检测狂犬病病毒的核苷酸序列、检测试剂盒和检测方法

专利名称：：检测狂犬病病毒的核苷酸序列、检测试剂盒和检测方法
技术领域：
：本发明涉及检测狂犬病病毒的核苷酸序列、检测试剂盒和检测方法，尤指一种快速的荧光RT-PCR检测方法及其试剂，属于检验检疫领域。
背景技术：
：狂犬病是一种人和所有温血动物都可感染的死亡率极高的传染病，多由携带狂犬病病毒的犬、狼、猫、鼠等肉食动物咬伤或抓伤而感染，也可因吸入感染性病毒而被感染。临床表现为特有的狂躁、恐惧不安、怕风恐水、流涎和咽肌痉挛，终至发生瘫痪而危及生命。已感染狂犬病毒未发病的动物同样可作为病原贮存宿主传播狂犬病。我国是世界上人狂犬病高发区之一，也是世界上记载本病最早的国家之一。自建国后国家把人狂犬病列为乙类传染病加以管理，自1951年开展全国性灭犬运动，狂犬病发病率大幅下降，全国只有5个省份有病例报告，每年发病40-463例。到60年代中期发病人数有所增加，每年103-1062例，70年代以后，狂犬病流行范围又呈逐年扩大趋势1971年全国14个省份有病例，到1988年发展到25个省份，每年报告4110-7028例。80年代开始，由于人用狂犬病疫苗的推广应用，使疫情逐年下降，但90年代中期以后疫情却又出现上升趋势，1996年全国狂犬病发病数为159例，1997年、1998年、1999年三年分别上升至230例、234例和341例，一些多年无狂犬病的地区又出现了人狂犬病。2001年、2002年全国发病分别是891例和1122例，2003年"非典"疫情过后，卫生部对上半年发生的27种法定重大传染病的疫情向社会进行了公布，出乎人们意料，位居病死率榜首的仍然是一个古老的疾病一一狂犬病。直至2004、2005年狂犬病疫情仍居高不下，2004年全国报告发病数2651例，与2003年相比上升30.14%，死亡率100%，病死数居我国37种法定传染病首位。2005年狂犬病死亡人数2545，死亡数在各种法定传染病中排第二。据卫生部近期透露全国21个省区2006年1—9月，累计报告狂犬病发病数2254例，较去年同期增加29.69%，已死亡2053例。发病较多的省区有贵州、广西、湖南、广东等省区。狂犬病巳经连续5个月成为造成我国死亡人数最多的传染病种。狂犬病的控制主要依赖于对本病曾地方流行地区的犬、猫进行免疫接种，以阻止其感染；此外，还要控制犬、猫的活动，在无狂犬病地区，加强对外来犬、猫的隔离检疫和免疫接种。本病根除计划中应包括消除和减少野生动物中的病原贮存宿主。在世界许多地区，人狂犬病的主要传染源是犬和猫，对犬猫加强免疫接种和减少流浪犬猫的数量仍然是控制狂犬病的最有效措施。即使对人工饲养的犬猫100%免疫，由于疫苗质量、个体差异、接种手段等不同，也会导致部分犬猫不产生免疫力或产生的免疫力不足以抵抗狂犬病病毒的侵袭，再者，唾液中已经带毒的犬猫不能因注射疫苗而阻断传染。所以，经过疫苗接种的犬猫也不是绝对安全的，如何保证犬猫特别是伴侣动物的安全，进而保证人类免受狂犬病的侵扰，关键是疫苗接种和检测。疫苗接种是构筑免疫屏障，检测是及早发现携带狂犬病病毒的动物，采取扑杀措施减少传播风险，只有这样才能从源头上控制狂犬病对人的威胁。而对犬、猫狂犬病防控的关键问题一检测，就是要采用快速准确的检测技术,加强对易感动物的监控，剔除感染动物，消除传染源，也就是说，关键检测技术问题是建立敏感、特异的用于检测犬猫狂犬病病毒和抗体的方法，生产出商品化的检测试剂并推广应用，而且特别是要对宠物的健康带毒问题予以重视。目前用于狂犬病病毒检测的快速方法包括荧光抗体检测(FAT)，免疫组化(IHC)及RT-PCR等方法。但FAT和IHC不适于活体检测，而且对于实验室接到的某些样本，常常是陈旧样本，不适于组织学检测以及FAT和IHC。此外，FAT和IHC不适于液体样本的检测，如唾液和脑脊髓液。普通聚合酶链式反应的RT-PCR方法不但可以检测活病毒核酸，也可以直接检测灭活的核酸片段，样本来源广泛，适用性好。但是这种方法操作相对繁琐而且容易污染，而且测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA或RNA的拷贝数。由于PCR的终产物的量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA或RNA的拷贝数，无法做到准确定量。近年来涌现出的荧光定量PCR技术(也称TaqMan技术)以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为了当前病毒核酸定量的主要方法，荧光RT-PCR技术具有快速、特异、敏感和较强防止交叉污染的特点，与普通RT-PCR比较，灵敏度可提高100倍左右，可检测到很微量的病毒。我们已经将其应用到了禽流感病毒、新城疫病毒、猪链球菌以及口蹄疫病毒亚洲1型的检测领域，取得了很好的技术效果。TaqMan技术的要点是在普通PCR原有一对特异性引物基础上增加特异性的荧光双标记探针。该探针结合部位位于引物结合区域的中间。探针的5'端和3'端分别标记不同的荧光素，如5'端标记的荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团(用R表示)，3'端标记的荧光素，在近距离内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团(用Q表示)。