮状病毒RotGTGGTATATTCAATACCATACSEQIDNo.7脊灰病毒1型Poli-lCCGCGCGAAGAAAGACTCTSEQIDNo.8脊灰病毒2型Poli-2-lAGTAATCCCTTCAACGGCCSEQIDNo.9脊灰病毒2型Poli-2-2CTGCTGGCGCGCTTTGTSEQIDNo.10脊灰病毒3型Poli-3GTTGCTTCGGGAGTGACAAAGSEQIDNo.11Hex的作用是确认核酸固定过程无误；阴性对照和阳性对照的作用是确认反应条件正常，以保证结果的有效性。正常情况下阳性对照的样点有荧光信号，阴性对照则没有。芯片的点样是由博奥生物有限公司生产的晶芯⑧SmartArrayerTM48微阵列芯片点样系统完成的。制备完成后的芯片经晶芯⑧LuxScan10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Powe产卯/900的扫描参数下扫描，在同一张芯片内，同一根针点样，点直径偏差小于20%。点阵整齐，无明显连点现象，即证明芯片是合格的。所述探针点样浓度为20uM,每条探针横向重复5点，点直径约150pm，点间距300^。所述芯片每张具有4个相同矩阵，探针排布方式为每个矩阵9行10列。所述芯片片基(固相载体)、围栏和盖片购于北京博奥生物芯片有限责任公司。基因芯片试剂盒的使用流程为样本总RNA的提取卡RT-PCR卡病毒特异性片段扩增卡标记扩增+杂交卡清洗芯片+扫描卡结果判读。一种检测食源性病毒的基因芯片试剂盒，由以下组分组成(1)反转录l-6:64^1，-20匸保存;(2)反转录Buffer:130^1，-20匸保存；(3)RNA酶抑制剂18nl，-20°<:保存；(4)反转录酶18|al，-20^保存；(5)PCRMixl-6:110^1，-2(rC避光保存;(6)Taq5U/jul，5pl，.2(TC保存；(7)2xPCR载样液50|^1，2-8。C保存；(8)DNAMarker:20pl，2-8。C保存；(9)杂交液150^，2-8t:避光保存；(10)20xSSC:100ml，室温保存；(11)腦SDS:20ml，室温保存；(12)检测芯片4片，2-8。C保存；(13)芯片盖片4片，2-8。C保存；(14)GV电泳染色液10)^1，2-8'C保存；(15)去核酸酶灭菌水1.5ml，-20匸保存。本发明的优点和创新之处在于(l)高通量整合了食源性病毒检验检疫领域最常见的5种病毒，实现了同时检测，实用性强；(2)快速检测时间仅为4小时；(3)特异对探针序列进行了严格筛选，使芯片上所有探针仅与其相对应的某一种病毒的核酸扩增产物反应，有效避免了交叉反应导致的假阳性问题；(4)灵敏芯片的检测灵敏度为108病毒颗粒/g组织样品(大约相当于lng病毒核酸/g组织样品)，比RT-PCR灵敏度高至少12个数量级；(5)重复性好，结果稳定可靠经过重复性和稳定性实验证明该检测系统可以保证检测结果的重现性和精确性，可广泛应用于出入境检验检疫系统的食品安全监察。下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为芯片点样区域的矩阵位置图。图2为商品化的食源性病毒基因芯片探针排列。图3-l为甲肝疫苗理论杂交图，图3-2为甲肝疫苗实际扫描图。图4-1为星状病毒粪便标本理论杂交图，图4-2为星状病毒粪便标本实际扫描图。图5-1为诺瓦克病毒粪便标本理论杂交图，图5-2为诺瓦克病毒粪便标本实际扫描图。图6-1为轮状病毒粪便标本理论杂交图，图6-2为轮状病毒粪便标本实际扫描图。图7-1为脊灰病毒粪便标本理论杂交图，图7-2为脊灰病毒粪便标本实际扫描图。图8为轮状病毒PCR检测结果。图9-1至图9-5为芯片检测轮状病毒PCR产物。图10-1至图10-4为芯片稳定性试验结果。具体实施方式实施例l:制备基因芯片一.材料和方法1.材料委托英骏生物技术有限公司合成探针，而为了使探针分子在芯片上伸展开来，利于靶标探针的杂交，故合成时在每个探针的5'加上了一个氨基和15个T。片基醛基化玻璃片基，北京博奥生物芯片有限责任公司。晶芯SrnartA^raye^TM48微阵列芯片点样系统，博奥生物有限公司。二.方法1.探针的设计与合成收集GenBank公布的待检病毒基因，经过同源性比对找出保守区段，再以比较严格且均一的条件(Tm值、GC含量、二级结构等)计算出符合这些种病毒保守区段的探针，并在5'端以氨基修饰，见表1。检测探针具有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.11所示的核苷酸序列，5'AminolinkerC6修饰。点样阳性质控探针具有序列表SEQIDNo.12所示的核苷酸序列，5，端进行HEX修饰。芯片杂交阳性质控探针具有序列表SEQIDNo.13所示的核苷酸序列，5'AminolinkerC6修饰。2.芯片的制备探针用点样缓冲液溶解，所述探针点样浓度为20uM，每条探针横向重复5点，点直径约150pm，点间距30(^ni，点样均匀度的标准方差约为15%。探针排布一张芯片上4个相同矩阵，矩阵位置如图l所示。