专利名称：用于h5亚型禽流感病毒检测的rt-lamp引物组、检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及禽流感病毒的检测方法，尤其涉及基于RT-LAMP设计的检测H5亚型禽流感病毒的引物组，及其检测方法和应用，属于禽流感病毒的检测领域。
背景技术：
禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)为单股负链RNA，是正粘病毒科流感病毒属成员，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的囊膜糖蛋白-血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为16个HA亚型和9个NA亚型。不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza,HPAI)可引起鸡群100%死亡，被国际兽疫局确定为A类传染病。在1959-1998 年的40年间，世界范围内一共报道了 17次高致病性禽流感(HPAI)。近年在全球时见报导的主要是H5m和H7m两个亚型，其中倍受关注的是H5m。近几年来发生的高致病力禽流感疫情是由H5亚型AIV引起的有1983 1984年美国发生H5N2亚型引起的禽流感流行， 病死率近90%，死亡和扑杀家禽1700万只；1997年香港发生H5W亚型禽流感流行，宰杀了家禽150万只。2003 2004年东南亚的H5W亚型禽流感暴发，韩国、日本、台湾、越南、泰国等10多个国家和地区，我国内地广西、湖北、安徽等多个省市的某些乡镇发生H5W亚型引发的禽流感疫情，病死与宰杀的家禽已逾5000万只。尤其是1997年以来已有人类感染禽流感并致死的报道，最近，世界卫生组织最近再次确认全球已确诊153例人感染禽流感 83人死亡，造成世界对H5W的一片恐慌。因此，为了对疫情快速采取应对措施，对疑似病例做出快速有效的诊断有重要意义。目前对AIV进行快速检测的方法有IFA、ELISA、RT-PCR、 Real-time RT_PCR、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)禾口Microarray等。快速诊断和及时监测是禽流感防控的首要步骤和重要一环。目前，有关禽流感的检测方法较多，经典的流感病毒病原学诊断方法中病毒分离及其生物学特性的研究是最为可行和最能说明问题的，但病毒的分离鉴定需要将病料接种鸡胚或组织培养，需要较长的时间(几天到一周)，不能够满足急性烈性传染病紧急疫情防制工作的需要，同时由于高致病性禽流感病毒存在感染哺乳动物的潜在危险，病毒的操作需要在生物安全三级实验室进行，一般检疫部门不具备这种试验条件。快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术， 如RT-PCR，RT-PCR-ELISA，real-time RT-PCR已经在禽流感病毒检测中发挥着重要作用 (Shan, 2003 ；Collins, 2002 ；Wang，2005 ；Spackman，2003 ；Poddar, 2002)。但都需要复杂的检测仪器(如PCR仪，荧光定量PCR仪等)，在一些基层的实验室操作时受到限制。环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification Method, LAMP)技术是一种新的体外扩增特异性DNA片段的分子生物学方法(Notomi，2000)。该方法不需要额外的反转录步骤，只需要简单的水浴锅，在30-90min内即可扩增大量的核酸，不需要通过核酸电泳的方法来检测结果，只需通过其副产物-白色的焦磷酸镁沉淀来观察结果(如果加入荧光染料后会更易观察)。LAMP所具有的简单、快速、高效、实用的特点，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。该方法已经成功地应用于H5和H9亚型AIV的检测。建立一种能够灵敏、特异的H5亚型AI V的RT-LAMP检测方法的前提是需要针对H5HA基因保守区设计得到特异性引物。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种能够灵敏、特异的检测H5亚型禽流感病毒RT-LAMP 的引物组；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种用于H5亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP 引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述内引物对序列分别为SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，所述环引物对序列分别为SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。本发明还提供一种检测H5亚型禽流感病毒的方法，其特征在于使用所述的引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增。优选的，所述的扩增反应是将反应管置于PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为 62. 5°C反应lh，80°C作用IOmin结束反应。本发明的所述的RT-LAMP引物组可用于制备检测或诊断H5亚型禽流感病毒的生物试剂。本发明还涉及一种用于H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒，包括Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water，其特征在于还包括荧光检测试剂及以上所述的引物组；Reaction Mix、Enzyme Mix 和 Distilled Water 均可按照常规现有方法制备； 在本发明的一具体实施例中所述的Reaction Mix、Enzyme Mix来自RNAAmplification Kit (RT-LAMP)(购自日本荣研公司)。