专利名称：一种生产4,6-二氨基间苯二酚的方法及其专用工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产4， 6-二氨基间苯二酚的方法及其专用工程菌，特别涉及一 种微生物催化生产4， 6-二氨基间苯二酚的方法及其专用产羟氨苯歧位酶的工程菌。
背景技术：
聚对苯撑苯并噁唑纤维(Poly-p-phenylene-benzobisoxazole，简称PBO) ， PBO商 品名为柴隆(Zylon)，是20世纪80年代美国为发展航空航天事业而开发的复合材料 用增强材料，是含有杂环芳香族的聚酰胺家族中最有发展前途的一个成员，被誉为21 世纪超级纤维。聚对苯撑苯并双噁唑纤维现己正式上市，正在开发单纤维和复合材料 的用途。PBO纤维具有出色的力学性能和耐高温性能， 一问世即被视为航空航天及军 事等领域的新一代先进结构材料，迅速在美国和日本的航空航天工业，防火、防弹衣 等特殊纺织品工业及汽车工业的复合材料等领域中开始应用。用它制成的服装在火焰 中不燃烧、不收縮，仍非常柔软。利用受冲击时纤维可原纤化从而吸收大量的冲击能 之特性，发达国家开发了PBO纤维在防弹抗冲击吸能材料领域的用途。另外，利用该 纤维的特性还开发了在新型高速交通工具、宇宙空间器材、深层海洋开发及高级体育 运动竞技用品等领域的用途。
4， 6-二氨基间苯二酚(4， 6-diaminoresorcino1，縮写DAR)是合成高性能纤维PBO 的重要结构单元[Wolfe, J.F., Loo， B.H., Arnold, F.E. Rigid-rod polymers.2. Synthesis and thermal properties of para-aromatic polymers with 2,6-benzobisthiazole units in the main chain. Macromolecules. 1981. 14:915-920]，如图1所示。对苯二甲酸是和多磷酸 均是大规模工业化的产品，较易获得，因而DAR是目前合成PBO的关键中间体。 因此，合成PBO纤维，必须首先突破4， 6-二氨基间苯二酚(4, 6-diaminoresorcinol， 縮写DAR)新单体的合成技术。
至今，虽然高纯度的DAR合成工艺已相继开发成功，但其制造成本高，难以与 Kevlar材料的对苯二胺单体相竞争。因此只有找到一条高纯度、低成本的DAR合成 方法及工艺，才能促进PBO新材料的优异性能在人类物质生活中的普及和应用。DAR 除在PBO中的应用外，还广泛应用于PBZ族功能高分子材料的合成，还可作为医药、 农药及功能染料等精细化学品和电子化学品的中间体使用，已引起全世界有关方面的 高度重视。DAR除在PBO中的应用外，还广泛应用于聚苯并双噁唑、聚苯并双噻唑和聚苯 并双咪唑等功能高分子材料的合成，以及作为医药、农药及功能染料等精细化学品和 电子化学品的中间体使用，已引起全世界有关方面的高度重视。DAR的合成研究始 于20世纪80年代，主要以美国Dow化学公司和日本的Nissan化学工业公司为代表， 少数为德国的Chevoron研究公司和Bayer公司，以及日本的Asahi、 Sumitomo、 Daiwa Koisei、 Taoka、 DaiwaToyo Kaisei Kogyo禾口 Missui等化学公司的技术。
DAR的化学合成最初由美国陶氏化学公司开发成功，以三氯苯为起始原料进行 合成(如图2所示)，收率比较高，对PBO的工业化生产起了很大作用，但存在原料 不易获取、成本高的问题。目前世界上只有日本的以三氯苯为起始原料合成DAR的 生产工艺具有DAR的工业生产能力，但同样存在原料有限、价格高、硝化过程废酸 处理难、三废处理易产生剧毒物质等问题，目前日本许多大公司都在寻找取代其现行 工艺路线的工业化方法。国内有些科研院所采用间苯二酚的合成路线合成DAR (如 图3所示)，但收率低、成本高，且硝化过程同样存在大量的废液处理问题。
睾丸酮丛毛单胞菌(Comamoww CNB-1 ，该菌株已于2003年保存于中
国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册编号为CGMCC No.l028 [中国专利号2003101143377]。该菌株含有产羟氨苯歧位酶基因，产酶能力强， 酶活力98U'mg"Tiiin-1。
发明内容
针对上述4， 6-二氨基间苯二酚的化学合成法存在的诸多问题和不足之处，本发 明提供一种生产4， 6-二氨基间苯二酚(DAR)的方法及其专用工程菌。
