专利名称：分子置换标签测序并行检测法即寡聚核酸编码标签分子库微球阵列分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及的技术领域是高通量并行分子检测的微球悬浮阵列系统，又称液态生物芯片。 尤其是在微球表面结合的寡聚核酸编码标签分子文库竞争性置换的并行检测方法。
背景技术：
随着人类等基因组测序的完成，并进入功能蛋白组时代，面对极其巨大数量的生物分子 亟待同时检测批量标本，许多指标的高通量并行检测技术来代替传统的逐个分子检测方法。 生物芯片(又称微阵列)这一来自计算机芯片的概念便应运而生。生物芯片实质是在面积不大 的基片表面上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子，并经荧光标记 或化学发光显示，激光扫描/CCD摄像记录，结果通过计算机软件分析。生物芯片一经诞生便 成为生物学研究最大的热点，并正以惊人的速度向前发展。各大学研究机构、公司纷纷进入 这一领域，创造了许多生物芯片概念与装置(生物芯片，第二版，马立人主编，2002年，化 学工业出版社)。生物芯片主要分为基因芯片和蛋白质芯片两大类。基因芯片开发的种类及应用非常之多， 大部分公司使用自动系统BioRobot将DNA点涂或压印在波片或滤膜上。比较精密的芯片以 Affymetrix公司的Genechip为主，是运用半导体照相平板技术在二维平面玻片上原位合成寡 核苷酸片段的核酸检测微阵列(1998， U.S. Pat. No. 5,837,832和2001， U.S. Pat. No. 6,309,831)。 蛋白质芯片是继基因芯片之后由Ciphergen公司将表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术 应用于蛋白质检测的生物芯片(2001， U.S. Pat. No. 6,225,047)。国内东南大学吴健雄实验室 成功地开发了分子印章原位合成高密度基因芯片；北京博奥公司开发了芯片上的实验室-微流 体芯片(2003，中国专利01145118.1和2004，中国专利031051080.1)。这些芯片技术大大提高 了分子检测的综合程度。但仍存在一些平面芯片所固有的缺陷(1)物理意义上的芯片加工 繁琐，大量工业生产效率不高，昂贵。(2)芯片阵列位点之间因物理方法加工存在一定的差 异，导致不同位点之间差异，不同芯片之间的差异，导致近10%的背景偏差，重复性差。(3) 分子与芯片阵列表面结合动力学的不足，如分子反应液混匀慢，因芯片表面尺寸导致反应液 分子扩散缓慢而分布不均等。(4)物理模拟信号转换易失真。这些正在发展中的芯片技术实 用性并不高。为了克服二维平面生物芯片的固有不足，Beckton-Dickson公司与Luminex公司等创造了 基于荧光编码微球液态悬浮阵列分析。首先通过两种不同荧光物质按不同的比例渗入微球编 码(可寻址)标记，最多可形成140种不同编码。第三种荧光物质标记检测探针，编码微球 包被捕获分子后与待测分子结合，再与荧光探针结合后经流式细胞仪传送成一维线性单列， 逐一通过两束激光检测，其一束测微球颜色确定编码种类，另一束检测探针荧光强度定量分 析。(1999， U.S. Pat. No. 5,981,180和2001， U.S. Pat. No. 6,268,222)。这种液态概念的生物芯 片大大促进了其实用性。其主要优点(1) 、高速度最快可达10000测试/小时；(2) 、高灵敏度检测低限可达10pg/ml;(3) 、低成本微球易批量加工，成本低，试剂用量少，能有效降低临床应用的试剂成本；(4) 、实时检测结果实时显示，既可并行检测基因，又可并行检测蛋白质，液相反应更适 合生物分子，仅需微量样本(10ul)，最多可达140个指标；(5) 、重复性好微球一批生产分装使用，微球单元之间差异小，每个指标有5000个反应单 元，分析100次取平均值；(6) 、线性范围广检测范围达6个数量级。 基于荧光的微球微阵列分析优点很多，但限于荧光物质物理标记编码数量有限，检测通量甚至较二维平面芯片少很多，同时荧光信号转换的模拟信号易失真，比较适合临床一些指 标的实时自动检测。本发明创造一条基于标签测序的微球阵列分析途径，采用人造序列的寡 聚核酸标签编码分子文库包括DNA文库或蛋白质文库，而不是直接编码微球。微球再用对 应的分子库配体(DNA互补链，或蛋白质配体如抗原对应抗体)包被，形成捕获微球。微球 包被的捕获配体与标签编码的分子文库结合后形成微球阵列库。当待测标本含有与标签了的 分子文库有相同分子时，待测分子竞争性地与微球表面捕获分子结合，竞争置换下来的编码分子通过寡聚核酸标签串联、克隆后测序鉴定。由此可见，基于测序的微球阵列分析除了不 能实时检测的局限外，保留了基于荧光的微球阵列分析的优点，并拓展了一些新的固有优越 性。本发明寡聚核酸编码标签分子文库微球阵列分析是一种充分利用现有成熟生物克隆、测 序技术,避免物理化学技术的新概念途径。基于寡聚核酸DNA片段连接、克隆技术和DNA 测序技术。历经20多年分子生物学的发展，这些技术已发展成熟到了一个非常高的实用水 平。自从1953年，Watson & Crick提出DNA双螺旋学说奠定了分子生物学基础，从而诞生 了体外重组，基因扩增等众多分子克隆技术(分子克隆，2001，J.Sambrook,et,al.3rdEdit)。特别 是1980's年代后限制性内切酶，连接酶，PCR及耐热聚合酶和质粒载体等的实用，DNA体 外重组克隆技术已成为生物学中成熟的最基本的常规技术。DNA测序技术也历经许多不同的尝试，如酶消化法，化学法。甚至基因芯片最初的主 要目的亦是DNA序列的测定。目前集中于Sanger的双脱氧链终止法(Sanger F，1975，J.Mol.Biol.94:441-448和Sanger F,1977，PNAS 74:5463-5467)。并历经同位素标记，荧 光素标记，测序酶的改进，速率增加了数十倍。特别是人类基因组测序计划的实施大大促进 了测序技术的发展，从平板凝胶到毛细管电泳，并产生了高通量的自动化测序仪和测序机器 人。再次极大地提高了效率。发明内容本发明针对现有生物芯片的不足，提供一种新的基于测序技术的液态生物芯片-分子置换 标签测序并行检测法，既能保证高通量的检测，同时该方法重复性好，可靠性高，而且具有 很高的灵敏度。一种分子置换标签测序并行检测法，其特征是包括如下步骤(1)交联有捕获配体的微 球，吸附标签编码的分子文库中的分子，形成标签分子微球阵列分析库；所述标签为一段与 文库分子序列无关的相互独立的寡聚核酸双链DNA，所述寡聚核酸的有意义链5'端连接有生 物素标记和扩增序列，寡聚核酸的3'端预设有与相应标签末端互补的序列和限制性内切酶 El识别位点，所述标签与文库分子交联，所述捕获配体为文库分子的特异性结合配体；(2) 微球阵列库与待测样本混合，竞争置换带标签分子文库中的相同分子；(3)被置换出来的标 签分子通过标签串联、测序检测。所述标签分子长度为12-100bp。标签分子长度优选16-30bp。所述分子文库为DNA文库或蛋白质文库。所述标签与DNA分子交联是通过设计引物扩增交联。所述标签与蛋白质分子交联是通过巯基化DNA与活化蛋白质交联。所述微球大小为纳米级到微米级(lnm-1000um)。所述微球材质为塑料(聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯等)；或树脂(酚醛树脂、聚酯树脂、 聚酰胺树脂等)；或凝胶(琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等)；或其它高分子聚合材料。 所述微球还可以是形状不规则的微粒或是具有活性表面的平面介质。 所述步骤3中标签串联、测序检测，其特征是包括如下步骤(a)编码标签为由二条互补