所述的RT-LAMP引物由一对外引物(H5-F3和H5-B3)，一对内引物(H5-FIP和 H5-BIP)和一对环引物(H5-LF和H5-LB)组成；所述外引物对序列为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述内引物对序列为SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，所述环引物对序列为 SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示；所述引物可按照现有方法制成冻干粉，PAGE纯或HPLC纯。在本发明的一个具体实施例中，所述的荧光检测试剂是Fluorescent Detection Reagent，购自日本荣研公司。本发明还提供了所述的H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒在制备检测或诊断H5亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。本发明的另一目的是提供一种上述检测H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒的使用方法，包括1、将下述组分加入到反应管中
4Reaction Mix
100 ρ mol SEQ ID No. 1 ( H5 FIP ) 100 ρ mol SEQ ID No.2 ( H5 BIP ) 10 ρ mol SEQ ID No.3 ( H5 F3 ) 10 ρ mol SEQ ID No.4 ( H5 B3 ) 100 ρ mol SEQ ID No.5 ( H5 LF )
12.5 μL 0.4 μL 0.4 μL 0.5 μL 0.5 μL 0.2 μL
100 ρ mol SEQ ID No.6 ( H5LB )0.2 pL
Enzyme mixIpL
待检测的样品RNA5.0μL
朴充Distilied Water至25 pL。2、将反应管置于PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62. 5°C反应Ih，80°C作用 IOmin结束反应；3、检测(1)直观检测反应物中加入 1. 0μ L Fluorescent Detection Reagent 染料，艮口可直接显示结果阳性反应发出绿色荧光，阴性反应保持原黄色不变；(2)琼脂糖凝胶电泳用2. 0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析阳性反应呈现特有的梯状条带，阴性反应则无条带出现。本研究选用的禽流感血凝素基因(Hemagglutinin，HA)位于病毒粒的囊膜上，由同质的三聚体组成，形成一球状的头部和细长的颈部，是唯一能产生中和抗体的抗原，诱导机体免疫系统产生保护作用，是禽流感病毒诱导机体产生保护性体液免疫反应的主要靶抗原。其主要功能是识别宿主细胞膜上的受体，介导毒粒囊膜和细胞囊膜的融合。而且它是变异最大的基因，AIV的抗原性和致病性很大程度上取决于该基因的变异情况。此外HA蛋白分子上个别关键氨基酸位点的突变，尤其是受体结合部位的氨基酸发生替换，就有可能造成毒粒致病性和传播能力的改变。所以它在AIV中具有极重要的意义，是近20年来禽流感工作者研究的热点。
图1为不同浓度底物进行RT-LAMP以及RT-PCR的敏感性扩增结果；图IA为H5-RT-LAMP扩增结果；图IB为H5-RT-PCR扩增结果；1-8所对应的病毒 RNA 浓度为分别为 10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0. 1PFU、0. 01PFU、0. OOlPFU ；图2为不同浓度的底物浓度进行RT-LAMP扩增的实时监控图显示结果；1-8 所对应的病毒 RNA 浓度为分别为 10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、 0.1PFU、0. 01PFU、0. OOlPFU ；图3为用RT-LAMP检测Hl H16亚型禽流感病毒的实时监控图显示结果；1. MD/HLJ/390/06 (HlNl) ；2. MD/HLJ/135/06 (H2N2) ；3. MD/HLJ/90/06 (H3N2)； 4. MD/HLJ/499/06(H4N6)；
5. DK/AH/1/06(H5N1) ；6.MD/HLJ/87/06(H6N1) ；7.CK/HeB/1/02(H7N2)；8. A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04 (H8N1) ；9. CK/HuN/33/08(H9N2) ； 10. MD/ HLJ/108/06(H10N2)；11. MD/HLJ/80/06(HllN2) ； 12. A/Duck/Alberta/60/76 (H12N5) ；13. A/gull/ Maryland/704/77(H13N6)；14.A/mallard/Gurjer/263/82(H14N5) ；15.A/duck/AUST/34/83(H15N8)；16. A/cormonant/Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；图4为用RT-LAMP检测Hl H16亚型禽流感病毒的特异性试验结果；1. MD/HLJ/390/06 (HlNl) ；2. MD/HLJ/135/06 (H2N2) ；3. MD/HLJ/90/06 (H3N2)； 4. MD/HLJ/499/06(H4N6)；5.DK/AH/1/06(H5N1) ；6.MD/HLJ/87/06(H6N1) ；7. CK/HeB/1/02(H7N2)；8. A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04 (H8N1) ；9. CK/HuN/33/08(H9N2) ； 10. MD/ HLJ/108/06(H10N2)；11. MD/HLJ/80/06(HllN2) ； 12. A/Duck/Alberta/60/76 (H12N5) ；13. A/gull/ Maryland/704/77(H13N6)；14.A/mallard/Gurjer/263/82(H14N5) ；15.A/duck/AUST/34/83(H15N8)；16. A/cormonant/Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；图5为用RT-LAMP检测其它禽病病毒核酸的特异性试验结果；M :DL2000DNA Marker ；1 :H5N1 ；2 鸡新城疫病毒(NDV) ；3 鸡传染性支气管炎病毒(IBV) ；4 鸡传染性法氏囊病毒(IBDV) ；5 鸡马立克氏病病毒(MDV) ；6 鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV) ；7 鸡传染性贫血病毒(CIAV) ；8 鸡白血病病毒(ALV)；图6为用RT-LAMP检测其它禽病病毒核酸的实时监控图显示结果。