当PCR反应在退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，此时的Taq酶发挥它的5'—3'外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收。PCR进行一个循环，合成了N条新链的同时，就水解了N条探针，亦释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与PCR反应产物的量呈对应关系。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个PCR循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以PCR循环数为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线一称为扩增曲线。当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈"S"型；而当标本中不含病原体，则PCR过程不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近，称为阈值线(Threshold);而扩增曲线与阈值线交叉点的循环数称为Ct值。样本中病原体的浓度越高，Ct值就越小。以此方法测定未知标本中的病原体核酸，不仅能快速定性，还因为荧光PCR本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力，可以实现对病原体核酸的定量。本发明首次将荧光RT-PCR技术应用于狂犬病病毒检测领域，提供了针对狂犬病病毒的特异性引物序列、探针序列、试剂盒和检测方法。技术内容本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测狂犬病病毒的核苷酸序列，包括引物序列和探针序列。本发明的另一个目的是提供一种快速、准确、使用方便的检测狂犬病病毒的试剂盒。本发明的第三个目的是提供一种快速、准确、可定量检测狂犬病病毒的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案选择狂犬病病毒非编码区及N基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5'C。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5'C左右。一组检测狂犬病病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQIDNo:l至SEQIDNo:3所示的核苷酸序列。1)5'-AGTTGCAAAGCAAAAATGTAAC-3'(SEQIDNO:1)2)5，-AGCAGGGTACTTGTACTCATATTG-3'(SEQIDNO:2)3)5'-[FAM]CCYCTACAATGGATGCCGACARGATTG[TAMRA]-3，(SEQIDNO:3)其中序列l)和2)分别为正义引物和反义引物，序列3)为兼并荧光探针，探针的5'端标记报告荧光基团FAM(6—羧基荧光素)，3'端标记淬灭荧光基团TAMRA。我们采用TaqMan荧光PCR检测技术建立了狂犬病病毒检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。一种检测狂犬病病毒的试剂盒，48tests/盒，由以下组分组成1)裂解液购自INVITROGEN公司，按5ml/管进行分装，6管/盒，-20。C保存；2)RT-PCR反应液，见下表表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>10XPCR缓冲液、25mMMgCl2、2.0mMdNTP均购于Promega公司；引物和探针均委托大连宝生物生物工程有限公司合成，其中10XPCR缓冲液的组成为500mMKC1、100mMTris隱HCl(pH9.025。C)、1.0%TritonX-IOO。3)RT-PCR酶颗粒，购自AMERCIA公司，l粒/管X12管；12管/盒。4)TaqDNA聚合酶5U/uL，15uLXl管，购自Promega公司。5)DEPC水，lmLXl管；用自来水两次蒸馏，经过MilliporeMILLI-QPFPLUS纯水仪纯化，收取电阻率》18.0MQ.cm的水，Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1%，37。C搅拌处理12hr，151bf/in2(1.034X105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。6)阴性对照lmLXl管，无菌摘取SPF小鼠实质脏器，用0.01mol/LPH7.2PBS缓冲盐水制成20%悬液，7(TC作用1小时。7)阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段，具有序列表SEQIDNo.4所示的核甘酸序列。127bp目的片段基因序列(SEQIDNo.4)如下121CCCTGCT阳性对照的获得方法如下回收狂犬病病毒的RT-PCR扩增产物，获得高纯度的含有狂犬病病毒部分前导序列及部分N基因的127bp的片段，与PGEM-Teasy载体(购自Promega公司)进行连接，转化重组大肠杆菌JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒作为阳性对照，命名为PGEM-RAB。