芯片每个矩阵9行10列，探针排列如图2所示。点样后洗片点样后洗液中搅拌清洗2rain;点样后封闭液中搅拌封闭5min;去离子水中搅拌清洗2min，重复三次，2000rpm离心lmin。利用芯片装配工具将四区域芯片围栏贴于芯片表面，置于暗盒室温保存。实施例2:检测方法一.材料1.甲肝病毒阳性样本和脊髓灰质炎病毒阳性样本来源于市售疫苗。2.诺瓦克II型、星状病毒和轮状病毒样本来源于北京儿童医院，分离自16份婴幼儿的粪便标本。二.方法1.用常规方法(TRIzol法)提取待测样本的总RNA。2.RNA的RT-PCR(1)引物序列见表2。表2:引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>甲型肝炎病毒HAV-FTGTGCTATGGTTCCTGGTGA510甲型肝炎病毒HAV-RCCCAATCGAATCTGAAGCAT星状病毒HAsV-FCATTGTTTGTTGTCATACTAAC286星状病毒HAsV-RACATGTGCTGCTGTTACTAT诺瓦克病毒I型GI-SKFCTGCCCGAATTYGTAAATG330诺瓦克病毒I型GI-SKRCCAACCCARCCATTRTACA诺瓦克病毒II型COG2FCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG387诺瓦克病毒II型GIISKRCCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT轮状病毒RotavirusA_Primer—FGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG392轮状病毒RotavirusA_Primer—RGATCCTGTTGGCCATCC脊灰病毒Poliovirus—Primer1—FTTTGTGTCAGCGTGTAATGA480脊灰病毒PoliovirusPrimer1RGAATTCCATGTCAAATCTAGA(2)反转录，反应体系及条件表3:反转录反应体系_反应液组成_体积基因特异引物(5mM)lul随机引物2uldNTPMixU0mM)1ul样品总RNA(lng至5ug)6iU混匀，65'C加热变性5分钟，冰浴5分钟10XFirst-StrandBuffer21MgCL2(25mM)4ulDTT(0.1M)2ulRNAout1u1混匀，25。C加热2minSuperscriptII反转录酶1lU混匀，25。C10min,42。C60tnin，70°C15min，4°C保温3.PCR扩增根据病毒序列设计特异引物，以反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增，体系如表4所示，条件如表5所示。表4:PCR反应体系反应成分体积<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表5:PCR扩增程序<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.凝胶电泳检测取23plPCR产物，1.5%琼脂糖电泳检测扩增情况，如果目的片断明显，则可以用于芯片杂交。5.杂交反应杂交反应的基本流程是芯片固定一芯片杂交一芯片清洗。其中芯片清洗是用不同离子强度的溶液依次漂洗芯片，以除去游离的及非特异性结合的样品。(1)芯片固定去掉杂交围栏上的胶纸；胶面朝上，将杂交围栏上放在杂交模具中心的同样形状的凹槽中，注意要使杂交围栏与凹槽契合；用手捏着芯片上贴有标签纸的一端，将芯片另一端顶着模具的顶端，然后将芯片正面(贴有标签纸)朝下放入模具；在芯片背面相应位置用镊子轻轻向下按，使杂交围栏紧贴在芯片上。杂交围栏的作用是隔开不同的杂交样品，防止交叉污染。贴好杂交围栏以后，往杂交盒底部的水槽中均匀加入少量蒸馏水(约200tU)，以防止杂交过程中杂交液大量挥发，并且能形成一定厚度的液膜；然后把芯片正面(有杂交围栏的一面)朝上放入杂交盒中；按芯片摆放方向盖上盖片，注意使盖片上的凸面朝下，使盖片上的四个突起正好覆盖四个点阵，形成四个微量的杂交室。将杂交盒的盖板扣上，确保槽板两端的定位销分别插入盖板两端的定位销孔中。扣上盖板后，分别将两个金属夹卡进两侧，注意动作要平缓，不要让杂交盒有大的震动，以防止杂交液溅出点阵区域；另外，金属夹需要完全卡进，以确保杂交盒的密封性。(2)芯片杂交杂交体系(每个点阵12nl)见表6。一张芯片共4个点阵，可以杂交四份样本。表6:杂交反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>将以上四份12pl杂交液用移液器混匀后3000rpm离心30s，95°C热变性3分钟(在PCR仪中)。冰浴骤冷lmin。用移液器将四份杂交液分别注入盖片上的四个小孔；确认杂交液覆盖芯片上的四个点阵以后，盖紧杂交盒盖，放入42。C恒温水浴锅中，杂交2小时，使样品与探针充分反应。(3)芯片清洗洗液I2xSSC，0.2%SDS;洗液II0.2xSSC(洗去残留的SDS);将洗液I、II预热至42。