本发明所提供的生产4，6-二氨基间苯二酚专用的可表达羟氨苯歧位酶的工程菌， 是将羟氨苯歧位酶基因通过原核表达载体转入大肠杆菌中，筛选获得的可表达羟氨苯 歧位酶的工程菌。
所述羟氨苯歧位酶基因的核苷酸序列是自GENBANK号为DQ207951的5'端的第 1802-2264位核苷酸序列。
所述羟氨苯歧位酶基因是以睾丸酮丛毛单胞菌(Comamomw CNB-1 CGMCC No. 1028的基因组DNA为模板，用核苷酸序列分别为序列表中序列1和序 列2的一对引物进行PCR扩增得到的。
所述原核表达载体为pET-21a(+)，所述大肠杆菌菌株为大肠杆菌BL21(DE3); 所述羟氨苯歧位酶基因优选为通过将所述PCR扩增得到的产物经过五coi I和州'^mi 双酶切处理后，插入到所述pET-21a(+)的五co7 I和/f/"dl1酶切位点之间得到的重组 表达载体转入所述大肠杆菌中的。
本发明所提供的生产4, 6-二氨基间苯二酚的方法，包括下述步骤
1) 将权利要求l一4中任意一项所述的工程菌进行发酵至对数期，然后诱导表达 培养得到含有羟氨苯歧位酶的工程菌；
2) 以2-氨基-4-羟氨酚为底物，用步骤1获得的含有羟氨苯歧位酶的工程菌进行 催化反应，得到4,6-二氨基间苯二酚。
所述步骤2)中，所述催化反应的温度为10-50°C，优选为37"。
所述步骤2)中，所述含有羟氨苯歧位酶的工程菌以完整细胞菌悬液或者固定化 细胞的形式进行催化反应；所述固定化细胞优选为固定化微球。
所述固定化微球的载体为海藻酸钙；所述固定化微球的直径为2-4mm;所述固 定化微球的制备方法是将所述工程菌培养至对数期(006()。 = 0.4~0.6)时，在，用IPTG 诱导表达培养12-24小时后，收集菌体，将菌体悬浮于质量百分含量为0.5-4%海藻酸 钠溶液后，将菌悬液滴入质量百分含量为2-6%的氯化钙溶液中成球，在o-4t:经固化 12-36小时后，用蒸馏水清洗，得到固定化工程菌。
所述步骤1)中，所述诱导表达的试剂为IPTG，所述诱导表达培养的温度为 15-25°C，优选为18'C，所述诱导表达培养的时间为12-36小时，优选为24小时；
所述发酵培养的温度为30-40°C，优选为37'C。
所述步骤2)中，还包括用2-氨基-4-硝基酚与锌反应得到2-氨基-4-羟氨酚。所 述2-氨基-4-硝基酚与锌反应的温度为30 — 80。C，优选为60°C。所述2-氨基-4-硝基酚 存在于含NH4C1的溶液中；所述溶液中，所述2-氨基-4-硝基酚的浓度为0.1 —1.0 g/L， NH4C1的浓度为0.5 — 5.0g/L;所述溶液优选为含1.0 g/L 2-氨基-4-硝基酚和1.39 g /L NH4C1的溶液。
所述方法中，还包括将反应产物进行分离纯化得到纯化的4， 6-二氨基间苯二酚 盐酸盐；所述分离纯化是将反应得到的溶液用络合萃取剂萃取，取有机相在经含有质 量百分含量为r^的氯化亚锡的3.5mol/L的盐酸溶液萃取，取底层无机相，用活性碳 脱色，结晶，重复脱色结晶直到得到无色透明晶体，即为纯化的4， 6-二氨基间苯二 酚盐酸盐；所述络合萃取剂为含有体积比为20: 30: 50的D2EHPA、正辛醇和煤油 的混合液；所述活性碳脱色的温度为55-8(TC。
本发明的合成DAR的方法，以廉价的2-氨基-4-硝基酚为原料，经锌还原成2-氨基 -4-羟氨酚，再通过发酵生产含有羟氨苯歧位酶的大肠杆菌基因工程菌，用完整细胞 悬液法或者固定化细胞法催化2- 2-氨基-4-羟氨酚合成4， 6-二氨基间苯二酚，其原理 如图4所示。本发明的方法是通过络合萃取工艺分离产物，重结晶纯化得到高纯度4， 6-二氨基间苯二酚盐酸盐，该4， 6-二氨基间苯二酚盐酸盐是4, 6-二氨基间苯二酚稳
定存在的形式，使用时可通过常规方法脱盐酸。 本发明与现有技术相比具有以下优点
现有技术用于催化合成4， 6-二氨基间苯二酚都是采用化学法合成，合成工艺复 杂、能耗大，产率低，且需要大量用到有机溶剂，三废问题严重。而本发明采用生物
催化法在温和条件下合成4， 6-二氨基间苯二酚，合成工艺过程不需要使用有机溶剂，
合成路线短，原料来源广，产率高且对环境污染小。
在本发明的发酵条件下能获得较高的生物量，单位体积发酵液的总酶活可高可达
9.8万U/毫升发酵液(注酶活单位定义，每分钟转化l微摩尔羟氨苯化合物所需的酶