的16-30 base寡核苷酸组成的人造特异序列的寡聚核酸双链DNA; (b)分子库中每个分子设 计一对不同序列的标签，每个标签有意义链的5'端标记有生物素，每对之间3'末端部分 互补，而且3'末端与分子库连接处设有限制性内切酶E1的酶切位点；(c)竞争性置换的每 对标签经E1酶切后被链亲和素微磁珠纯化，经其3'末端互补聚合酶延伸而形成二联标签； (d)分子库分子分成奇数(Odd)、偶数(Even)两组，奇数分子每对二联标签， 一侧预先加 上特异的序列F，另一侧加上Odd序列和E2酶切位点；偶数分子每对二联标签， 一侧预先 加上不同的R序列，另一侧加与Odd互补的Even序列和E2酶切位点；(e)每对二联标签经 E2酶切随机连接，或经E2酶切后Odd-Even序列互补延伸而生成四联标签。再用F/R引物 扩增4联标签，PCR产物用F/R外侧的预设E3酶切后进一步串联插入克隆载体，克隆，阳 性质粒测序。鉴定每个编码标签的种类及数量。本发明是一种基于短核酸序列编码标签测序分析的微球，微颗粒，或微珠的悬浮阵列分 析方法。基本原理是将未知待测的分子与带标签的已知分子文库比较(竞争性置换出带标签 的相同指示分子)，再根据相同分子的标签编码来推导出待测分子的种类与多少。操作分为 标签分子库的构建(示意图如图l)与标签编码的串联、检测(示意图如图2)两大步骤。第一步根据已知的分子文库序列结构信息，文库中每个分子选取有代表性的一部分或 全部标记加上一特定序列编码的短的寡聚核酸标签，构建一人造的每个分子都带有寡聚核酸 双链DNA编码标签的分子文库。再取商业化的均一聚苯乙烯塑料微球或活化的琼脂糖凝胶 颗粒，根据分子库中分子的数目分组，每组微球表面共价交联分子库中相对应分子的配体(如 互补DNA，抗原-抗体等)，混匀的微球吸附带标签的分子指示库，洗去未结合的分子，生 成标签分子微球库。将待测标本与微球库反应，待测样本中与文库中相同的分子就能竞争性 地置换出相应微球表面的带标签的相同分子。游离出来的带标签分子与微球文库就此分离 开。带标签的分子中在标签近分子连接处预设了限制性内切酶El，经酶切反应后，标签与 分子分离，标签又经其一侧5'端所带的生物素标记，结合至链亲和素交联的微磁球，进一 步纯化。文库标签序列是一段约20bp(16-30 bp)长的与文库分子序列无关的人造寡聚核酸序列。 在文库分子与标签之间预设限制性内切酶E1识别位点，理论上E1可以是任意限制性内切酶， 但从标签串联方面需要，仅识别4bp位点且酶切后有意义链3'末端仅剩4bp识别位点的一 个碱基的酶如Baf I等，使标签3'末端序列更容易设计操作。第二步编码标签连接、扩增、再连接、克隆，最后测序检测。短标签的2联与4联聚 体的联结，是基于两条DNA链如果其有意义链的3'末端部分互补，就能互为引物被PCR扩 增而相连的原理设计的。为了使编码标签尾-尾相连形成两聚体标签，分子文库中每个分子
预设一对不同的两条标签，其中一条标签有意义链3'末端与另一条标签有意义链3'末端 部分互补经PCR延伸而尾-尾相联形成2联标签对。每个分子两联标签对的一端再预先加上 ，段序列，其中分子1, 3， 5……等奇数分子标签使用同一序列F，分子2， 4， 6……等偶数分子 标签使用另一相同序列R作为随后4联标签正反向扩增引物。每个标签对的另一端预设限制 性内切酶E2酶切位点，E2的选择原则同限制性内切酶El。两聚体2联标签经用预设的限制性内切酶E2酶切纯化后，再经T4连接酶使分子库分子 每对标签之间随机连接。或者每对标签E2酶切位点末端预先加上互补序列使奇数分子 1, 3， 5……标签一端为同一序列，偶数分子2， 4， 6……标签一端为互补序列。经PCR使奇数分 子标签对与偶数分子标签对一端互补延伸，而头-头相接。如果文库分子数较少,为防止奇偶 数分子不等，剩下游离的每对标签再用T4连接酶连接，形成4联标签。联好的4联标签扩增是使用4联标签两端的预设序列F和R的5'端加上E3酶切位点 作为4联标签正向引物和反向引物扩增，纯化、酶切、再纯化连接串联成2-6个4联标签相 连的链状串联标签、克隆至pUC19载体，挑阳性克隆数十乃至数百个克隆提取质粒，测序分 析。E3可以是克隆载体多克隆位点的任意酶。由此可见，本发明将微球阵列分析技术与生物克隆测序技术相结合，基于标签测序的微 球阵列分析除了不能实时检测的局限外，保留了基于荧光的微球阵列分析的优点，并拓展了 一些固有的优越性(1)高通量，寡聚核酸标签编码数目基本没有限制。(2)高灵敏度，标 签串联后经PCR扩增再克隆测序，检测水平理论上可达仅数个、数十个分子水平，远高于pg 水平。(3)重复性好，生物核酸序列远较物理信号精确，可靠性特别高。(4)基于测序的微 球阵列分析不需要经一维线性排列就能原位竞争性检测，这种点的原位反应更接近于生物天 然反应，较物理、化学反应更适合生物分子的检测。尤其适合抑癌基因、癌基因文库，肿瘤 标志基因库，细胞因子库等专有遗传型或特殊功能表型文库的并行精确定性，定量分析。根据文库分子不同又分为基因文库微球阵列和蛋白质文库微球阵列分析。 一、基因文库微球阵列原理及操作根据Bioinformatic Data Base生物信息数据库确定一限定范围的基因文库，如细胞因子基 因库，淋巴细胞表面标志库等。文库中每个DNA分子，经计算机辅助设计选择一段约 100-500bp长的较保守、没有空间结构的序列作为指示分子文库。选择每个分子其两侧末端各 约20-30bp长的序列作为扩增引物。DNA分子标记标签是利用PCR引物仅3'末端完全匹配 依赖性，而5'端序列错配不影响扩增引物结合，延长的特性，将标签序列加在文库分子扩 增正向引物5'端前面和反向引物5'端前面，待PCR扩增后，标签序列通过带标签的引物就成为扩增分子末端的一部分而标记。并且，带标签的引物5'端通过01igo合成时标记上生 物素。文库中每个DNA分子预设一对序列不相同的两条寡核苷酸标签，他们3'端尾部有 6-10bp序列互补，以便于能互为引物而延伸为尾尾相联的两聚体标签。