专利名称：一种筛选猪抗病育种的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种筛选猪抗病育种的方法，通过判断猪ifr7基因5'调控区的突变位点的多态性来进行选种，并人为的应用该突变位点实现优良育种。
背景技术：
1^ A (Myxovirus resistance protein 1， Mx 1) Mi^JtM (IFN) 导蛋白之一，该蛋白具有抗多种病毒的活性。Mxl是由I型干扰素(IFNci/β)诱导细胞所产生的78000 u的抗病毒蛋白，是继发现由IFN诱导细胞产生2. 5 A寡腺苷酸合酶和蛋白酶之后发现的新型抗病毒蛋白。哺乳动物中，Mx家族中具有抗病毒作用的称为JfrJ或ifr7， 分布于细胞的胞浆内，这种胞浆蛋白可直接发挥对流感病毒和滤泡性口腔炎病毒(VSV)的抗病毒效应，而Mx2或ifri 未发现有抗病毒活性。研究证明，ifr7蛋白在体内外均能独立发挥抗病毒活性，并且无需IFN的诱导和协同。体外实验表明，哺乳动物单核细胞在受到人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后ifr7表达不依赖于IFN的存在。Mxl蛋白属于大分子GTP酶发动蛋白超家族。U蛋白在氨基末端是GIPase功能区域，中段是中心活性区域(CID)，羧基末端的亮氨酸拉链序列(LZ)是效应区，LZ与GTP酶效应区的活化和功能协调有关。氨基酸末端区域包含的三联GTP结合区域高度保守，但羧基端区域的变异多。亮氨酸拉链区(LZ) 近端第612位的突变(由亮氨酸一赖氨酸)，使得ifr7(L612K)突变体丧失了自聚集和水解 GTP的能力，证明寡聚体是GTP酶活性的重要调节因子。通过突变发现，三联GTP结合区域是ifr7发挥抗病毒作用所必须的结构。对人MrJ蛋白进一步研究发现位于羧基末端附近的氨基酸决定了其抗病毒的特异性，当U蛋白的第645位的氨基酸由谷氨酸变为精氨酸时，表达ifr7蛋白的小鼠3T3细胞失去了对VSV的抵抗力，但却继续保持了对流感病毒和 Thogoto病毒的抵抗力。ifr7基因的表达与IFN mRNA水平相一致。IFN处理可剂量依赖性地抑制流感病毒在PBMCs中的复制，IFNY没有此效果，同时这种抑制效果与ifr7蛋白的水平增高相关。在持续表达ifr7的转基因细胞中，流感病毒的复制也受到抑制。结果显示
蛋白在IFN介导的宿主防御流感病毒A机制中起到重要作用。ifr7基因在抗病毒防御中的重要作用已经在小鼠模型中得以充分研究。敲除ifr7基因可导致小鼠对流感病毒的天然免疫完全丧失，引起过度感染和快速死亡。诱导ifr7表达足以使该易感小鼠获得抵抗力。 更重要的是，在对IFN无反应的动物中，持续表达ifr7可具有完全的抗病毒能力。通过分子标记确定ifr7高表达对于提高动物抗病性具有重要的育种意义。
发明内容
基于上述的原因，本发明为了筛选出猪抗病相关的基因标记，建立猪分子标记辅助育种方法，为猪抗病品种培育提供基因标记和技术方法。根据现有技术，发明人通过进一步的实验发现猪ifr7 5'调控区-567位点的275bp插入突变与其连锁的其它位点的突变在体外试验中改变了 ifr7启动子的活性，两者差异极显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。本发明提供的一种筛选猪抗病育种的方法，该方法通过测定从该动物获得的DNA 样品中ifr7基因的多态性来实现；通过多态性的测定结果，选出具有与所需特征相关的猪进行育种；
所述的多态性是与抗病毒蛋白相关的多态性。其具体方法如下
(1)猪基因组DNA的获得；
(2)以上述猪基因组DNA为模板，扩增ifr7基因5'调控区序列；
(3)鉴定ifr7基因5'调控区-567处的多态性；
其中步骤(3)中所述ifr7基因的5'调控区-567处的多态性是指此处有无一个27^p 的插入，其基因序列如SEQ ID N0:5所示的插入突变。具体的标记方法为 采用标记引物ifr7 P，包括