图1为DAR盐酸盐与对苯二甲酸通过縮聚反应合成PBO的反应过程示意图 图2为以三氯苯为起始原料合成DAR的反应过程 图3为以间二硝基苯为起始原料合成DAR的反应过程 图4为以2-氨基-4-硝基酚为起始原料合成DAR的反应过程 图5为含羟氨苯歧位酶基因的工程菌(BLpETCN)的发酵过程的生长曲线 图6为含有羟氨苯歧位酶的工程菌(BLpETCN)生物催化生产DAR工艺示意图 图7为含有羟氨苯歧位酶的工程菌(BLpETCN)生物催化得到的DAR产物的红 外光谱图
图8为含有羟氨苯歧位酶的工程菌(BLpETCN)生物催化合成产物的核磁共振
谱图
具体实施例方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。 下述实施例中所述百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。 实施例1 、含有羟氨苯歧位酶的工程菌的制备 1、含有羟氨苯歧位酶基因的工程菌的构建
以睾丸酮丛毛单胞菌(Comamo朋s CNB-1 CGMCC No. 1028基因组
DNA为模板，设计 一 对引物正向HabPf: 5 ，-GTCCGAATTCAAGGAGA CCCCTTC4rGC-3，(序列表中序列l)(粗体为五coRI酶切位点；斜体为起始密码 子；下划线序列为核糖体结合位点)和反向引物HabPr: 5'-GTCAAAGCTTTGCGGGAA GTCrC4TGGT-3，(粗体为州'"dIII酶切位点；斜体 为终止密码子)，PCR扩增羟氨苯歧位酶基因。
扩增程序为94°C 4min， 94°C 1 min， 48°C 1 min， 72°C 1 min， 30循环，72°C 1 min;PCR反应体系94。C4min， 94°C 1 min， 50°C 1 min， 72°C 1 min， 30循环，72°C 1 min;
扩增体系为2nl模板(100ng) ; 2 pi Primer 1 (10 一) ; 2 pi Primer 2 (10pM); 12pldNTP (2.5 mM each) ; 10 (il 10xBuffer (含镁离子)；Taql.5pl (2.5U/pl) ; ddH20 补至100 nl。
扩增得到498bp的片段，经测序表明，该片段含有羟氨苯歧位酶基因全序列，具 有自GENBANK号为DQ207951的5'端的第1802-2264位核苷酸序列。
将纯化后的PCR产物经过fcoRI和历V7dl11双酶切处理，纯化后与fcoRI和 历/2dl1酶切处理过的表达载体pET-21a(+)(购自Novagen公司，USA) —起在16°C 连接过夜，电转化(2500V, 200Q)到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37"C培养 60min后涂布在氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上37。C培养16h，挑取阳性克隆培 养，提质粒进行测序验证后，将测序表明含有上述PCR产物羟氨苯歧位酶基因的重组 载体密码为pETCN，将含有该质粒的工程菌命名为BLpETCN， BLpETCN将保存于甘油 管中低温保藏。
2、含有羟氨苯歧位酶基因的工程菌(BLpETCN)的培养 (1)基因工程菌株在摇瓶中的培养
取工程菌BLpETCN在添加了 100吗/mL氨苄青霉素的LB培养基上划线纯化， 37°(3培养14-16小时。挑取单菌落接种至4 mL的LB液体培养基，加入氨苄青霉素 至终浓度为100 pg/mL， 37°C， 200 rpm培养10-12小时至00600在1.5至3.0之间。 取2 mL上述发酵液接种至2000 mL LB液体培养基，加入氨苄青霉素至终浓度为 100pg/mL， 37°C ， 200 rpm培养4-6小时至00600在0.3-0.5时，加入2 mL IPTG (1 M) 至培养液中浓度为lmM，将摇瓶转至18-2(TC摇床，120-180 rpm继续培养8-10小时， OD6oo达到1.4-1.8， 8000 rpm， 5-10 min离心收集菌体待用。
诱导表达羟氨苯歧位酶的工程菌菌体经超声波破壁后，12,000 rpm离心2 min。 取离心液上清经过His'Tag柱子(His'Bind Resin Chromatography，Novagen公司，USA) 时氨苯歧位酶被吸附，具体操作步骤按照产品手册进行。结果表明，上述发酵的 BLpETCN工程菌中，羟氨苯歧位酶表达量为1000mg/L发酵液，艮卩1(T"mg/cfu。