文库DNA分子1，预 设标签tagla; lb，分子2，预设tag2a,2b;分子3，预设tag3a,3b，……等以此类推。每对标 签的一端预先加上一段序列,其中分子1,3,5……等奇数组分子标签都使用同一序列F，分子 2, 4, 6……等偶数组分子标签都使用另一相同序列R作为4联标签正反向扩增引物，每对标签 的另一端预设限制性内切酶E2酶切位点。每对标签E2酶切位点末端再预先设计8-12bp互补 的共同序列使奇数分子1, 3， 5……标签一端与偶数分子2, 4, 6……标签一端互补。以文库反向 扩增引物或分子中间 一段序列交联固定于微球表面形成捕获微球。PCR扩增的带标签的分子DNA库吸附至带捕获配体的混合微球，洗去未结合的分子， 再形成分子微球库。检测时将待测样本与微球库混合，如果待测样本中有与文库中相同的分 子，则标签编码的相同分子就被竞争性地置换出来，通过标签末端的生物素，被链亲和素磁 珠纯化出来，经E1酶切，链亲和素磁微球纯化的寡聚核苷酸标签库9(TC加热变性5分钟，4 至5热循环，9(TC30秒，20。C10分钟，65°C1分钟pfu酶扩增使每一分子的一对标签3'末 端互补延伸而尾-尾相连。分子文库每个分子中一对标签尾-尾相连后，再用限制性内切酶E2 酶切纯化，用T4连接酶使分子库分子每对标签之间随机连接。或者E2酶切纯化后，92'C加 热变性5分钟，4至5个热循环，92。C30秒，26。C10分钟，68°C1分钟Tag酶扩增使任意奇 数分子的一对标签与任意偶数分子的一对标签相同的互补末端互为引物延伸而连接。为防止 每对标签间分子数不等，不连游离的每对标签再用T4连接酶连接过夜,形成4联标签。为了使串联标签有一定数量及长度便于克隆和测序，4联标签必须经PCR扩增再酶切进 一步串联。以带E3的酶切位点的F引物和R引物经20-25个循环扩增4联标签，绝大部分 为F/R为两端的产物，极少部分为F/F、 R/R两端的产物，经E3酶切纯化再经T4连接酶串 联成2-6个相连的4联标签，再加E3酶切的pUC19进一步连接，转化DH5a细菌，PCR挑选 数十至数百个阳性克隆，分别提取质粒，最后质粒测序串联标签，通过计算机软件分析标签 的种类与数量推导出待测分子的种类与数量。 操作流程(1) DNA文库引物及标签对的设计、合成选取DNA文库每个分子两端约20-30base长的序列前面分别加上标签序列及酶切位点和 F/R序列构成文库扩增引物。 方案一-.正向引物la公式为(有意义链)5，-(F)—(la—…)—(El)—(1/5，—一)-3，(F)代表4联标签正向引物序列，(la--…)代表每对标签的一条序列，(El)为预设的酶切
位点，(1/5'-—)代表分子l的5'端前20base序列。正向引物lb公式为(有意义链)5，-(E2)—(lb-——)—(El)--(1/5，—一)-3，反向引物1公式为(反意义链)3'-(----1/3，)-5，合成其互补序列作为反向引物。(_——1/3')代表分子1的3'端最后20base序列，(El)为预设的酶切位点，(lb-—-)代表 每对标签另一条不同的序列，其3'末端与la的3'末端6-10base互补。(-E2)代表第二种 预设酶切位点及预设每对标签E2酶切位点末端处部分互补的序列。分子3，5,7，一均以此类推；分子2,4,6,…F换成R,其余同样类推。 方案二正向引物公式为(有意义链)5'-(F/R)—(la———)—(El)—(1/5，一—)-3，；奇数组分子为F，偶数组分子为R。(F/R)代表4联标签引物序列，(la---)代表每对标签的一条序列，(El)为预设的酶切位 点，(1/5'——)代表分子l的5'端前20base序列。 反向引物公式为(反意义链)3，-(———1/3，)—(El)—(lb——)—(—E2)-5，合成其互补序列作为反向引物。(_——1/3，)代表分子1的3'端最后20base序列，(El)为预设的酶切位点，(lb-—…)代表 每对标签另一条不同的序列，其3'末端与la的3，末端6-10base互补。(-E2)代表第二种 预设酶切位点及预设每对标签E2酶切位点末端处部分互补的序列。此种方案还必需取每个分子中间一段序列作为捕获配体。 引物合成采用固相亚磷酰胺三酯法的ABI公司DNA合成仪。或商业定购合成。 合成引物是通过渗入生物素化的dNTP进行5'端生物素标记。 (2) DNA反向引物或捕获配体交联琼脂糖凝胶颗粒交联方法引自精编分子生物学实验指南(F.M.Ausubel，et.ul., 1999, "Short Protocols in Molecular Biology"4th Edit. p535)。溴化氰(CNBr)活化Sepharose CL- 4B购自Pharmacia公司。整个交联过程分成平行两组， 一组交联DNA反向引物的有意义链Oligo，另一组交联 DNA反向引物的反意义链01igo。以下以一组的步聚作代表1) 称lg干活化Sepharose 4B琼脂于一个15ml尖底离心管中，加10ml的1M HC1水化琼脂， 颠倒轻混1分钟，移入一个60ml的布氏漏斗中，再加500ml的1M HC1洗涤，溶胀琼脂约 15分钟。2) 用100ml dH20洗涤琼脂，再用100ml lOmM磷酸钾(PH8.0)洗涤。3) 琼脂移入一个15螺盖离心管中，加约4mll0mM磷酸钾(PH8.0)直至介质成为均匀的稠 浆。4) 立即加入50ulOligoDNA水溶液，室温下置于转轮上混匀过夜。5) 在通风橱内，将琼脂移入布氏漏斗中，100mldH2O洗2次，100ml 1M盐酸乙醇胺(PH8.0) 洗一次。6) 琼脂移入一个15ml离心管中，加1M盐酸乙醇胺(PH8.0)至糊状，室温转轮混匀2-4小 时。7) 移至布氏漏斗，依次用lOOmllOmM磷酸钾(PH8.0)、 100mllM磷酸钾(PH8.0)、 100ml 1M氯化钾、100ml dH20洗涤琼脂。8) Oligo交联琼脂置于IC存缓冲液10mM Tris-Cl (PH7.8)力卩lmM EDTA,0.3M NaCl。 两组 交联物混合于4'C可稳定贮存一年。(3) DNA文库的标记扩增及吸附至捕获微球扩增文库分子l， 分子2 ， 分子3，……模板DNA库 0.5ul5uM文库正向引物l 0.5ul 正向引物2， 正向引物3……5uM文库反向引物l 0.5ul 反向引物2， 反向引物3……10 XPCR buffer 2ul lOmMdNTP 0.5ul pfu 0.5uldH20_15ul20ul于96孔微量反应板中PCR扩增，94'C4分钟，然后25个循环94°C 30秒.52'C 30秒，72°C40秒。然后72。C5分钟。PCR产物经Qiagen 96孔纯化板纯化。捕获微球吸附标记的DNA文库纯化的PCRDNA库混合，IOO'C加热5分钟后快速置于冰 上冷却。交联的捕获微球于50-70。C加入纯化的DNA库结合过夜，并洗涤3-5次，洗去未结 合的分子。(4) 待测标本与微球库竞争性置换DNA:待测标本首先采用Qiagen的DNA纯化柱试剂盒纯化提取样本DNA。样本DNA在100'C加热变性10分钟，然后快速置于干冰中。微球库首先于50-70'C的温充中置换试验前再洗涤三次，洗去未结合的文库分子。再升温至90'C变性2分钟立即移至50-7(TC温育中。将变性的样本DNA加入微球库中50-7(TC继续