C。杂交结束后，快速将芯片从杂交盒中拿出(盖片可以重复利用)，将芯片转移到盛放洗液I的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗4min，以洗去没有与探针特异性结合的样品。在洗液I中清洗结束后，迅速用镊子将芯片转移到盛放洗液II的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗4min。芯片清洗后，放在50ml锥形离心管中(标签纸端朝下)，1500rpm离心l分钟，除去玻片表面的液体，此时的芯片可以进行扫描。6.芯片的扫描芯片扫描采用晶芯⑧LuxScanTMIOK扫描仪。实施例3:芯片检测特异性验证一.甲肝病毒阳性样品体方法参见实施例2。2.反转录，反应体系及条件同表3:HAV-R(5mM)序列为CCCAATCGAATCTGAAGCATSEQIDNo.143.PCR扩增以cDNA为模板进行PCR扩增，体系同表4，条件如表5:HAV-F(未标记5uM)序列为TGTGCTATGGTTCCTGGTGASEQIDNo.15HAV-R(荧光标记40uM)序列为CCCAATCGAATCTGAAGCATSEQIDNo.144.琼脂糖凝胶电泳，检测有明显条带，即证明有扩增；5.杂交反应，参见实施例2。6.芯片清洗，参见实施例2。7.芯片扫描结果见图3—1和3—2，甲肝疫苗实际实验结果与预期相吻合。二.星状病毒粪便标本1.提取病毒总RNA，具体方法参见实施例2。2.反转录，反应体系及条件同表3:HAsV-R(5mM)序列为ACATGTGCTGCTGTTACTATSEQIDNo.163.PCR扩增以cDNA为模板进行PCR扩增，体系同表4，条件如表5:HAsV-F(未标记5uM)序列为CATTGTTTGTTGTCATACTAACSEQIDNo.17HAsV-R(荧光标记40uM)序列为ACATGTGCTGCTGTTACTATSEQIDNo.164.琼脂糖凝胶电泳，检测有明显条带，即证明有扩增；5.杂交反应，参见实施例2。6.芯片清洗，参见实施例2。7.芯片扫描结果见图4一1和4一2，星状病毒标本实际实验结果与预期相吻合。三.诺瓦克病毒粪便标本1.提取病毒总RNA，具体方法参见实施例2。2.反转录，反应体系及条件同表3:GI-SKR(未标记5uM)序列为CCAACCCARCCATTRTACASEQIDNo.18GII-SKR(未标记5uM)序列为CCRCCNGCATRHCCRTTRTACATSEQIDNo.193.PCR扩增以cDNA为模板进行PCR扩增，体系同表4，条件如表5:GI-SKF(未标记5uM)序列为CTGCCCGAATTYGTAAATGASEQIDNo.20GI-SKR(荧光标记40uM)序列为CCAACCCARCCATTRTACASEQIDNo.18COG2F(未标记5uM)序列为CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAGSEQIDNo.21GII-SKR(荧光标记40uM)序列为CCRCCNGCATRHCCRTTRTACATSEQIDNo.194.琼脂糖凝胶电泳，检测有明显条带，即证明有扩增；5.杂交反应，参见实施例2。6.芯片清洗，参见实施例2。7.芯片扫描结果见图5—1和5—2，诺瓦克病毒标本实际实验结果与预期相吻合。四.轮状病毒粪便标本1.提取病毒总RNA，具体方法参见实施例2。2.反转录，反应体系及条件同表3:RotavirusA—Primer—R(5mM)序歹U为GATCCTGTTGGCCATCCSEQIDNo.223.PCR扩增以cDNA为模板进行PCR扩增，体系同表4，条件如表5:RotavirusA一Primer—R(未标记5uM)序列为GATCCTGTTGGCCATCCSEQIDNo.22RotavirusA一Primer—F(荧光丰示记40uM)序歹lj为GCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGGSEQIDNo.234.琼脂糖凝胶电泳，检测有明显条带，即证明有扩增；5.杂交反应，参见实施例2。6.芯片清洗，参见实施例2。7.芯片扫描结果见图6—1和6—2，轮状病毒标本实际实验结果与预期相吻合。五.脊灰病毒疫苗1.提取病毒总RNA，具体方法参见实施例2。2.反转录，反应体系及条件同表3:Poliovirus—Primer1—R(5mM)序列为GAATTCCATGTCAAATCTAGASEQIDNo.243.PCR扩增以cDNA为模板进行PCR扩增，体系同表4，条件如表5:Poliovirus—Primerl—R(未标记5uM)序列为GAATTCCATGTCAAATCTAGASEQIDNo.24Poliovirus—Primer1_F(荧光标记40uM)序列为TTTGTGTCAGCGTGTAATGASEQIDNo.254.琼脂糖凝胶电泳，检测有明显条带，即证明有扩增；5.杂交反应，参见实施例2。6.芯片清洗，参见实施例2。7.芯片扫描结果见图7—1和7—2，脊灰病毒标本实际实验结果与预期相吻合。