以纯化的质粒为模板，用Promega公司的RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystem-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后，即得到制备AIV阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。本方法为本领域常规方法，该阳性对照序列可人工合成或者用其他类似方法得到的质粒制备。对合成的引物和探针做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之间，即视为合格引物。从1:100稀释的狂犬病病毒培养物中提取的RNA为模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对与探针配合使用，扩增的Ct值相对较低，且升幅较高。将筛选好的引物浓度从0.1"M至0.8UM以0.1uM为间距递增，探针浓度从0.025uM至0.2uM以0.025UM递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较，从多次重复试验中发现不同浓度的引物、探针对于该阳性模板，CT值基本稳定在18.55左右，但引物浓度为0.2uM，探针浓度为0.1uM时荧光增幅相对较高，所以选定引物浓度为0.2yM，探针浓度为0.1uM作为狂犬病病毒荧光RT-PCR检测方法的引物和探针浓度。我们针对RocheLightCycler以及ABI7卯0HT荧光PCR检测仪，在42°C/30min，92°C/3min;以及92°C/10sec,45°C/30sec，72°C/60sec(5个循环)的逆转录和预扩增程序后，对该实验中对变性温度和时间、退火和延伸温度及时间进行了优化实验。扩增时，采用循环次数分别为40、45和50，比较扩增结果的Ct值，进而确定扩增的循环次数。最终确定采用扩增效果较好，耗时较短的方案为PCR反应参数92°C/5sec，55°C/10sec，72'C/20sec40个循环，每个循环结束时收集荧光。研究表明，Mg^浓度对荧光PCR扩增结果的影响较大，故应用筛选好的引物探针，将Mg"的浓度从1.5mM至6.0mM以0.5mM为间距递增，对不同Mg^浓度条件下的扩增进行了比较，结果表明Mg^浓度对荧光增量和检测的灵敏度相关，提高其使用浓度，可提高检测探针的荧光增量，但随着Mg^浓度的提高，特别是超过5mM时，在检测某些样品时，可发现曲线上漂的现象。对于狂犬病病毒检测方法，优化后的Mg2+浓度为4.0mM。我们选择Promega公司生产的Taq酶，一单位的定义74'C作用30分钟，能将10nM的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求具DNA聚合酶活性及5'—3'核酸外切酶活性，无3'—5'核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94°C1小时后仍保持50%活性。Taq酶用量(以单位U计)的优化实验模板采用狂犬病病毒培养物(1:100稀释)提取RNA反转录后进行扩增。从多次重复试验结果中选定1.25UTaq酶作为使用的Taq酶量。一种检测狂犬病病毒的方法，包括如下步骤1)提取样品RNA;2)对提取的样品RNA进行RT-PCR扩增引物序列为l)5'-AGTTGCAAAGCAAAAATGTAAC-3'(SEQIDNO:1)2)5，-AGCAGGGTACTTGTACTCATATTG-3'(SEQIDNO:2)荧光探针为3)5'-[FAM]CCYCTACAATGGATGCCGACARGATTG[TAMRA]-3，(SEQIDNO:3)扩增条件为42°C/30min，92°C/3min;92°C/10sec，45°C/30sec，72°C/60sec，5个循环；92°C/5sec，55°C/10sec，72°C/20sec40个循环，每个循环结束时收集荧光；3)测定RT-PCR反应体系的荧光强度，判断样品中是否存在狂犬病病毒；阴性，无CY值并且无扩增曲线，表明样品中无狂犬病病毒；阳性，6Y值《30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在狂犬病病毒。所述步骤1)提取样品RNA前需要对样品进行处理，方法是对于组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品l.Og于研钵中充分研磨，再加5mLPBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。对于液体样本，用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。采集或处理的样本在2°C8'C条件下保存应不超过24h;若需长期保存，须放置-70"C冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。所述步骤1)提取样品RNA的方法为(在样本处理区进行)取n个1.5ml灭菌离心管(n=样本数+l管阴性对照+l管阳性对照)，作好标记。