温育置换反应l-2小时。离心，小心吸出上清(不要碰触到琼脂糖微球)。移至一新鲜的离心 管中，Qiagen纯化柱纯化。重溶于50ul dH20。限制性内切酶El酶切5-6小时，加入链亲和 素交联的微磁球(Dynal Biotech)洗涤，磁铁结合，纯化结合的标签库。(5) 标签的2联连接链亲和素磁微球纯化的寡聚核苷酸标签库9(TC加热变性5分钟，4至5热循环，9(TC30 秒，20'C10分钟，65"l分钟pfu酶扩增使每一分子的一对标签3'末端互补延伸而尾-尾相 连。(6) 4联标签的扩增及串联 分子文库每个分子中一对标签尾-尾相连后，再用限制性内切酶E2酶切纯化，用T4连接酶使分子库分子每对标签之间随机连接。或者E2酶切纯化后，92'C加热变性5分钟，4至5 个热循环，92°C30秒，26°C10分钟，68°C1分钟Tag酶扩增使分子1的一对标签与分子2的 一对标签连接，分子3与分子4，……以此类推。为防止每对标签间分子数不等，不连游离的 每对标签再用T4连接酶15'C连接过夜，形成4联标签。(7) 克隆经E3酶切的4联标签再连接成2-6个串联的长标签插入至E3酶切的pUC19载体(15: 2ul)再加2ul IOX连接缓冲液，lulT4DNA连接酶16'C过夜。连接反应转化DH5 a :取50ul感受态DH5 a ，力n 10ul连接反应液于4'C冰浴1小时，42 'C热休克45秒，加500ul新鲜LB培养基，37'C摇1小时，涂布于直径20cm的Petri LB培养板。用消毒牙签挑取数百单克隆菌落于含LB培养基的96孔培养板，每个克隆的牙签再于相 应的96孔PCR反应板(用F/R引物)的相应孔子洗一下。PCR筛选阳性克隆。(8) 高通量提取质粒采用96孔微量板高通量并行操作，Qiagen质粒微量板提取试剂盒。1) 取200ul每个阳性克隆过夜振摇的培养液于96孔微量板每个孔中，离心1000rpmX2分钟2) 细菌沉淀加Solution I (G/TE+RNase) 50ul，混匀，室温5-10分钟，3) 加Solution II (0.2NaOH+l%SDS) 50ul，轻混，室温不超过2-3分钟。4) 立即加Solution IH(5M KoAc,PH4.8) 70ul，轻混，离心2500rpmX 10分钟5) 上清转移至Qiagen 96孔质粒微量纯化板离心1000 rpmX2分钟,加Wash buffer 200ul,离心 洗一次，再加200ul Wash buffer离心洗第二次。6) 离心2500rpmXl分钟，除去残留洗液。7) 加每孔加10uldH2O洗脱质粒。(9) 高通量测序采用PE公司试剂盒和96孔加热微量滴定板，荧光终止物(BigDye终止物)循环测序。1) 按每反应如下的试剂量混合，制备反应混合物如下 4ul终止核苷酸混合物(dNTP,ddNTP)2ul 5 X测序缓冲液(0.4M Tris-Cl PH9.0 plus 10mM MgCl) 0.2ul AmpitaqFS 0.2ulpmo1引物(T7/T3) 约200ng BAC DNA 加水至20ul体积2) 设置如下的热循环反应 1循环5min， 95'C 20循环30s,94。C20s ,54 。C 4min ,60 。C 冷却并保持4'C。3) 用Centri-Sep离心板除去过量的终止物。真空干燥样品。4) 加2ul甲酰胺加样缓冲液终止反应，上机。 ABI3700毛细管测序仪自动加样96通道同时测序。(10) 计算机软件分析采用DNA-Star软件分析或编写一基础序列统计程序二、蛋白质文库微球阵列原理及操作按照蛋白质的功能或表型的类似性，相关性，选择一组关联的蛋白质文库，如细胞因子蛋 白库，肿瘤细胞表面标志库等。根据需要测蛋白分子还是检测其抗体分子确定标签标记抗体 分子还是蛋白质抗原。如果检测蛋白质分子，则选择寡聚核酸编码标签标记蛋白分子抗体， 抗体最好是单抗，也可以是基因工程小分子抗体。如果检测对象是蛋白质的抗体，则选择标 签标记蛋白质抗原，抗原可以是完整蛋白质分子，或者是基因工程表达蛋白质片段。抗原、抗体与寡聚核酸DNA交联标记可以采用紫外线照射蛋白质核酸复合物引起共价交 联，但效率最多仅10%，需要进一步富集。主要途径是使用末端硫基团化(硫基-SH)修饰 的寡聚核酸末端与蛋白质或多肽maleimide活化的半胱胺酸残基共价交联(Ghosh S S, et. al."Use of maleimide-thiol coupling chemistry for efficient syntheses of oligonucleotide-enzymeconjugate hybridization probes," Bioconjug Chem 1990 January-February; 1(1 ):71-6)。近来发展了一种修饰DNA与表达蛋白之间的高效交联方法(1.Burbulis，etal.,2005,Nature Methods Vol.2 No.l,p31-37和M丄ovrinovic，et.a1.,2005 Mol.Biosyst.,l,p64-69)。基本原理是目的 蛋白质基因插入PTYB1或PTW1I1载体(NEB公司)表达目的蛋白与Intein内含肽-CBD (几 丁质结合域)融合蛋白，Intein (内含肽)是来自酵母等的蛋白自剪元件，巯基化合物如DTT 可诱导其半胱氨酸处自剪切，产生目的蛋白C末端活化的被硫酚保护的硫酯键。核酸一侧5 '端渗入半胱氨酸类残基的双链DNA的巯基替换剪切蛋白保护硫酚而与表达蛋白末端交联。 双链DNA标签的另一侧5'端仍标记生物素。文库中每个蛋白质分子预设一对序列无关的两条寡聚核酸DNA标签，标签对的3'端尾 部设El酶切位点和6-10bp序列互补，以便于能互为引物而互补延伸为尾尾相连的二聚体。 即蛋白分子l，设标签tagla， lb，分子2设tag2a，2b，分子3设tag3a,3b，……等以此类推， 奇数odd分子标签对a侧预设同一序列F, b侧设同一序列odd+E2酶切位点；偶数even分子 标签对a侧预设同一序列R， b侧设同一与odd互补序列even+E2酶切位点。使奇数分子二 联标签b端与偶数二联标签b端经E2酶切后odd-even末端能互补而结合延伸，形成头-头相 连的4聚体。抗体或抗原的配体共价交联溴化氰(CNBr)活化的Sepharose CL-4B琼脂糖凝 胶颗粒。