根据2-氨基-4-羟氨苯酚在羟氨苯歧位酶的催化作用下形成的产物为4, 6-二氨基 间苯二酚，其盐酸盐在235nm处有吸收峰，紫外分光光度计测定单位时间内235nm 处的光吸收值的增加量，计算4, 6-二氨基间苯二酚盐酸盐的产量(根据4， 6-二氨基 间苯二酚盐酸盐标准品(购自Aldrich)的吸光度值与浓度之间的关系， 10D235=0.3mM);根据酶活单位定义(每分钟转化1微摩尔羟氨苯化合物所需的酶 量)，测得羟氨苯歧位酶的比活。
反应体系包括0.3pmol的2-氨基-4-羟氨苯酚，50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0) lmL，上述发酵的含有0.3-0.9mg羟氨苯歧位酶的基因工程菌菌体，酶促反应总体积 为3mL， 37'C反应。准备10份反应体系，每隔1分钟取出一个样品，12,000 rpm离 心30sec，取上清在紫外下测定235nm处的吸光度值变化。每分钟的00235变化值为 0.088，根据10D235=0.3mM，则3mL反应体系的酶活力为 / 1 u M min—1= 0. 0792U
所用的基因工程菌菌体的羟氨苯歧位酶表达量为0.8mg，则羟氨苯歧位酶的比活 力为98U/mg，即在本发明的发酵条件下能获得较高的生物量，发酵液的酶活可达9.8 万U/升发酵液。
(2)基因工程菌株在发酵罐中的培养
1) 接种与活化将已构建好的基因工程菌在氨苄青霉素抗性(100 pg/mL)的 LB平板上划线，37"C培养，挑取单菌落接种于4ml氨苄青霉素抗性(100pg/mL) 的LB液体培养基，37'C摇床培养8h活化，再将培养液转接到150ml氨苄青霉素抗 性(100昭/mL)的LB， 37"C摇床过夜培养。
2) 扩大培养在空消(121°C， 30min)过的发酵罐中装入3L LB培养基，实消 灭菌(112°C， 30min)，接种前加入氨苄青霉素至终浓度为100 ng/mL，然后以培养 好的150ml菌液接种(5%接种量)，调整发酵罐运行参数为37°C，通气量3 L/min， 搅拌速度400rpm，其余参数自然，每隔15 30分钟取样，测浊度(OD6Q0)。
3) 诱导培养:当00600 = 0.4~0.6时，将温度调低至18。C，加入3mlIPTG(lM) 至培养液中浓度为1 mM，继续培养并定时取样测量0D6Q()以绘制生长曲线(如图5)。 低温诱导表达24小时，OD6oo达到1.9，收集菌体。
3、含有羟氨苯歧位酶基因的工程菌的固定化微球的制备
将上述步骤2收集的工程菌体用150 mL纯水重悬。称取4.5 g海藻酸钠，溶解 于开水中，搅拌冷却至室温，定容至150mL。将菌悬液加入海藻酸钠溶液混合均匀 逐滴滴加到预冷的500 mL 4%的CaCl2溶液(称取26.5g CaCl2'2H20溶解定容至500 mL)中，在CaCl2溶液放入磁力搅拌子轻轻搅动溶液以防止滴入的液滴粘在一起。 滴加完毕后将悬浮液置于0-4汇保温放置24小时使微球固化。其间由于形成的微球 内含水由于渗透压低而不断外渗，24小时后微球的总体积縮至200mL。然后用去离 子水洗涤固定化微球，低温保存备用。
实施例2、 4， 6-二氨基间苯二酚的生产和分离纯化
1、 4， 6-二氨基间苯二酚的生产
按照图4所示的反应过程，用上述制备的含有羟氨苯歧位酶基因的工程菌的固定
化微球进行催化反应，按照图6所示的工艺流程连接各操作单元搭建生物催化反应装
置，该生物催化反应装置具体包括进样瓶(2.0L普通试剂瓶，含1.0g/L2-氨基-4-硝基酚和1.39g/LNH4Cl的溶液)(1)，恒流泵(2) (BT00-300T，保定兰格恒流 泵有限公司)，装有锌粒的还原柱(3) (1689培氏气体吸收管，管外径20mm，支 管外径5mm，全高205mm，购自东莞市塘厦永先电子仪器厂)，海藻酸钙固定化细 胞填充柱(4)和(5) (1689培氏气体吸收管，管外径20mm，支管外径5mm，全 高205mm，购自东莞市塘厦永先电子仪器厂)和连续式络合萃取柱(6)(磨口球形 冷凝管，外套管长600mm，外套管内内径44mm，全长810mm，球数9个，上管外 径25mm，下管外径15mm，购自博美玻璃仪器厂)；其中进样瓶(1)的出口通过 硅胶管与恒流泵(2)的入口连接，恒流泵(2)的出口通过硅胶管与装有锌粒的还原 柱(3)的入口连接，还原柱(3)的出口通过硅胶管与海藻酸钙固定化细胞填充的催 化反应柱(4)的入口连接，海藻酸钙固定化细胞填充柱(4)通过硅胶管和海藻酸钙 固定化细胞填充的催化反应柱(5)连接，海藻酸钙固定化细胞填充的催化反应柱(5) 的出口通过硅胶管与连续式络合萃取柱(6)连接。