首先加入600ul裂解液(裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干)，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul(—份样本换用一个吸头)；再加入200ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。12,000g离心15min(如有条件，于4'C进行离心)。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400ul异丙醇(一2(TC预冷)，作好标记。吸取上述各管中的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600ul75%乙醇(一20。C预冷)，颠倒洗涤。12，000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4，OOOg离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3tnin(不宜过于干燥，以免RNA不溶)。加入llulDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA,2，000g离心5sec，冰上保存备用(注意此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增)。所述步骤2)对提取的样品RNA进行RT-PCR扩增具体操作为从试剂盒中取出RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n(n二样本数+l管阴性对照+l管阳性对照)，每个测试反应体系需要15ulRT-PCR反应液和O.25ulTaq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15ul，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10ul，盖紧管盖，于400g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置——第一阶段，预变性42°C/30rain，92°C/3min;——第二阶段，92°C/10sec，45°C/30sec72°C/lmin5个循环；一一第三阶段，92tV5s，55°C/10s，72。C/20sec40个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。所述步骤3)测定RT-PCR反应体系的荧光强度，判断样品中是否存在狂犬病病毒的方法是阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无CY值并且无扩增曲线。阳性对照的G值应《30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无狂犬病病毒；阳性，"值《30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在狂犬病病毒o本发明的优点是本发明选择狂犬病病毒非编码区和N基因编码区作为靶区域，设计引物和探针建立并优化了狂犬病病毒荧光RT-PCR检测方法，取得了优异的技术效果，不仅适用于对人和动物组织样本中狂犬病病毒的准确检测，还可适用于人和动物活体样本(皮肤活组织，唾液及脑脊髓液)的检测，可广泛用于国内伴侣动物狂犬病病毒筛査，出入境伴侣动物检疫以及人狂犬病的实验室快速检测1)快速该方法对PCR产物进行实时监控，RT-PCR结束即可获得结果，将传统检测方法的27天检测时间縮短为4个小时。2)灵敏由于釆用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高1001000倍；用所建立的方法对以10倍梯度稀释的狂犬病病毒CVS株小鼠脑毒进行检测，结果表明稀释到10—M咅均检出为阳性。3)特异由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统RT-PCR方法；建立的狂犬病病毒荧光RT-PCR检测方法在检测所收集的其他伴侣动物病原，结果为阴性，未发现交叉反应；4)稳定重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；5)不易污染全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，不以任何方式限制本发明。凡是依照本发明公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为狂犬病毒荧光RT-PCR检测方法的检测极限测定结果。图2为采用病毒分离结合荧光抗体检测技术的检测极限结果。图3为对病毒RNA进行相对定量的结果。图4为狂犬病毒荧光RT-PCR检测方法的特异性试验结果。图5为狂犬病毒荧光RT-PCR方法对人工感染SPF小鼠组织脏器的检测结果。图6为狂犬病毒普通RT-PCR方法对人工感染SPF小鼠组织脏器的检测结果。图7采用荧光RT-PCR对商品化疫苗和临床样品(126)的检测结果。图8采用荧光RT-PCR对临床样品(2764)的检测结果。