寡聚核酸标签标记的蛋白质库吸附至带捕获配体的混合微球，洗去未结合的分子，再形 成分子微球库。检测时将待测样本与微球库混合，如果待测样本中有与文库中相同的分子， 则标签编码的相同分子就被竞争性地置换出来，通过标签一侧末端的生物素，被链亲和素磁 珠纯化出来，经E1酶切，链亲和素磁微球纯化的寡聚核酸标签库9(TC加热变性5分钟，经 4至5热循环，90°C30秒，2CTC10分钟，65°C1分钟pfu酶扩增使每一分子的一对标签3' 末端互补延伸而尾-尾相连。分子文库每个分子中一对标签尾-尾相连后，再用限制性内切酶 E2酶切纯化，用T4连接酶使分子库分子每对标签之间随机连接。或者E2酶切纯化后，92°C 加热变性5分钟，4至5个热循环，92。C30秒，26TU0分钟，68'C1分钟Tag酶扩增使任意 奇数分子的一对标签与任意偶数分子的一对标签互补延伸而连接。为防止每对标签间分子数 不等，不连游离的每对标签再用T4连接酶连接过夜,形成4联标签。寡聚核酸4联标签经PCR扩增再酶切进一步串联。以带E3的酶切位点的F引物和R引 物经20-25个循环扩增4联标签，绝大部分为F/R为两端的产物，极少部分为F/F、 R/R两 端的产物，经E3酶切纯化再经T4连接酶串联成2-6个相连的4联标签，再加E3酶切的pUC19 进一步连接，转化DH5a细菌，PCR挑选数十至数百个阳性克隆，分别提取质粒，最后质粒测序串联标签，通过计算机软件分析标签的种类与数量推导出待测分子的种类与数量。 操作流程(1) 寡聚核酸标签标记的蛋白质库标签的设计，合成-设计一系列的20bp (16-30bp)寡聚核酸对，蛋白分子l对应la，lb标签tag，分子2对应 2a,2btag,分子3对应3a,3btag......以此类推，Tag序列相互独立无关，每个tag双链分别合成有意义链和反意义链寡核苷酸。其中一链5'端渗入半胱氨酸类残基，另一链5'标记生物素。 再加热变性，室温复性后混合。引物合成采用固相亚磷酰胺三酯法的ABI公司DNA合成仪。或商业定购合成。(2) Intein内含肽介导的蛋白-DNA交联1) 将目的蛋白基因扩增纯化后EcoR I与Hindin酶切。克隆至PTYB1或PTW1I1载体， 转化大肠杆菌，挑阳性克隆。2) 将阳性表达工程菌在有氧条件下表达目的蛋白-Intein-CBD融合蛋白，用几丁质交联的 Sepharose 4B亲和层析纯化。3) 含目的蛋白的融合蛋白于几丁质的纯化柱上加0.2%硫酚和lmM TCEP (类似DTT， 更稳定)，加样半胱氨酸类残基修饰的寡聚核酸DNA标签，室温孵育16至20小时， PBS洗脱，修饰DNA置换硫酚与目的蛋白交联后被洗脱下来而得以与Intein-CBD分 开而纯化。(3) 抗体配体或抗原配体共价交联溴化氰(CNBr)活化的S印harole4B琼脂糖凝胶颗粒。 取2g干的活化的SepharoleCL-4B溶胀洗涤后加等体积的蛋白(l-10uM pr/lml琼脂)碳酸盐缓冲液(0.2-0.25M碳酸盐含0.5MNaClpH9)转轮上混匀室温2小时或4"C过夜。 加入预先用HC1调pH值为9的乙醇胺溶液搅拌下反应15分钟终止交联反应。 在室温下洗漆吸附剂，以除去过剩的蛋白和乙醇胺溶液置于布化漏斗，先后用100ml 50mM NaHC03(含0. 5M NaCl) 、 0. 1M Na2B407 (含0. 5M NaCl)pH8. 5溶液洗，末了用0. 5M NaCl溶 液洗，抽干。于含0. 02% NaN3的0. 5M NaCl液中4。CIC存。捕获微球吸附标签标记的蛋白质配体共价交联的捕获微球与纯化的标签标记蛋白质文库混 合，室温结合数小时,并洗涤3-5次，洗去未结合的分子。(4) 待测标本与微球库竞争性置换带标签的蛋白质 纯化的蛋白质抗体或抗原标本加入充分洗涤的蛋白质微球阵列库，室温结合数小时，离心，小心吸出上清(不要碰触到琼脂糖微球)。移至一新鲜的离心管中，Qiagen纯化柱纯化。重溶于50ul dH20。限制性内切酶El酶切5-6小时，加入链亲和素交联的微磁球(DynalBiotech)洗涤，磁铁结合，纯化结合的DNA标签库。 (5) 标签的2联连接链亲和素磁微球纯化的寡聚核酸标签库90'C加热变性5分钟，4至5热循环，90°C30秒， 20'C10分钟，65'Cl分钟pfu酶扩增使每一分子的一对标签3'末端互补延伸而尾-尾相连。(6) 4联标签的扩增及串联分子文库每个分子中一对标签尾-尾相连后，再用限制性内切酶E2酶切纯化，用T4连接 酶使分子库分子每对标签之间随机连接。或者E2酶切纯化后，92'C加热变性5分钟，4至5 个热循环，92。C30秒，26t:i0分钟，68°C1分钟Tag酶扩增使分子1的一对标签与分子2的 一对标签连接，分子3与分子4，……以此类推。为防止每对标签间分子数不等，不连游离的 每对标签再用T4连接酶15'C连接过夜，形成4联标签。(7) 克隆酶切的2-6个串联的4联标签连接至E3酶切的pUC19载体(15: 2ul)再加2ul IOX连 接缓冲液，lul T4 DNA连接酶16'C过夜。连接反应转化DH5 a :取50ul感受态DH5 a ，力n lOul连接反应液于4'C冰浴1小时，42 'C热休克45秒，加500ul新鲜LB培养基，37'C摇1小时，涂布于直径20cm的Petri LB培养板。用消毒牙签挑取数百单克隆菌落于含LB培养基的96孔培养板，每个克隆的牙签再于相 应的96孔PCR反应板(用F/R引物)的相应孔子洗一下。PCR筛选阳性克隆。(8) 高通量提取质粒采用96孔微量板高通量并行操作,Qiagen质粒微量板提取试剂盒。1) 取200ul每个阳性克隆过夜振摇的培养液于96孔微量板每个孔中,离心1000rpmX2分钟2) 细菌沉淀加Solution I 50ul,混匀，室温5-10分钟，3) 加Solution H50ul，轻混,室温不超过2-3分钟。4) 立即加Solution III 70ul,轻混,离心2500rpmX10分钟5) 上清转移至Qiagen 96孔质粒微量纯化板离心1000 rpmX2分钟,加Wash buffer 200ul,离心 洗一次,再加200ul Wash buffer离心洗第二次。6) 离心2500rpmXl分钟，除去残留洗液。7) 加每孔加10uldH2O洗脱质粒。(9) 高通量测序采用96孔加热微量滴定板，荧光终止物(BigDye终止物)循环测序。 1)按每反应如下的试剂量混合，制备反应混合物如下 4ul终止核苷酸混合物2ul5X测序缓冲液 0.2ul Ampitaq FS 0.2ulpmo1引物 约200ng BAC DNA 加水至20ul体积2) 设置如下的热循环反应 l循环5min， 95°C 20循环30s，94。C20s ,54 。C 4min ，60 。C 冷却并保持4'C。3) 用Centri-Sep离心板除去过量的终止物。真空干燥样品。4) 加2ul甲酰胺加样缓冲液终止反应，上机。 ABI3700毛细管测序仪自动加样96通道同时测序。(10)计算机软件分析 采用DNA-Star软件分析或编写一基础序列统计程序。