海藻酸钙固定化细胞填充的催化反应柱(4)和(5)中，装有实施例1制备获得 的含有羟氨苯歧位酶基因的工程菌的固定化微球，固定化微球是先加入到去离子水或 者纯净水中，再加入到催化反应柱(4)和(5)中，固定化细胞占海藻酸钙固定化细 胞填充的催化反应柱(4)或(5)的体积的80%。
2.0L原料溶液(含1.0g/L2-氨基-4-硝基酚和1.39g/LNH4Cl的溶液)装入进样 瓶(1)中，在N2的保护下，通过计量泵(BT00-300T，保定兰格恒流泵有限公司)将 底物2-氨基-4-硝基酚溶液以1.0mL/min的流度连续流过装有锌粒(锌粒粒径为3-5 mm)的还原柱(3)中，2-氨基-4-硝基酚在反应器中的停留时间为20分钟，锌粒体积 占反应柱总体积的60%，反应温度为6(TC，使底物溶液首先被锌在6(TC下还原为2-氨 基-4-羟氨酚，经紫外分光光度法方法检测表明，2-氨基-4-硝基酚在还原柱(3)的还 原产率达到95%。将所得的2-氨基-4-羟氨酚物料溶液从还原柱(3)以1.0mL/min的 流速导入海藻酸钙固定化细胞填充的催化反应柱(4)和(5)中，在37°C，底物在 海藻酸钙固定化细胞填充的催化反应柱(4)和(5)中的停留时间为60min。 2-氨基 -4-羟氨酚在该装有固定化微球的催化反应柱中在固定化微球中含有的羟氨苯歧位酶 催化下生成4,6-二氨基间苯二酚，共获得1.8L4,6-二氨基间苯二酚溶液产物，用紫 外分光光度计方法检测表明4， 6-二氨基间苯二酚的浓度为5.52 mM，即总共得到2.35 g 4,6-二氨基间苯二酚，用紫外分光光度计方法检测产率，结果表明4,6-二氨基间 苯二酚的产率为85%。
2、 反应产物的络合萃取
将步骤1制备的4， 6-二氨基间苯二酚盐酸盐溶液，经过络合萃取分离络合萃
取剂选择D2EHPA、正辛醇和煤油的混合液(体积比为20/30/50);将步骤1制备 的4,6-二氨基间苯二酚溶液1800ml通入上述连续式络合萃取柱(6)中，在N2的保 护下，逐滴加入200ml上述络合萃取剂，氮气搅拌作用下实现络合萃取，萃取完毕 后取有机相。用与络合萃取剂等体积的浓度为3.5M的盐酸溶液(含有1%的氯化亚 锡)与上述络合萃取有机相溶液混合振荡20 min，静置20 min待分层后将下层水相 收集，重复三次，将水相合并得到150ml反萃取溶液。
3、 反应产物的分离纯化工艺
将步骤2得到的反萃取溶液在旋转蒸发仪上，在75。C， 0.095 Mpa真空度的条件 下蒸馏浓縮30min，浓縮至体积为37.5mL,可观察到有部分深绿色结晶析出，向浓 縮液中加入5.0g活性炭脱色20 min除杂质，然后缓慢冷却至4"C是晶体析出，将上 述析出的晶体用30ml3.5M的盐酸溶液(含有1%的氯化亚锡)溶解，将溶液转入50 mL离心管中，同时向其中加入l.O g活性炭颗粒，放置于65'C烘箱中脱色5小时。 将析出的晶体用25 mL的3.5M的盐酸溶液(含有1%的氯化亚锡)溶解洗脱转至50 mL离心管中，同时向其中加入0.2 g活性炭颗粒，放置于65'C烘箱中脱色。将脱色 后的产物溶液静置后转入另一干净的离心管中，缓慢冷却至4。C， 10-12小时可观察 到有晶体析出。将晶体取出在真空干燥箱8-10小时室温干燥得到1.46 g无色透明晶 体，即纯化后4, 6-二氨基间苯二酚盐酸盐的产率为53%。
4、 结晶产物的鉴定
将步骤3获得的产物真空干燥后，采用溴化钾压片法制样做红外表征，FTIR表 征结果分析如图7: 3400-2500 cm"的宽吸收为胺盐Vas(.nh3+)，羟基 -卿，氢键缔合 峰以及苯环v(^-h)的吸收峰的叠加。2564 cm"附近的峰为胺盐倍频、合频吸收峰。1634 cm", 1496 cm"峰为苯环v(=c.H)， 1540 cm"峰为N-H平面变角振动吸收峰。1371 cm'1， 1212 cm—1为氢键缔合情况下-OH平面变角振动及v (.oh)的偶合峰，1324 cm—1为v(.c.N)， 881 cm'1， 857 cm—1为1, 2, 4, 5取代苯环非平面变角振动的特征峰。从分析结果可以 看出，样品的红外谱图和4, 6-二氨基间苯二酚盐酸盐标准样品基本吻合。
将步骤3获得的产物真空干燥后溶于D20做核磁共振表征，400MHz。 'HNMR 表征结果如图8所示。图中除D20的残余质子峰34.78868外，出现两种不同环境的 氢质子，56.67309和S7.32040分别为2和5的H， DAR盐酸盐的-OH和-NH/的H 与D20交换并没有出现吸收。两峰面积基本相等，表明2位和5位H数量相等，杂 质的含量低于1%。结果表明得到的产物为4, 6-二氨基间苯二酚盐酸盐，纯度达到 99%。
