一种评价her2靶位治疗药物及手段的体外检测方法

专利名称：一种评价her2靶位治疗药物及手段的体外检测方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法。
背景技术：
乳腺癌具有高发病率和高致命性，是女性最常见的恶性肿瘤之一。世界范围内，每年约有超过1200万的女性被确诊患有乳腺癌，严重影响着女性的健康生活。目前治疗乳腺癌仍主要依赖放疗和化疗，毒副作用较大，并且特异性差，易产生并发症状。随着乳腺癌发病理论研究的不断深入，研究人员发现乳腺癌其实是某些与细胞增殖相关的原癌基因发生突变所导致的一种复杂分子疾病。而人表皮生长因子受体2 (HEM)则是公认的与乳腺癌发病密切相关的原癌基因之一。研究表明，约25% -30%乳腺癌患者的癌细胞存在HER2的过度表达，而它的过量表达能够不断与人表皮生长因子受体家族的其他成员如HER1，HER3形成异源二聚体，通过磷酸化作用激活各种下游信号转导途径如MAPK，P13K/AKT/mT0R等，从而引起一系列的细胞反应包括促血管生成，抗凋亡，促细胞生长等，使癌细胞一直处于失控的持续增殖状态之中。基于此，HER2是研究治疗和诊断乳腺癌的一个最重要的靶分子，而围绕该靶分子所开发出的包括单克隆抗体，激酶抑制剂，反义寡核苷酸等生物治疗药物及手段也因其高效，特异性强和毒副作用较小等特点迅速引起了研究人员的高度重视和大量投入。此外，HER2的高表达在宫颈癌细胞中同样存在，因此该靶点也是研究治疗和诊断宫颈癌的重要突破口之一。在生物治疗药物及手段的开发过程中，为了便于大量具有生物活性治疗药物及手段的筛选，研究人员需要通过一种快速，高效的检测手段能够准确的评价候选治疗药物及手段的生物活性，效果及其稳定性。这种方法必须满足下列几个条件首先该法最好是体外实验，基于细胞水平，如增殖抑制，ADCC，CDC等，或基于酶促反应；其次，该方法的实验机理与药物及手段在体内的作用机理应尽可能一致，通过体外实验能够真实的反应该治疗药物及手段在体内作用的疗效，包括在细胞系的选择上也应尽量与真实病患情况接近；第三，该法必须通过方法验证，满足方法专属性，准确性，精密度以及耐用性等方面的要求，如针对同一样品检测的重复性，日间差，人员操作误差等结果的RSD应该满足小于10%。在此基础上，才能保证生物活性检测结果的可靠，并用于指导治疗药物及手段筛选工作。最后，在相同的实验条件下，该方法越简单，操作步骤越少越好，因为这样的方法更加灵活，更有利于推广，并且适用于高通量工作。以基于靶分子HER2进行生物治疗药物及手段研发为例，关于该原癌基因的作用机制已经逐渐阐明。乳腺癌细胞过量表达HER2，随之通过一系列级联反应，并最终处于失控的持续增殖状态中。根据实验设计作用机理一致性原则，研究人员通常利用该治疗药物及手段对高表达HER2细胞的体外增殖抑制作用来评价其生物活性及效果。常用的高表达 HER2的细胞系主要是人乳腺腺癌细胞SK-BR-3和人乳腺导管癌细胞BT-474。然而到目前为止，从文献报道来看，该增殖抑制的细胞学活性方法并未得到公认或标准化，例如细胞系的选择，细胞铺板密度，治疗药物及手段作用时间，显色时间以及显色方式等都各不相同。更重要的是，在已经报道的增殖抑制活性方法中，也缺乏对检测体系专属性，准确性，重复性等方面的相关评价，包括对实验结果的评价方式也存在不同，难以保证检测结果的稳定性
与可靠性。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上存在的问题与不足，提供一种在评价HER2 靶位治疗药物及手段过程中，对具有生物活性治疗药物及手段进行筛选以及稳定性评价的细胞增殖抑制生物活性检测方法。该方法能够满足方法验证过程中对专属性，准确性，精密度包括重复性，日间差，人员操作误差，以及耐用性等方面的要求，能够对大量生物活性治疗药物及手段进行快速，准确，高通量的筛选，满足治疗药物及手段在研发过程中的需求。。为此，本发明公开了一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法，包括下列步骤a取对数生长期表达HER2的细胞经酶消化后，用完全培养基制成细胞悬液，计数并计算细胞密度及活率，调整至合适的活细胞密度为η X IO5个/ml，η = 1_3，将细胞悬液等体积加入细胞培养板孔中，同时设立空白对照孔，空白对照孔被加入等体积完全培养基，然后将细胞培养板置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养过夜；b取对照品及待测样品，用完全培养基进行系列梯度稀释，得到系列稀释浓度的对照品及待测样品；c取步骤a的细胞培养板，除去上清。d将系列稀释浓度的对照品及待测样品依次等体积加入步骤a所述细胞培养板不同孔中，空白对照孔则加入等体积完全培养基，然后将细胞培养板放置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养72-74h;e采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对细胞培养板进行显色反应；f显色反应完成后，测定显色反应的结果，并根据测定结果计算待测样品的细胞增殖抑制生物活性。本发明术语“对照品”是指已公知其对表达HER2的细胞表现出细胞增殖抑制作用活性的化合物或组合物。在一些实施例中，所述及HER2靶位治疗药物是单克隆抗体、激酶抑制剂、反义寡核苷酸、化合物、中药提取物或中药复方提取物中之一或它们的任何组合，其中优选为单克隆抗体。