实施例4:芯片检测灵敏度试验为了检测芯片检测方法的灵敏度，我们用轮状病毒的CDNA为实验对象，将轮状病毒的cDNA进行梯度稀释，以稀释后的cDNA为模板进行RT-PCR，琼脂糖凝胶电泳检测、芯片检测以及荧光定量PCR检测，比较三种检测方法的灵敏度。1.电泳检测轮状病毒将以轮状病毒标准基因组RNA反转录得到的cDNA进行IOM咅、102倍、103倍的稀释，以稀释后的cDNA为模板进行PCR扩增，电泳检测扩增结果，同时和原cDNA的扩增结果进行比较。电泳结果如图8所示。从电泳检测结果可以看出，当以轮状病毒标准基因组RNA反转录得到的cDNA进行102倍稀释后的RT-PCR基本无扩增产物。2.芯片检测轮状病毒将RT-PCR扩增得到的产物进行杂交检测，结果如图9一1至9—5所示。可以看出，当把cDNA进行10M咅稀释后进行PCR扩增，其扩增产物杂交为阳性，而当把cDNA进行l(^倍稀释后进行PCR扩增，其扩增产物杂交则无杂交信号。3.总结通过以上两种病毒PCR产物的不同检测方法表明，芯片检测的灵敏度基本和凝胶电泳检测相同或略高于凝胶电泳检测。实施例5:芯片的稳定性试验为了考察芯片在探针点制完成后正常保存条件(4'C)下的保存期限，我们制备了一批芯片，将其放在37'C温箱中加速保存(此条件下保存3天相当于在4'C条件下保存6个月)。同时，制备出足够数量的甲肝病毒RT-PCR产物，分不同时间进行杂交检测，结果如图10—1至图10—4所示。保存实验杂交结果表明，在正常保存条件下，芯片的稳定性很好，其保质期大于l年。实施例6:—种食源性病毒高通量检测试剂盒针对食品中的致病性病毒开发出了一种高通量检测试剂盒，可同时检测样品中含有的甲肝病毒、星状病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒和脊灰病毒。该产品将生物芯片技术、全基因组测序技术、生物信息学、核酸提取和聚合酶链式反应(PCR)技术有机结合在一起，具有检测通量大、灵敏度高、检测时间短等特点。1.试剂盒组成和保存条件表7:试剂盒组成和保存条件<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注DNA分子量Marker:每次PCR产物电泳检测时，取4(il加入一单独的凝胶孔中，作为判读PCR产物扩增条带大小的标准，此Marker的标准电泳条带为(从上至下):2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。表8:PCRMix<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表9:反转录Buffer<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2.使用方法-(1)反转录合成cDNA第一链注检测不同的目标病毒时，使用不同的反转录Mix，具体如表10:表10:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(2)PCR扩增病毒检测基因注检测不同的目标病毒时，使用不同的PCRMix，具体如表ll:表ll:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注PCR反应体系中cDNA的量视不同检测样品的污染程度而异，具体应用时需根据具体情况确定最佳的需要量，通常10-100ng的cDNA均可很好的扩增。(3)扩增结果检测配制1.5%的琼脂糖凝胶，每80ml凝胶中加入2HlGV电泳染色液，凝固备用；反应结束后取3plPCR产物加入3nl2XPCR载样液，电泳检测扩增结果；*甲肝病毒的阳性扩增结果应至少具有一条约510bp的扩增条带；*星状病毒的阳性扩增结果应至少具有一条约286bp的扩增条带；*诺瓦克病毒的阳性扩增结果应至少具有一条约387bp的扩增条带；*轮状病毒的阳性扩增结果应至少具有一条约392bp的扩增条带；*脊灰病毒的阳性扩增结果应至少具有一条约480bp的扩增条带；对具有阳性扩增的样品进行芯片杂交检测，无阳性扩增的样品暂不进行芯片杂交，建议重新进行PCR扩增反应，或重新合成cDNA第一链后再进行PCR扩增反应；杂交及结果判读。(4)杂交及洗片将杂交液在42'C溶化，取杂交液7pl，加入PCR扩增产物5|al，于95'C变性5分钟，冰浴5分钟备用。将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒的两边凹槽内加入约80pl灭菌水，将芯片放入杂交盒内，芯片标签正面朝上；揭掉芯片盖片的塑料薄膜，放在芯片的黑色围栏上，注意有凸块的一面对着芯片；然后从盖玻片的小孔缓慢注入12W变性后的杂交液后，杂交液会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凸面和芯片之间形成一道液膜。注意不要震动盖玻片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖。放入42'C恒温水浴中，静置，杂交2小时。