实施例3、 4， 6-二氨基间苯二酚的生产和分离纯化
1、 4， 6-二氨基间苯二酚的生产
按照图4所示的反应过程，用实施例1制备的含有羟氨苯歧位酶基因的工程菌的 固定化微球进行催化反应，按照图6所示的工艺流程连接各操作单元搭建生物催化反 应装置，该生物催化反应装置同实施例2。固定化细胞占海藻酸钙固定化细胞填充的 催化反应柱(4)或(5)的体积的60%。
2.0L原料溶液(含1.0 g/L 2-氨基-4-硝基酚和1.39 g /L NH4C1的溶液)装入进样 瓶(1)中，在N2的保护下，通过计量泵(BT00-300T，保定兰格恒流泵有限公司) 将底物2-氨基-4-硝基酚溶液以1.0mL/min的流度连续流过装有锌粒(锌粒粒径为3-5 mm)的还原柱(3)中，2-氨基-4-硝基酚在反应器中的停留时间为20分钟，锌粒体 积占反应柱总体积的60%，反应温度为6(TC，使底物溶液首先被锌在6(TC下还原为 2-氨基-4-羟氨酚，经紫外分光光度法方法检测表明，2-氨基-4-硝基酚在还原柱(3) 的还原产率达到95%。将所得的2-氨基-4-羟氨酚物料溶液从还原柱(3)以0.1 mL/min 的流速导入海藻酸钙固定化细胞填充的催化反应柱(4)和(5)中，在30°C，底物 在海藻酸钙固定化细胞填充的催化反应柱(4)和(5)中的停留时间为60min。 2-氨 基-4-羟氨酚在该装有固定化微球的催化反应柱中在固定化微球中含有的羟氨苯歧位 酶催化下生成4,6-二氨基间苯二酚，共获得1.8L4,6-二氨基间苯二酚溶液产物，用 紫外分光光度计方法检测表明4, 6-二氨基间苯二酚的浓度为5.01 mM，即总共得到 2.13 g 4，6-二氨基间苯二酚，用紫外分光光度计方法检测产率，结果表明4,6-二氨 基间苯二酚的产率为76.9%。
2、 反应产物的分离纯化工艺
将上述获得的反应产物溶液用实施例2所述的方法进行络合萃取，将络合萃取得 到的反萃取溶液在旋转蒸发仪上，在60。C， 0.095 Mpa真空度的条件下蒸馏浓縮30 min，浓縮至体积为37.5 mL，可观察到有部分深绿色结晶析出，向浓縮液中加入5.0g 活性炭脱色20 min除杂质，然后缓慢冷却至4r是晶体析出，将上述析出的晶体用 30ml3.5M的盐酸溶液(含有1%的氯化亚锡)溶解，将溶液转入50 mL离心管中， 同时向其中加入1.0g活性炭颗粒，放置于65t:烘箱中脱色5小时。将析出的晶体用 25 mL的3.5M的盐酸溶液(含有1%的氯化亚锡)溶解洗脱转至50 mL离心管中， 同时向其中加入0.2g活性炭颗粒，放置于65'C烘箱中脱色。将脱色后的产物溶液静 置后转入另一干净的离心管中，缓慢冷却至4'C， IO小时可观察到有晶体析出。将晶 体取出在真空干燥箱8小时室温干燥得到1.35 g无色透明晶体，即纯化后4， 6-二氨
基间苯二酚盐酸盐的产率为48.8%。将获得的结晶产物真空干燥后，釆用溴化钾压片 法制样做红外表征，同时溶于D20做核磁共振表征，400MHz，对其进行鉴定和纯度 检测，对结晶产物的鉴定结果表明得到的产物为4, 6-二氨基间苯二酚盐酸盐，纯度 达到99% (杂质小于1%)。
实施例4、 4， 6-二氨基间苯二酚的生产和分离纯化
1、 4， 6-二氨基间苯二酚的生产
按照图4所示的反应过程，用上述制备的含有羟氨苯歧位酶基因的工程菌的固定 化微球进行催化反应，按照图6所示的工艺流程连接各操作单元搭建生物催化反应装 置，该生物催化反应装置同实施例2。 2-氨基-4-硝基酚在反应器中的停留时间为40 分钟，锌粒体积占反应柱总体积的90%，反应温度为8(TC，使底物溶液首先被锌在 8(TC下还原为2-氨基-4-羟氨酚，经紫外分光光度法方法检测表明，2-氨基-4-硝基酚 在还原柱(3)的还原产率达到95%。将所得的2-氨基-4-羟氨酚物料溶液从还原柱(3) 以1.0mL/min的流速导入海藻酸钙固定化细胞填充的催化反应柱(4)和(5)中， 在4(TC，底物在海藻酸钙固定化细胞填充的催化反应柱(4)和(5)中的停留时间 为60min。 2-氨基-4-羟氨酚在该装有固定化微球的催化反应柱中在固定化微球中含有 的羟氨苯歧位酶催化下生成4, 6-二氮基间苯二酚，共获得1.8 L 4, 6-二氨基间苯二酚 溶液产物，用紫外分光光度计方法检测表明4, 6-二氨基间苯二酚的浓度为5.14 mM， 即总共得到2.18g 4，6-二氨基间苯二酚，用紫外分光光度计方法检测产率，结果表 明4， 6-二氨基间苯二酚的产率为79.1 %。
2、 反应产物的分离纯化工艺