具体实施例方式实施例l:试剂盒的配制和使用1.试剂盒的配制组成，见表2。表2:试剂盒配制组成<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.试剂盒的使用方法1)DNA提取:取n个1.5ml灭菌离心管(n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，作好标记。首先加入600ul裂解液(裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干)，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul(—份样本换用一个吸头)；再加入200ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。12，000g离心15min(如有条件，于4。C进行离心)。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400ul异丙醇(一20。C预冷)，作好标记。吸取各管中的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。12，000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600ul75%乙醇(一2(TC预冷)，颠倒洗涤。12，OOOg离心lOniin。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4，OOOg离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min(不宜过于干燥，以免RNA不溶)。加入llulDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2，000g离心5sec，冰上保存备用(注意此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增)。2)扩增试剂准备与配制从试剂盒中取出RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2，000g离心5sec。设所需PCR管数为n(n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系需要15ulRT-PCR反应液和0.25ulTaq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15ul，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10ul，盖紧管盖，于400g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置——第一阶段，预变性42。C/30min，92°C/3min;——第二阶段，92。C/10sec，45°C/30sec72°C/lmin5个循环——第三阶段，92°C/5s，55°C/10s，72°C/20sec40个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。3)结果判定结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无G值并且无扩增曲线。阳性对照的6Y值应《30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无CY值并且无扩增曲线，表明样品中无狂犬病病毒；阳性，G值《30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在狂犬病病毒。实施例2:试剂盒的灵敏度试验及用于病毒RNA的相对定量1.材料方法研究过程中应用到的病毒株为本实验室保存的古典狂犬病毒标准株CVS(6.331gLD50/0.03ml)。2.方法1)将标准株CVS株狂犬病病毒小鼠脑毒作10"、l(T2、l(T3、l(T4、l(T5、l(T6、10'7、l(T8、10—9、10_1()倍稀释，进行狂犬病病毒荧光RT-PCR检测，同时将各个稀释度的小鼠脑毒接种BHK21细胞系，37'C培养72小时后，用预冷的无水乙醇过夜固定后，用狂犬病荧光抗体进行染色，37'C染色2h，用倒置荧光显微镜观察拍照，比较两种方法的灵敏度。2)病毒RNA的相对定量为实现对临床样品中病毒RNA量的相对定量，我们进一步对连续IO倍稀释的病毒RNA样品进行检测，对Ct值和样品中病毒RNA的量进行线性回归，计算相关系数。3.结果1)见图1和图2所示，将灭活的狂犬病病毒培养物作IO倍系列稀释，运用优化后的条件分别用两种检测方法进行检测，试验结果显示对于标准株CVS株小鼠脑毒，建立的检测方法的检测极限可达10—8，图2为狂犬病病毒检测方法的灵敏度检测结果。而采用BHK21细胞系，37C培养72小时后，进行荧光抗体染色，灵敏度仅能达到10-5。2)病毒RNA的相对定量为实现对临床样品中病毒RNA量的相对定量，我们进一步对连续IO倍稀释的病毒RNA样品进行检测，对Ct值和样品中病毒RNA的量进行线性回归，计算相关系数。结果显示，病毒RNA的量与试验测得的Ct值呈线性相关，R2-0.99111193，表明建立的方法可用于病毒RNA量的相对确定，如图3所示。