杂交后，取出芯片放在预先42。C预热好的洗液I(2XSSC，0.2%SDS)中，42。C震荡清洗4分钟，再用42r预热好的洗液I1(0.2XSSC)，42r震荡清洗4分钟，最后用42。C预热好清水清洗一次，清洗后的芯片1500rpm离心1分钟以去除芯片表面的液体，此芯片可避光保存，在l小时内进行扫描。(5)芯片扫描及结果判读洗净的芯片使用晶芯⑧LuxScan10K微阵列芯片扫描仪在晶芯^食源性病毒检测系统下进行扫描分析，该系统软件会自动对扫描结果进行判读分析，给出检测结果，用户可对结果进行存储、打印和査询。序列表<110>中华人民共和国北京出入境检验检疫局博奥生物有限公司<120>—种检测食源性病毒的基因芯片及试剂盒<130><160>25<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>1cattggaacaggaacttcagcg22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2gagatccgtgatgttaatgg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3gagatccgtgatgctaatgg<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4gagatacgtgatgctaatgg<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>5gtaaatgatgatggcgtctaa<210>6<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>6agggcgatcgcaatctggct<210>7<211>21<212>DNA说明书第18/24页202021gtggtatattcaataccatac<210>8<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>8ccgcgcgaagaaagactct<210>9<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>9agtaatcccttcaacggcc<210>10<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>10ctgctggcgcgctttgt<210>11说明书第19/24页<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>11gttgcttcgggagtgacaaag21<210>12<211>50<212>DNA<213>人工合成<400>12gtcacatgcgatggatcgagctcctttatcatcgttcccaccttaatgca50<210>13<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>13ctcatgcccatgccgatgc19<210>14<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>14cccaatcgaatctgaagcat20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>15tgtgctatggttcctggtga<210>16<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>16acatgtgctgctgttactat<210>17<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>17cattgtttgttgtcatactaac<210>18<211>19<212>DNA<213>人工合成说明书第21/24页202022<400>18ccaacccarccattrtaca<210>19<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc一feature<222>(6)..(6)<223>nisa，c，g,ort<400>19ccrccngcatrhccrttrtacat<210>20<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>20ctgcccgaattygtaaatga<210>21<211>26<212>DNA<213>人工合成<220><221>miscfeature<222>(9)..