将上述获得的反应产物溶液用实施例2所述的方法进行络合萃取，将络合萃取得 到的反萃取溶液在旋转蒸发仪上，在85。C， 0.095 Mpa真空度的条件下蒸馏浓縮30 min，浓縮至体积为37.5 mL，可观察到有部分深绿色结晶析出，向浓縮液中加入5.0g 活性炭脱色20min除杂质，然后缓慢冷却至4。C是晶体析出，将上述析出的晶体用 30ml3.5M的盐酸溶液(含有1。/。的氯化亚锡)溶解，将溶液转入50 mL离心管中， 同时向其中加入1.0g活性炭颗粒，放置于65'C烘箱中脱色5小时。将析出的晶体用 25mL的3.5M的盐酸溶液(含有1%的氯化亚锡)溶解洗脱转至50 mL离心管中， 同时向其中加入0.2g活性炭颗粒，放置于65r烘箱中脱色。将脱色后的产物溶液静 置后转入另一干净的离心管中，缓慢冷却至4X:， 12小时可观察到有晶体析出。将晶 体取出在真空干燥箱10小时室温干燥得到1.43 g无色透明晶体，即纯化后4， 6-二氨 基间苯二酚盐酸盐的产率为51.7%。将获得的结晶产物真空干燥后，采用溴化钾压片 法制样做红外表征，同时溶于D20做核磁共振表征，400MHz，对其进行鉴定和纯度
检测，对结晶产物的鉴定结果表明得到的产物为4,6-二氨基间苯二酚盐酸盐，纯度
达到99% (杂质小于1%)。
实施例5、 4， 6-二氨基间苯二酚的生产和分离纯化
1、 4， 6-二氨基间苯二酚的生产
按照图4所示的反应过程，用上述制备的含有羟氨苯歧位酶基因的工程菌的固定 化微球进行催化反应，按照图6所示的工艺流程连接各操作单元搭建生物催化反应装 置，该生物催化反应装置同实施例2。 2-氨基-4-硝基酚在反应器中的停留时间为30 分钟，锌粒体积占反应柱总体积的90%，反应温度为55X:，使底物溶液首先被锌在 8(TC下还原为2-氨基-4-羟氨酚，经紫外分光光度法方法检测表明，2-氨基-4-硝基酚 在还原柱(3)的还原产率达到95%。将所得的2-氨基-4-羟氨酚物料溶液从还原柱(3) 以0.8mL/min的流速导入海藻酸钙固定化细胞填充的催化反应柱(4)和(5)中， 在35。C，底物在海藻酸钙固定化细胞填充的催化反应柱(4)和(5)中的停留时间 为60min。 2-氨基-4-羟氨酚在该装有固定化微球的催化反应柱中在固定化微球中含有 的羟氨苯歧位酶催化下生成4, 6-二氨基间苯二酚，共获得1.8 L 4, 6-二氨基间苯二酚 溶液产物，用紫外分光光度计方法检测表明4, 6-二氨基间苯二酚盐酸盐的浓度为5.27 mM，即总共得到2.24§ 4,6-二氨基间苯二酚，用紫外分光光度计方法检测产率， 结果表明4, 6-二氨基间苯二酚的产率为81.1 %。
2、 反应产物的分离纯化工艺
将上述获得的反应产物溶液用实施例2所述的方法进行络合萃取,将络合萃取得 到的反萃取溶液在旋转蒸发仪上，在80'C， 0.095 Mpa真空度的条件下蒸馏浓縮30 min，浓縮至体积为38.5 mL，可观察到有部分深绿色结晶析出，向浓縮液中加入5.0g 活性炭脱色20min除杂质，然后缓慢冷却至4t:是晶体析出，将上述析出的晶体用 30ml3.5M的盐酸溶液(含有1%的氯化亚锡)溶解，将溶液转入50 mL离心管中， 同时向其中加入l.Og活性炭颗粒，放置于65'C烘箱中脱色5小时。将析出的晶体用 25 mL的3.5M的盐酸溶液(含有1%的氯化亚锡)溶解洗脱转至50 mL离心管中， 同时向其中加入0.2g活性炭颗粒，放置于65t:烘箱中脱色。将脱色后的产物溶液静 置后转入另一干净的离心管中，缓慢冷却至4'C， ll小时可观察到有晶体析出。将晶 体取出在真空干燥箱9小时室温干燥得到1.46 g无色透明晶体，即为纯化后得到的 4,6-二氨基间苯二酚盐酸盐，其产率为52.7%。将获得的结晶产物真空干燥后，采用 溴化钾压片法制样做红外表征，同时溶于D20做核磁共振表征，400MHz，对其进行 鉴定和纯度检测，对结晶产物的鉴定结果表明得到的产物为4,6-二氨基间苯二酚盐 酸盐，纯度达到99% (杂质小于1%)。
序列表
<160>2
<210> 1 <211> 28 <212> DNA <213>人工序列
<220> <223>
<400> 1
gtccgaattc aaggagaccc cttcatgc 28
<210> 2 <211> 28 <212> DNA <213>人工序列
<220> <223>
<400> 2
gtcaaagctt tgcgggaagt ctcatggt 28
权利要求
1、可表达羟氨苯歧位酶的工程菌，是将羟氨苯歧位酶基因通过原核表达载体转入大肠杆菌中，筛选获得的可表达羟氨苯歧位酶的工程菌。