实施例3:试剂盒的特异性试验1.材料表3:方法研究过程中应用到的病毒株病毒来源犬I型腺病毒本实验室保存犬细小病毒本实验室保存犬瘟热病毒本实验室保存2.方法用所建立的方法对犬常见的各种病毒(包括犬瘟热病毒，犬细小病毒，犬I型腺病毒)进行检测，以验证方法的特异性。3.结果如图4所示，用所建立的方法对常见的犬各种病毒(包括犬瘟热病毒，犬细小病毒，犬I型腺病毒)进行检测，结果表明所建立的方法与上述病毒无交叉反应，特异性良好。实施例4:试剂盒对人工感染小鼠组织脏器的检测试验1.材料方法研究过程中应用到的病毒株为本实验室保存的古典狂犬病毒标准株cvs(6.331gLD50/0.03ml)。2.方法于生物安全3级实验室内，对10只小鼠，经脑内接种狂犬病病毒标准株后(6.331gLD50/0.03ml)，结果显示小鼠于接种后5天开始发病，表现为运步失调，肌肉震颤，最后麻痹。感染10天后，人工致死未死小鼠，无菌摘取心、肝，脾，肺，肾，脑，目艮，皮肤，制成20%的悬液，取200ul提取RNA，分别用研制的试剂盒和文献报道的普通RT-PCR进行检测。3.结果如图5和图6所示，结果显示采用荧光RT-PCR进行检测时，所有样品均为阳性，而且不同组织含毒量不同，各个组织含毒量由高到低的排列顺序为脑，眼，肺，肾，心脏和皮肤，肝脏和脾脏；对于同样的样本，采用RT-PCR进行检测，心，肝，脾，肺，脑，肾，眼为阳性，皮肤为阴性。实施例5:狂犬病病毒荧光RT-PCR试剂盒的批间、批内可重复性试验为对该试剂盒批间、批内重复性进行综合考核，我们选择三批合格试剂进行了批间、批内可重复性试验。1.实验材料试剂狂犬病病毒荧光RT-PCR试剂盒3批，批号200612001、200612002、200612003。检测仪器全自动荧光PCR检测仪ROCHE公司产品，型号，LightCyclerII。检测样本将狂犬病病毒CVS株小鼠脑毒作10'3、l(T4、10's倍稀释后，分别命名为D1、D2、D3，连续三次分别用狂犬病病毒荧光RT-PCR检测方法进行批间、批内重复性试验。2.实验内容每批试剂均对狂犬病病毒CVS株小鼠脑毒的3个稀释度进行3次荧光RT-PCR检测，每次每一样本检测IO份复管，然后根据以上数据计算试剂盒的批内、批间误差。检测结果要求同一样本的批内、批间CV值《10X3.实验结果根据表4结果可见200612001、200612002、200612003三个批号的"狂犬病病毒荧光RT-PCR检测试剂盒"对每一样本各10份复管的重复性检测，同一批号、同一次检测结果的CV值均小于10%,说明该试剂盒同批试剂同时检测具有很好的重复性。表4:三批试剂盒批内、批间重复性试验数据<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>根据表5结果可见200612001、200612002、200612003三个批号的"狂犬病病毒荧光RT-PCR检测试剂盒"对三份样本的重复性检测，同一批号、各自三次检测结果之间的CV值均小于10X，说明该试剂盒同批试剂、不同时间的检测结果也具有很好的重复性。表5:三批试剂盒各自批内重复性试验数据<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>根据表6结果可见200612001、200612002、200612003三个批号的"狂犬病病毒荧光RT-PCR检测试剂盒"对三份样本的重复性检测，三批号试剂、各自三次检测结果之间的CV值均小于10%，说明该试剂盒不同批次试剂、不同时间的检测结果也具有很好的重复性。表6:三批试剂盒批间重复性试验数据<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>根据以上试验数据及统计分析，该试剂盒批内、批间重复性结果的cv值均小于10%，说明具有很好的批内、批间重复性。实施例6:对临床样品及商品化疫苗检测的实验报告1.材料北京观赏动物医院提供的64份犬唾液样品；以及四种商品化疫苗(美国富道狂犬病灭活疫苗RabvacTM3，国家农业部百司特5联弱毒活疫苗，IntervetNobivac犬猫狂犬病灭活疫苗以及Rabisin-R瑞贝康狂犬病疫苗)。2.方法对于这64份临床样品，分成2份，1份采用荧光RT-PCR检测方法进行检测，另一份采用病毒分离结合荧光抗体染色进行检测(采用BHK-21单层细胞进行病毒分离，接种72h后采用荧光抗体染色)，比较两种方法的检测结果。对于商品化疫苗，直接提取RNA进行荧光RT-PCR检测。3.结果检测结果见表7、图7和图8。在本研究中，我们将建立的方法初步用于临床样品的检测，样品均为北京观赏动物医院提供的64份犬唾液样品，结果显示与病毒分离结合荧光抗体试验结果完全一致。对四种商品化疫苗的检测结果显示，美国富道狂犬病灭活疫苗RabvacTM3，国家农业部百司特5联弱毒活疫苗和IntervetNobivac犬猫狂犬病灭活疫苗为阳性，而Rabisin-R瑞贝康狂犬病疫苗的检测结果为阴性。