Mxl PF 5' -ACTGAGGTCCACTGAGGTTGTG-3‘其序列如 kq ID No 1 所示； Mxl PR 5' -CGTTGTAGGAGAAAGGTGATTT-3‘其序列如 kq ID No :2 所示； 扩增猪育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物得到大小不同的两个片段，长度相差约 275bp, PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳检测分出三种不同的带型，有片段插入的记为BB 型，有片段缺失的记为AA型，杂合子记为AB型，通过实验发现基因型为BB型的猪能提高猪抗某些病毒的能力，可见有片段插入的BB型基因型的猪具有抗病的能力，可以根据克隆得到的猪ifr7基因5 ‘调控区的DNA片段，该DNA片段是否存在一个275bp的插入突变来进行早期育种。综上所述，本发明发明人通过进一步的实验发现猪ifr7 5'调控区-567位点的 275bp插入突变与其连锁的其他位点的突变在体外试验中改变了 ifr7启动子的活性，两者差异极显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
图1为ifr7 PF和Mxl PR引物PCR扩增猪Mxl启动子片段电泳图； 图2为猪ifr7 5'调控区A与B两种基因型比较结果；
由图可知通过采用本发明所述的方法进行检测后，发现各个猪种在基因5'调控区-567处的多态性不同，而通过调查和统计可知，BB基因型较多的猪种抗病能力强。图3为不同猪种ifr7 5'调控区基因型检测结果；
由图可知此ifr7 5'调控区除27^p插入缺失不同外还存在多处其他差异，导致ifr7表达差异的突变之间存在遗传连锁，故可通过检测275bp插入缺失快速鉴别ifr7基因型； 图4为转染人肝细胞后荧光素酶检测结果；
由图可知ifr7 5'调控区A与B的启动活性并不相同，B等位基因的启动效率大于A等位基因启动效率；
图5为转染猪内皮细胞后荧光素酶检测结果， 由图同样证实了B等位基因的启动效率大于A等位基因启动效率。
具体实施例方式在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。实施例1猪ifr7 5'调控区序列的克隆测序及突变位点分析
基因组提取取猪耳组织，按照TIANamp genomic DNA (天根)试剂盒说明书进行基因组DNA提取。跟据NCBI(NCBI Reference Sequence: NC_010455. 3)设计如下引物，Jfr7 AF 基因序列如^^ ID No:3所示，Jfr7 AR基因序列如kq ID No4所示，它包含了从转录起始位点下游18bp到上游M53bp的范围，以获得序列全长后进行序列比较，寻找调控序列的差
异
权利要求
1.一种筛选猪抗病育种的方法，其特征在于该方法通过测定从该动物获得的DNA样品中ifr7基因中多态性来实现的；通过多态性的测定结果，选出具有与所需特征相关的猪进行育种；所述的多态性是与抗病毒蛋白相关的多态性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体方法如下(1)猪基因组DNA的获得；(2)以上述猪基因组DNA为模板，扩增ifr7基因5'调控区序列；(3)鉴定ifr7基因5'调控区-567处的多态性；其中步骤(3)中所述ifr7基因的5'调控区-567处的多态性是指此处有无一个27^p 的插入，其基因序列如SEQ ID N0:5所示的插入突变。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中用于扩增ifr75'调控区序列的引物为ifr7 PF其基因序列如SEQ ID N0:1所示和ifr7 PR其基因序列如SEQ ID N0:2所示。
4.应用如权利要求1和2所述育种方法，通过选取ifr7基因的5'调控区-567处有一个27^p，其基因序列如SEQ ID N0:5所示的插入突变的猪进行早期选种。
全文摘要
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种猪MX1基因5′调控区突变位点的分子标记方法及其在猪抗病育种中的应用，发明人发现不同品种猪MX15′调控区存在多处差异，其中中国地方猪种中以275bp片段插入为优势基因型，西方猪种中此种基因型频率很低。通过荧光素酶报告基因系统发现，有一段275bp插入并伴随多处突变的启动子活性显著大于另外一种启动子，可见通过检测猪基因组中Mx1调控区该275bp有无可以作为与猪抗病性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
文档编号C12Q1/68GK102304580SQ20111025519
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者姜运良, 康丽, 梁森 申请人:山东农业大学