图l.代表分子置换标签微球阵列示意图。第一排，圆代表微球表面交联不同分子的配体。分子文库不同分子以不同形状末端的长 条表示，并通过E1限制性内切酶识别位点与一段DNA序列代表编码标签相连。序列一端黑 点代表标记生物素。微球通过捕获配体吸附标签连接的分子库形成微球阵列库。第二排，待测分子用带省略号箭头的长条代表，长条代表与分子文库中分子相同的结构。 待测样本与微球阵列库结合后待测分子就置换出带标签的相同指示分子，见第三排示意游离的带标签的分子。第四排，代表分离的标签，将第三排带标签的分子E1酶切后，经链亲和素交联的微磁球 吸附一端标记的生物素而与分子分开，纯化。图2.代表寡聚核酸标签的连接、串联示意图。数字la,lb;2a,2b,……代表分子文库中不同分子1， 2……的编码标签；带省略号的序列代 表寡聚核酸标签双链DNA的有意义链；黑点代表5'端标记的生物素。省略号代表每个分子
不同标签的序列，其3'末端每对标签之间尾-尾互补，5'端依标签不同分别加上F或R，或 E2序列。首先每对标签a与b之间3'末端变性、复性互补，经聚合酶延伸而尾-尾相连，形成2 联标签；标签对经E2酶切、纯化后再经T4连接酶随机联结形成4联标签。或者E2酶切后 的末端预设为a与b之间类似互补序列，也可以互补延伸而头-头相接，形成奇数组分子与偶 数组分子之间连接的4联标签。寡聚核酸4联标签再经F/R引物PCR扩增，E3酶切、连接形成更大的串联并克隆至经 E3酶切的载体，转化细菌，挑选阳性克隆。
具体实施方式
下面采用实施例对本发明作进一步的具体说明。实施例抑癌基因pRB,pl6,p53和对照Tubulin基因并行检测癌基因和抑癌基因在细胞生长周期调控中起着最关键的作用。尤其抑癌基因pRB,pl6，p53 的代谢及失活在肿瘤细胞失去生长控制的机理中发挥着最重要的作用。几乎所有肿瘤都涉及 它们或其中之一相关联的某种改变。然而因为传统的研究手段单一，研究对象逐个分析的方 法难免盲人摸象,还原不了整个真实的代谢图像。本实施例构建一个人抑癌基因pRB，pl6,p53的指示分子库，并加上人细胞结构蛋白的 Tubulin(微管蛋白)基因作为恒定对照指示分子共建一个带标签的pRB,pl6,p53和Tubulin指示 DNA吸附至Seplarose CL-4B的微球阵列库。并行分析U20S细胞转化p16基因前后的抑癌 基因的整体代谢变化。抑癌基因pRB取其C末端(792aa-928aa) E2F结合域的约400bp序列作为pRB指示分 子，其两侧末端序列为5'-cac att cct cga agc cct tac aag ttt cct ag------c agc aga aac tgg caa gaa atg acg gaa gag國3'p16取其基因Exon2 —段近300bp的保守序列作为p16指示分子，其两侧末端序列为-5'-ccg atc cag gtc atg atg atg ggc agc gcc------cgg tac ctg cgc gcg get gcg ggg ggc acc-3，p53取其基因N末段较保守的近300bp序列作为p53指示分子，其两侧末端序列为5，-atg gag gag ccg cag tea gat cct agc------cct aca ccg gcg gcc cct gca cca gcc-3，结构蛋白Tubulin基因取gammal的N末段300bp序列作为内参对照指示分子，其两侧 末端序列为5，-atg ccg agg gaa atc atc acc------ctg teg gaa cat gga gga gga get ggc-3,首先定义下列序列F弓l物序列5，-cca cag gaa aca gta ttc-3， R弓i物序歹!h 5，-gac gcg cga ggc agatcg-3, la标签+El: 5，-atg tcc cct ata cta gca tgc tag-3，, El为 Bfa I。 lb标签+El: 5，-cct taa ttt tcc aat gca tgc tag-3， 2a标签+El: 5，-ctt gtg caa ccc act gtc gactag-3， 2b标签+El: 5，-aag ata ttc caa aag gtc gac tag-3， 3a标签+El: 5，-gaa aag tat gaa gag gag etc tag-3， 3b标签+El: 5，-acc ttc ate gcg tea gag etc tog-3， 4a标签+El: 5，-ggc gaa aca aag agt gec ggc tag-3， 4b标签+El: 5，-gaa act cca aac cca gec gg^JSg-3， (1)指示分子库引物及寡聚核酸标签的设计、合成1) 分子1-pRB引物la正向引物:F+la标签+Mi+pRB5'末端有意义链序列，即5，- cca cag gaa aca gta ttc+atg tcc cct ata cta gca tgc tag+ cac att cct cga age cct tac隱3， lb正向引物:^2+lb标签+H+pRB5'末端有意义链序列,即5，- atg cgc gat ate ggc+ cct taa ttt tcc aat gca tgc tag+ cac att cct cga age cct tac-3",E2为HinPl I 分子1反向引物:pRB 3'末端反意义链序列,即 5，-etc ttc cgt cat ttc ttg cca gtt tct get g-3'2) 分子2-pl6引物2a正向引物R+2a标签+Ei+pl6的5'末端有意义链序列,即5，- gac gcg cga ggc aga tcg +ctt gtg caa ccc act gtc gac tag+ ccg ate cag gtc atg atg -3 2b正向引物:^+2b标签+gi+pl6的5'末端有意义链序列,即5，- atg cgc gat ate gtg+ aag ata ttc caa aag gtc gac tag+ ccg ate cag gtc atg atg -3" 分子2反向引物:p16的3'末端反意义链序列，即5，-ggt gec ccc cgc age cgc gcg cag gta ccg-3，3) 分子3-p53引物3a正向引物F+3a标签+Ei+p53的5'末端有意义链序列，即5,- cca cag gaa aca gta ttc+gaa aag tat gaa gag gag etc tag+ atg gag gag ccg cag tc-3, 3b正向引物:_12+315标签+￡1+ 