(9)<223>nisa,c,g，ort<400>cargarbcnatgttyagrtggatgag<210>22<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>22gatcctgttggccatcc17<210>23<211>28<212>DNA<213>人工合成<400>23ggctttaaaagagagaatttccgtctgg28<210>24<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>24gaattccatgtcaaatctaga21<210>25<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>25tttgtgtcagcgtgtaatga20权利要求1.一种检测食源性病毒的基因芯片，在固相载体表面固定有若干检测探针和质控对照探针，其特征在于检测探针由检测甲肝病毒、星状病毒、诺瓦克病毒G1型、诺瓦克病毒G2型、轮状病毒、脊灰病毒1型、脊灰病毒2型和脊灰病毒3型的探针组成；质控对照由点样阳性质控探针、芯片杂交阳性质控探针和芯片阴性质控探针组成。2.根据权利要求1所述的检测食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述检测探针具有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.11所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的检测食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述点样阳性质控探针具有序列表SEQIDNo.12所示的核苷酸序列，5'端进行HEX修饰。4.根据权利要求1所述的检测食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述芯片杂交阳性质控探针具有序列表SEQIDNo.13所示的核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的检测食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述芯片阴性质控探针为1X点样液。6.根据权利要求1至5中任何一项所述的检测食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述固相载体选自尼龙膜、纤维素膜、玻片、金属片、硅片、陶瓷片或有机高分子制作的薄膜。7.根据权利要求6所述的检测食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述固相载体表面进行了醛基修饰。8.根据权利要求1至5中任何一项所述的检测食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述探针点样浓度为20uM，每条探针横向重复5点，点直径约150nm，点间距300pm。9.根据权利要求1至5中任何一项所述的检测食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述芯片每张具有4个相同矩阵，探针排布方式为每个矩阵9行10列。10.—种检测食源性病毒的基因芯片试剂盒，由以下组分组成(1)转录1-6:64|al，-20°<:保存；(2)反转录Buffer:130)il，-20°<:保存;(3)RNA酶抑制剂18|al，-20!]保存；(4)反转录酶18nl，-20匸保存；(5)PCRMixl-6:110pl，.20。C避光保存；(6)Taq:5U/pl，5|il，-20"保存；(7)2xPCR载样液50pl，2-8。C保存；(8)DNAMarker:20pl，2-8。C保存；(9)杂交液150ial，2-8'C避光保存；(10)20xSSC:100ml，室温保存；(11)10%SDS:20ml，室温保存；(12)检测芯片4片，2-8。C保存；(13)芯片盖片4片，2-8。C保存；(14)GV电泳染色液lO(il，2-8。C保存；(15)去核酸酶灭菌水1.5ml，-20匸保存。全文摘要本发明涉及一种检测食源性病毒的基因芯片及试剂盒，属于检验检疫领域。本发明在固相载体表面固定有若干检测探针和质控对照探针，检测探针由检测甲肝病毒、星状病毒、诺瓦克病毒G1型、诺瓦克病毒G2型、轮状病毒、脊灰病毒1型、脊灰病毒2型和脊灰病毒3型的探针组成；质控对照由点样阳性质控探针、芯片杂交阳性质控探针和芯片阴性质控探针组成。本发明的优点在于(1)高通量整合了5种常见病毒，同时检测，实用性强；(2)快速检测时间仅为4小时；(3)特异避免了交叉反应导致的假阳性；(4)灵敏芯片的检测灵敏度为10⁸病毒颗粒/g组织样品，比RT-PCR灵敏度高；(5)重复性好，结果稳定，可广泛应用于检验检疫系统的食品安全监察。文档编号C12Q1/70GK101328505SQ200710119048公开日2008年12月24日申请日期2007年6月19日优先权日2007年6月19日发明者付溥博,亮张,捷张,昕张,张惠媛,静曾,琦汪,红绕,臧庆伟,陈广全,魏海燕申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局;博奥生物有限公司