_表7:64份临床样品的检测结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>序列表<110>中华人民共和国北京出入境检验检疫局<120>检测狂犬病病毒的核苷酸序列、检测试剂盒和检测方法<130><160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>1agttgcaaagcaaaaatgtaac22<210>2<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>2agcagggtacttgtactcatattg24<210>3<211>27<212>DNA<213>人工合成<400>3ccyctacaatggatgccgacargattg27<210>4<211>127<212>DNA<213〉人工合成<400>4agttgcaaagcaaaaatgtaacacctctacaatggatgccgacaggattgtattcagagc60taataatcaggtggtctctttgaggcctgagattatcgctgatcaatatgagtacaagta120ccctgct12权利要求1.一组检测狂犬病病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQIDNo1至SEQIDNo3所示的核苷酸序列，其中序列SEQIDNo1和SEQIDNo2分别为正义引物和反义引物，序列SEQIDNo3为荧光探针。2.根据权利要求1所述的检测狂犬病病毒的核苷酸序列，其特征在于SEQIDNo:3的5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团TAMRA。3.—种检测狂犬病病毒的试剂盒，48tests/盒，由以下组分组成-1)裂解液5ml/管，6管/盒，-2(TC保存；2)RT-PCR反应液，750uLXl管，包括IOXPCR缓冲液、25mMMgCL2、2.0mMdNTP、引物1、引物2和探针；3)RT-PCR酶颗粒，l粒/管X12管；4)TaqDNA聚合酶5U/uL，15uLXl管；5)DEPC水，lmLXl管；6)阴性对照lmLXl管无菌摘取SPF小鼠实质脏器，用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲盐水制成20%悬液，7(TC作用1小时；7)阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段，具有序列表SEQIDNo:4所示的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的一种检测狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于所述引物序列为序列表SEQIDNo:l和SEQIDNo:2所示的核苷酸序列。5.根据权利要求3所述的一种检测狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于所述探针序列为序列表SEQIDNo:3所示的核苷酸序列，其5'端标记报告荧光基团FAM，3，端标记淬灭荧光基团TAMRA。6.—种检测检测狂犬病病毒的方法，包括如下步骤1)提取样品RNA;2)对提取的样品RNA进行RT-PCR扩增引物序列为1)5'-AGTTGCAAAGCAAAAATGTAAC-3'2)5，國AGCAGGGTACTTGTACTCATATTG-3'荧光探针为5'-[FAM]CCYCTACAATGGATGCCGACARGATTG[TAMRA〗-3'扩增条件为42°C/30min，92°C/3min;92°C/10sec，45°C/30sec，72。C/60sec，5个循环；92°C/5sec，55°C/10sec，72°C/20sec40个循环，每个循环结束时收集荧光；3)测定RT-PCR反应体系的荧光强度，判断样品中是否存在狂犬病病毒；阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无狂犬病病毒；阳性，Ct值《30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在狂犬病病毒。全文摘要本发明公开了检测狂犬病病毒的核苷酸序列、检测试剂盒和方法，属于检验检疫领域。一组检测狂犬病病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQIDNo1至SEQIDNo3所示的核苷酸序列，其中序列SEQIDNo1和SEQIDNo2分别为正义引物和反义引物，序列SEQIDNo3为荧光探针。本发明的优点是1)快速将传统检测方法的2～7天检测时间缩短为4个小时；2)灵敏对以10倍梯度稀释的狂犬病病毒CVS株小鼠脑毒进行检测，结果表明稀释到10^-8倍均检出为阳性3)特异建立的狂犬病病毒荧光RT-PCR检测方法在检测所收集的其他伴侣动物病原，结果为阴性，未发现交叉反应；4)稳定重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；5)不易污染全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。文档编号C12N15/11GK101113479SQ20071011883公开日2008年1月30日申请日期2007年6月12日优先权日2007年6月12日发明者乔彩霞,凌凤俊,丹吴,琦周,张向东,张鹤晓,柏亚铎,段生涛,琳汪,强谷,赖平安,凤陈,高志强申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局