53的5'末端有意义链序列,即5，- gag cgc gta tac gca+ acc ttc ate gcg tea gag etc teg+ atg gag gag ccg cag tc-3" 分子3反向引物:pRB3'末端反意义链序列,即5，-ggt tgg tgc agg ggc cgc egg tgt agg -3， 4)分子4-Tubulin引物4a正向引物R+4a标签+Ei+Tubulin5，末端有意义链序列，即5,- gac gcg cga ggc aga tcg十ggc gaa aca aag agt gcc ggc t叫十atg ccg agg gaa atc atc -3， 4b正向引物:^+4b标签+H+Tubulin5'末端有意义链序列，即5，- gag cgc gta tac gtc+ gaa act cca aac cca gcc ggc tag+ atg ccg agg gaa atc atc -3" 分子4反向引物:Tubulin3'末端反意义链序列,即5，-gcc age tec tec tec atg ttc cga cag -3' 引物合成采用固相亚磷酰胺三酯法的ABI公司DNA合成仪。或商业定购合成。 合成引物是通过渗入生物素化的dNTP进行5'端生物素标记。(2) DNA反向引物交联琼脂糖凝胶颗粒溴化氰(CNBr)活化Sepharose CL- 4B购自Pharmacia公司。整个交联过程分成平行两组， 一组交联DNA反向引物的有意义链Oligo，另一组交联 DNA反向引物的反意义链Oligo。以下以一组的步聚作代表1) 称lg千活化Sepharose4B琼脂于一个15ml尖底离心管中，加10ml的1M HC1水化琼脂， 颠倒轻混l分钟，移入一个60ml的布氏漏斗中，再加500ml 1MHC1洗涤，溶胀琼脂约15 分钟。2) 用100ml dH20洗涤琼脂，再用100ml lOmM磷酸钾(PH8.0)洗涤。3) 琼脂移入一个15螺盖离心管中，加约4mll0mM磷酸钾(PH8.0)直至介质成为均匀的稠 浆。4) 立即加入50ul Oligo DNA水溶液，室温下置于转轮上混匀过夜。5) 在通风橱内，将琼脂移入布氏漏斗中，100ml dH20洗2次，100ml 1M盐酸乙醇胺(PH8.0) 洗一次。6) 琼脂移入一个15ml离心管中，加IM盐酸乙醇胺(PH8.0)至糊状，室温转轮混匀2-4小 时。7) 移至布氏漏斗，依次用lOOmllOmM磷酸钾(PH8.0)、 100mllM磷酸钾(PH8.0)、 100ml 1M氯化钾、100mldH2O洗涤琼脂。8) Oligo交联琼脂置于贮存缓冲液lOmMTris-Cl (PH7.8)力B lmM EDTA,0.3MNaCl。 两组交联物混合于4'C可稳定贮存一年。(3) DNA文库的标记扩增及吸附至捕获微球
扩增文库分子la， 模板pUHD-pRB 0.5ul 分子la正向引物0.5ul 分子1反向引物0.5ul 10 XPCR buffer 2ul 10mMdNTP 0.5ul pfU 0.5uldH20_IM20ul分子2a ， pUHD-pl6正向引物2a， 反向引物2，分子3a， pUHD-p53正向引物3a 反向引物3pUC19-tubulin扩增文库分子lb， 模板pUHD-pRB 0.5ul 分子lb正向引物l 0.5ul 分子l反向引物l 0.5ul 10 XPCR buffer 2ul 10mMdNTP 0.5ul pfii 0.5ul dH20_IM分子2b ， pUHD-pl6 正向引物2b， 反向引物2，分子3b， pUHD-p53正向引物3b 反向引物3pUC19-tubulin20ul于96孔微量反应板中PCR扩增，94"C4分钟，然后25个循环94°C 30秒.52'C 30秒，72°C40秒。然后72。C5分钟。PCR产物经Qiagen 96孔纯化板纯化。捕获微球吸附标记的DNA文库纯化的PCRDNA库混合，IOO'C加热5分钟后快速置于冰 上冷却。交联的捕获微球于66。C加入纯化的DNA库结合过夜，并洗涤3-5次，洗去未结合 的分子。(4)待测标本与微球库竞争性置换DNA:待测标本U20S细胞和pUHD-pl6转化U20S细胞的RNA纯化采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA (Chomczynski， P. et， al. 1987Anal. Biochem. Vol 162， 156)。样本于EP管中加lml的Trizole (lml 4M异硫氰酸胍，lml酚，0.1ml 2M醋酸钠PH4.0)变性液裂解，强烈漩涡振荡或用针头反复抽吸，再加200ul氯仿振荡，离心5分钟，取上清 加等量0.5ml异丙醇置-20'C2小时再离心沉淀，70%乙醇洗涤一次，加50ul DEPC处理的dH20溶解。Oligo(dT)顺磁珠纯化mRNA，按Promega说明书进行。ThecDNA逆转录采用Invi加gen 试齐U盒。cDNA第一链合成mRNA (lmg/ml)01igo(dT)12-18(lmg/ml)1MTris隱Cl(pH7.6)1MKC1205mMMgCl2dNTP(每种10mM)0.1MDTTRnase抑制剂犯20再加2ul Mo-MLV反转录酶，10ul 衡l 2.5ul 3.5ul 2.0ul 5ul 2.0ul 25umits 23ul37'C保温一小时。第二链合成向第一链反应物中直接加入 10mMMgCk 70ul 2MTris隱Cl(pH7.4) 5ul 1M(NH4)2S04 1.5ul Rnase H (1Umits/ul) l.Oul 大肠杆菌DNA聚合酶I (10umits/ul) l.Oul 于16 'C下保温4小时，再加入50mNAD l.Oul 大肠杆菌DNA连接酶(100umit/ul) l.Oul T4多聚核苷酸激酶(3umit/ul) l.Oul 室温下保温15分钟后，加入0.5MEDTA (pH8.0) 5ul终止反应。 然后样本cDNA在IO(TC加热变性10分钟，然后快速置于干冰中。 微球库首先于66'C的温充中置换试验前再洗涤三次，洗去未结合的文库分子。再升温至 9(TC变性2分钟立即移至66。C温育中。将变性的样本DNA加入微球库中66。C继续温育置换 反应1-2小时。离心，小心吸出上清(不要碰触到琼脂糖微球)。移至一新鲜的离心管中，Qiagen