2、 根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于所述羟氨苯歧位酶基因的核苷 酸序列是自GENBANK号为DQ207951的5'端的第1802-2264位核苷酸序列。
3、 根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于所述羟氨苯歧位酶基因是以睾 丸酮丛毛单胞菌(Comamo"m festosferam') CNB-1 CGMCC No. 1028的基因组DNA为 模板，用核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列2的一对引物进行PCR扩增得到 的。
4、 根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于:所述原核表达载体为pET-21a(+)， 所述大肠杆菌菌株为大肠杆菌BL21(DE3);所述羟氨苯歧位酶基因优选为通过将所 述PCR扩增得到的产物经过五coRI和/f/^/III双酶切处理后，插入到所述pET-21a(+) 的和///mmi酶切位点之间得到的重组表达载体转入所述大肠杆菌中的。
5、 一种生产4,6-二氨基间苯二酚的方法，包括下述步骤1) 将权利要求l一4中任意一项所述的工程菌进行发酵至对数期，然后诱导表达 培养得到含有羟氨苯歧位酶的工程菌；2) 以2-氨基-4-羟氨酚为底物，用步骤1获得的含有羟氨苯歧位酶的工程菌进行 催化反应，得到4，6-二氨基间苯二酚。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，所述催化反应 的温度为10-50°C，优选为37°C。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，所述含有羟氨 苯歧位酶的工程菌以完整细胞悬浮液或固定化细胞的形式进行催化反应;所述固定化 细胞优选为固定化微球。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述固定化微球的载体为海藻酸 钙；所述固定化微球的直径为2-4mm;所述步骤1)中，所述诱导表达的试剂为IPTG，所述诱导表达培养的温度为 15-25°C，优选为18"C，所述诱导表达培养的时间为12-36小时，优选为24小时； 所述发酵培养的温度为30-40°C，优选为37"C。
9、 根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，还包括用2-氨 基-4-硝基酚与锌反应得到2-氨基-4-羟氨酚；所述2-氨基-4-硝基酚与锌反应的温度为 30—8(TC，优选为6(TC;所述2-氨基-4-硝基酚存在于含NH4Cl的溶液中；所述溶液 中，所述2-氨基-4-硝基酚的浓度为0.1 — 1.0g/L， NH4C1的浓度为0.5 — 5.0g/L;所述 溶液优选为含1.0 g/L 2-氨基-4-硝基酚和1.39 g /L NH4C1的溶液。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述方法中，还包括将反应产物 进行分离纯化得到纯化的4， 6-二氨基间苯二酚盐酸盐；所述分离纯化是将反应得到 的溶液用络合萃取剂萃取，取有机相再经含有质量百分含量为1%的氯化亚锡的 3.5mol/L的盐酸溶液萃取，取底层无机相，用活性碳脱色，结晶，重复脱色结晶直到 得到无色透明晶体，即为纯化的4， 6-二氨基间苯二酚盐酸盐；所述络合萃取剂为含 有体积比为20: 30: 50的D2EHPA、正辛醇和煤油的混合液；所述活性碳脱色的温 度为55-80°C。
全文摘要
本发明公开了一种生产4，6-二氨基间苯二酚及其专用工程菌。该工程菌是将羟氨苯歧位酶基因通过原核表达载体转入大肠杆菌中，筛选获得的可表达羟氨苯歧位酶的工程菌。该方法，包括下述步骤1)将所述的工程菌进行发酵至对数期，然后诱导表达培养得到含有羟氨苯歧位酶的工程菌；2)以2-氨基-4-羟氨酚为底物，用步骤1获得的含有羟氨苯歧位酶的工程菌进行催化反应，得到4，6-二氨基间苯二酚。本发明的方法在温和条件下合成4，6-二氨基间苯二酚，合成工艺过程不需要使用有机溶剂，合成路线短，原料来源广，产率高且对环境污染小。
文档编号C12P7/22GK101100654SQ200710119069
公开日2008年1月9日 申请日期2007年6月19日 优先权日2007年6月19日
发明者刘双江, 刘志培, 姜嘉彤, 姜成英, 勇 杨 申请人:中国科学院微生物研究所