在一些实施例中，所述对数生长期表达HER2的细胞是人乳腺腺癌细胞SK-BR-3或人乳腺导管癌细胞BT-474，其中优选人乳腺导管癌细胞BT-474。BT-474细胞相对SK-BR-3 细胞而言，对针对HER2的单克隆抗体治疗药物及手段更加敏感，治疗药物及手段对其细胞增殖抑制作用更强，这有利于扩大方法对不同活性治疗药物及手段的筛选范围。在一些实施例中，所述完全培养基是含10% FBS的RPMI1640完全培养基；在一些实施例中，所述系列梯度稀释是2倍系列梯度稀释。在一些实施例中，在步骤e中，所述检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑类化合物氧化还原检测体系、ATP总量检测体系或LDH释放量检测体系等。
在一些实施例中，所述四唑类化合物为肌1\肌5、00(-8，其中优选为00(-8。相对于其他四唑类化合物如MTT，MTS而言，CCK-8所形成的还原显色物质可直接溶于水相，无需添加DMSO助溶，因此使用更加方便，检测灵敏度也较高。在一些实施例中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板，以便于高通量地进行药物评价。本发明能够快速，准确，高效的对针对HER2靶位治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性进行检测。该方法专属性好，特异性强，准确性高，测定活性范围达到50%-150% ； 精密度高，重复性，日间差以及人员操作误差RSD均小于10%，并且双复孔的CV%小于 10%，4参数拟合的拟合常数R2均大于0. 98。此外，本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，便于推广以及高通量操作，完全能够满足其在进行具有针对HER2靶位，抑制肿瘤细胞生长，具有生物活性治疗药物及手段的筛选及其稳定性评价的需要。


图IHerc印tin及参考品4参数拟合图。图2参考品及AvastiM参数拟合图。图3细胞铺板后直接加药条件下Here印tin及参考品4参数拟合图。图4加药后细胞孵育24h条件下Here印tin及参考品4参数拟合图。图5加药后细胞孵育4 条件下Here印tin及参考品4参数拟合图。图6加药后细胞孵育条件下Here印tin及参考品4参数拟合图。图7MTT显色条件下Here印tin及参考品4参数拟合图。图8AlamarBlue显色条件下Here印tin及参考品4参数拟合图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。一、材料和试剂材料针对HER2靶位单克隆抗体药物Here印tin (产于Roche，批号B340;3)，针对 HER2靶位单克隆抗体药物参考品(嘉和生物药业制备)，针对HER2靶位单克隆抗体药物待测样品(嘉和生物药业制备)，不针对HER2靶位的单克隆抗体药物Avastin (产于Roche， 批号:B9005B02)。试剂染色液CCK-8 (Dojindo, Cat. No. CK04-20)，RPMI1640 培养基粉末(GIBC0, Cat. No. 31800-022)，链霉素 / 青霉素双抗(GIBC0, Cat. No. 15070-063)，胰蛋白酶(GIBC0， Cat. No. 25200-07)，FBS(GIBC0, Cat. No. 10099-141)，MTT 粉末(Sigma, Cat. No. M2128)， AlamarBlue(Invitrogen, Ca t. No. DALl100)。溶液配制RPMI1640培养基取1000ml烧杯，倒入RPMI 1640培养基粉末1袋，碳酸氢钠2. 0g，加入约900ml超纯水，避光磁力搅拌直至溶解，用稀盐酸调pH值至7. 00士0. 05，将溶液倒入量筒，定容至1000ml，经0. 22 μ m滤膜无菌过滤即得，分装后4°C避光保存。RPMI1640完全培养基量取胎牛血清(FBQ 50ml，加RPMI 1640培养基445ml，再加入链霉素/青霉素双抗5ml，即得，4°C避光保存。细胞株SK-BR_3细胞株(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号TCHu49)，BT-474细胞株(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号 TCHu143)二、检测方法步骤1)细胞铺板取对数生长期的BT-474细胞经胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培养基制成单细胞悬液。计数，并计算细胞密度及活率，调整活细胞密度至1. 0-3. 0 X IO5个/ ml，以100 μ 1/孔加入96孔细胞培养板中。空白对照孔则以100 μ 1/孔加入RPMI1640完全培养基。完成后将细胞培养板置于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养24- ，使细胞贴壁。2)参考品及待测样品稀释取对照品及待测样品，根据标示浓度，用RPMI1640完全培养基稀释至合适浓度，在新的96孔细胞培养板中做2倍系列梯度稀释，得到11个稀释度。3)加样取贴壁后的细胞培养板，除去上清。接着将稀释好的系列稀释浓度的对照品及待测样品以100 μ 1/孔依次加入铺好细胞的细胞培养板中，空白对照孔则以 100 μ 1/孔加入完全培养基，2-3复孔。完成后将细胞培养板放置于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养72-74h。4)显色采用CCK-8显色体系分别对细胞培养板中对照品孔，待测样品孔，空白对照孔中以1(^1/孔加入00(-8。完成后将细胞培养板放置于37°C，5%二氧化碳培养箱中继续孵育2-4h。5)读数取出细胞培养板混勻，放入酶标仪，以650nm为参比波长，在450nm下测