微磁球(Dynal Biotech)洗涤，磁铁结合，纯化结合的标签库。(5) 标签的2联连接链亲和素磁微球纯化的寡聚核苷酸标签库9(TC加热变性5分钟，4至5热循环，9CTC30 秒，2(TC10分钟，65。Cl分钟pfu酶扩增使每一分子的一对标签3'末端互补延伸而尾-尾相 连。(6) 4联标签的扩增及串联 分子文库每个分子中一对标签尾-尾相连后，再用限制性内切酶E2-HinplI酶切纯化，用T4连接酶使分子库分子每对标签之间随机连接。或者E2酶切纯化后，92'C加热变性5分钟， 4至5个热循环，92。C30秒，26。C10分钟，68°C1分钟Tag酶扩增使分子1的一对标签与分 子2的一对标签连接，分子3与分子4，……以此类推。为防止每对标签间分子数不等，不连 游离的每对标签再用T4连接酶15'C连接过夜，形成4联标签。(7) 克隆经E3-BamHI酶切的4联标签再连接成2-6个串联的长标签插入至E3酶切的pUC19载体 (15: 2ul)再加2ullOX连接缓冲液，MT4DNA连接酶16。C过夜。连接反应转化DH5 a :取50ul感受态DH5 a ,力n 10ul连接反应液于4'C冰浴1小时，42 。C热休克45秒，加500ul新鲜LB培养基，37。C摇1小时，涂布于直径20cm的Petri LB培养板。用消毒牙签挑取数百单克隆菌落于含LB培养基的96孔培养板，每个克隆的牙签再于相 应的96孔PCR反应板(用F/R引物)的相应孔子洗一下。PCR挑选每组细胞50个阳性克隆。 (8)高通量提取质粒 采用96孔微量板高通量并行操作,Qiagen质粒微量板提取试剂盒。1) 取200ul每个阳性克隆过夜振摇的培养液于96孔微量板每个孔中，离心1000rpmX2分钟2) 细菌沉淀加Solution I 50ul,混匀,室温5-10分钟，3) 加Solution H50ul，轻混,室温不超过2-3分钟。4) 立即加Solution III 70ul，轻混，离心2500rpmX10分钟5) 上清转移至Qiagen 96孔质粒微量纯化板离心1000 rpmX2分钟,加Wash buffer 200ul，离心 洗一次，再加200ul Wash buffer离心洗第二次。6) 离心2500rpmXl分钟，除去残留洗液。7) 加每孔加10uldH20洗脱质粒。(9)高通量测序采用PE公司试剂盒。选定每组细胞20个阳性克隆质粒，荧光终止物(BigDye终止物)循环测序。1) 按每反应如下的试剂量混合，制备反应混合物如下 4ul终止核苷酸混合物2ul5X测序缓冲液 0.2ulAmpitaqFS 0.2 ulpmol引物 约200ng BAC DNA 加水至20ul体积2) 设置如下的热循环反应 1循环5min， 95 °C 20循环30s,94。C20s ,54 。C 4min ,60 。C冷却并保持4t:。3) 用Centri-Sep离心板除去过量的终止物。真空干燥样4) 加2ul甲酰胺加样缓冲液终止反应，上机。 ABI3700毛细管测序仪自动加样96通道同时测序。(10)测序分析结果 采用DNA-Star软件分析 结果标签数lalb2b3a3b4a4bU20S26250037368990pUHD-pl6 转化U20S1110106999103231U20S细胞转化前检测不到p16的2a和2b标签，pUHD-pl6转化U20S细胞后检测到大量 p16的2a和2b标签。标签指示结果与U20S转化前后p16基因变化一致，相符。
权利要求
1.一种分子置换标签测序并行检测法，其特征是包括如下步骤1)交联有捕获配体的微球，吸附标签编码的分子文库中的分子，形成标签分子微球阵列分析库；所述标签为一段与文库分子序列无关的相互独立的寡聚核酸双链DNA，所述寡聚核酸的有意义链5，端连接有生物素标记和扩增序列，寡聚核酸的3’端预设有与相应标签末端互补的序列和限制性内切酶E1识别位点，所述标签与文库分子交联，所述捕获配体为文库分子的特异性结合配体；(2)微球阵列库与待测样本混合，竞争置换带标签分子文库中的相同分子；(3)被置换出来的标签分子通过标签串联、测序检测。
2. 根据权利要求1所述的检测法，所述标签分子长度为12-100bp。
3. 根据权利要求2所述的检测法，所述标签分子长度为16-30bp。
4. 根据权利要求1所述的检测法，所述分子文库为DNA文库或蛋白质文库。
5. 根据权利要求1所述的检测法，所述标签与DNA分子交联是通过设计引物扩增交联。
6. 根据权利要求1所述的检测法，所述标签与蛋白质分子交联是通过巯基修饰DNA与 raaleimide活化蛋白质交联。
7. 根据权利要求1所述的检测法，所述微球大小为纳米级到微米级。
8. 根据权利要求1所述的检测法，所述微球材质为塑料、树脂、凝胶或其它高分子聚 合材料，所述塑料为聚乙烯、聚氯乙烯或聚苯乙烯，所述树脂为酚醛树脂、聚酯树脂或聚 酰胺树脂，所述凝胶为琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺。
9. 根据权利要求1所述的检测法，所述微球还可以是形状不规则的微粒或是具有活性 表面的平面介质。
10.根据权利要求1所述的检测法，所述标签串联、测序检测包括如下步骤(a)编码标 签为由二条互补的Oligo (寡核苷酸)组成的人造特异序列的寡聚核酸双链DNA; (b)分子 库中每个分子设计有一对不同序列的标签，每个标签有意义链的5'端标记有生物素，每对 之间3，末端部分互补，而且3'末端与分子库连接处设有限制性内切酶E1的酶切位点； (c)置换出的每对标签经El酶切后被链亲和素微磁珠纯化，经其3'末端互补聚合酶延伸而 形成二联标签；(d)分子库分子分成奇数(0dd)、偶数(Even)两组，奇数分子每对二联标 签， 一侧预先加上特异的序列F，另一侧加上0dd序列和E2酶切位点；偶数分子每对二联 标签， 一侧预先加上不同的R序列，另一侧加与Odd互补的Even序列和E2酶切位点；(e) 每对二联标签经E2酶切随机连接，或经E2酶切后Odd-Even序列互补延伸而生成四联标签。
再用F/R引物扩增4联标签，PCR产物用F/R外侧的预设E3酶切后进一步串联插入克隆载 体，克隆，阳性质粒测序。鉴定每个编码标签的种类及数量。
11.权利要求1-10任一检测法中的步骤(1)制备的标签分子微球阵列分析库和步骤(3) 中标签串联、测序的试剂。
全文摘要
本发明涉及“分子置换标签测序并行检测法——寡聚核酸编码标签分子库微球阵列分析”，属生物技术领域。本发明采用人造序列的寡聚核酸标签DNA编码分子文库，用对应的分子库配体包被微球，形成捕获微球，微球包被的捕获配体与标签编码的分子文库结合后形成标签微球阵列库。当待测标本含有与标签了的分子文库相同分子时，待测分子竞争性地与微球表面捕获配体结合，通过检测竞争置换下来的编码分子标签序列来推导待测分子的种类与多少。本发明既保证高通量的检测，同时该方法重复性好，可靠性高，而且具有很高的灵敏度。本发明尤其适合抑癌基因、癌基因文库，细胞因子库等专有遗传型或特殊功能表型文库的并行精确定性，定量分析。
文档编号C12Q1/68GK101100764SQ20071011887
公开日2008年1月9日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者洪 江, 江雨康 申请人:北京万达因生物医学技术有限责任公司