1 :H5N1 ；2 鸡新城疫病毒(NDV) ；3 鸡传染性支气管炎病毒(IBV) ；4 鸡传染性法氏囊病毒(IBDV) ；5 鸡马立克氏病病毒(MDV) ；6 鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV) ；7 鸡传染性贫血病毒(CIAV) ；8 鸡白血病病毒(ALV)。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例11试验材料和方法1. 1毒株和试剂本试验所用禽流感病毒Hl H16亚型标准参考毒株(购自中国兽医药品监察所)； H5亚型禽流感病毒(A/Duck/shanghai/35/2002 (H5N1))及其鸡新城疫病毒 (NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡马立克氏病病毒 (MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡白血病病毒(ALV)购自中国兽医药品监察所。RNA Amplification Kit (RT-LAMP)禾口 Fluorescent Detection Reagent，购自日本荣研公司；RNAgents Total RNA Isolation系统和Access RT-PCR系统均购自 Promega 公司。10日龄SPF鸡胚、6周龄SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供，所有SPF鸡都在负压隔离器内饲养。1. 2LAMP引物的设计和合成分析了流感数据库中H5亚型流感病毒HA基因序列的同源性，找出HA基因保守区，设计了 6个引物，分别是外引物(H5-F3(SEQ ID No. 1所示)和H5-B3 (SEQ ID No. 2 所示))，内引物(H5-FIP(SEQ ID No. 3所示)和H5-BIP (SEQID No.4所示))和环引物 (H5-LF (SEQ ID No. 5 所示)和 H5_LB(SEQ ID No. 6 所示))(表 1)。表1 RT-LAMP引物序列
权利要求
1.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别为SEQ ID No. 1 和SEQ ID No. 2所示，所述内引物对序列分别为SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，所述环引物对序列分别为SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。
2.一种检测H5亚型禽流感病毒的方法，其特征在于使用权利要求1所述的引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的扩增反应是将反应管置于PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62. 5°C反应lh，80°C作用IOmin结束反应。
4.权利要求1所述的RT-LAMP引物组在制备检测或诊断H5亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。
5.一种用于H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒，包括Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water，其特征在于还包括荧光检测试剂及权利要求1所述的引物组。
6.按照权利要求5所述的H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的荧光检测试剂是Fluorescent Detection Reagent，购自日本荣研公司。
7.权利要求5或6所述的H5亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒在制备检测或诊断 H5亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了一组用于H5亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组、检测方法及应用，所述的引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别如SEQ ID No.1、2所示，内引物对序列分别如SEQ IDNo.3、4所示，环引物对序列分别如SEQ ID No.5、6所示。本发明的引物组可用于制备H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括Reaction Mix；Enzyme Mix；Distilled Water；荧光检测试剂以及本发明的引物组。本发明检测试剂盒具有用样少、特异性强、敏感性高、快速准确等特点，为H5亚型禽流感的防控预警机制提供了简捷、有效的早期快速诊断途径。
文档编号C12Q1/68GK102337353SQ20111025524
公开日2012年2月1日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者包红梅, 王秀荣, 陈化兰 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所