定对照品孔，待测样品孔及空白对照孔的OD45ch65ci，记录测定结果。6)结果分析扣除空白对照孔的OD值后，分别用对照品孔和待测样品孔OD值与加药浓度的量效关系进行4参数拟合，确定对照品与待测样品的EC5tl值，曲线拟合常数R2， 复孔CV%。按照下列公式计算待测样品的细胞增殖抑制生物活性
权利要求
1.一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法，包括下列步骤a取对数生长期表达HER2的细胞经酶消化后，用完全培养基制成细胞悬液，计数并计算细胞密度及活率，调整活细胞密度为nX IO5个/ml，将细胞悬液等体积加入细胞培养板孔中，同时设立空白对照孔，空白对照孔被加入等体积完全培养基，然后将细胞培养板置于 37°C、5%二氧化碳培养箱中培养过夜；b取对照品及待测样品，用完全培养基进行系列梯度稀释，得到系列稀释浓度的对照品及待测样品；c取步骤a的细胞培养板，除去上清。d将系列稀释浓度的对照品及待测样品以等体积依次加入步骤a所述细胞培养板孔中，空白对照孔则加入等体积的完全培养基，然后将细胞培养板放置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养72-74h;e采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对细胞培养板进行显色反应； f显色反应完成后，测定显色反应的结果，并根据测定结果计算待测样品的细胞增殖抑制生物活性。
2.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述HER2靶位治疗药物是单克隆抗体、激酶抑制剂、反义寡核苷酸、化合物、中药提取物或中药复方提取物中之一或它们的任何组合。
3.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述η= 1-3。
4.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述对数生长期表达HER2的细胞是人乳腺腺癌细胞SK-BR-3或人乳腺导管癌细胞ΒΤ-474。
5.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述对数生长期表达HER2的细胞是人乳腺导管癌细胞ΒΤ-474。
6.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述完全培养基是含10%FBS的 RPMI1640完全培养基。
7.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述系列梯度稀释是2倍系列梯度稀释。
8.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于在步骤e中，所述检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑类化合物氧化还原检测体系、ATP总量检测体系或LDH释放量检测体系等。
9.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述四唑类化合物为MTT、MTS或 CCK-8。
10.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述细胞培养板为96孔细胞培养板。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法。本发明公开了一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法，其能够快速、准确、高效的对针对HER2靶位治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性进行检测，该方法专属性好、特异性强、准确性高，活性测定范围达到50％-150％；精密度高，重复性，日间差以及人员操作误差RSD均小于10％，并且双复孔的CV％小于10％，4参数拟合的拟合常数R2均大于0.98。此外，本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，便于推广以及高通量操作，完全能够满足其在进行具有针对HER2靶位、抑制肿瘤细胞生长活性的治疗药物及手段的筛选及其稳定性评价的需要。
文档编号C12Q1/06GK102352404SQ201110254630
公开日2012年2月15日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者刘培培, 吕品, 王少雄, 裘莉娟 申请人:嘉和生物药业有限公司