专利名称：用于h9亚型禽流感病毒检测的rt-lamp引物组、检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及禽流感病毒的检测方法，尤其涉及基于RT-LAMP设计的检测H9亚型禽流感病毒的引物组，及其检测方法和应用，属于禽流感病毒的检测领域。
背景技术：
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)为单股负链RNA，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，H9N2亚型为中低致病力毒株，其特点是分布广泛，能造成宿主的免疫抑制，并且可与其它病原微生物通过协同作用弓I起禽类发病。H9N2虽然为中等低致病力毒株，但它对养禽业的危害同样不容忽视，1996-2000 年间，我国H9N2亚型禽流感的发病率占总禽流感发病率的93. 89%，成为影响我国养禽业的主要AIV亚型。自1994年在我国广东某鸡场首次分离到H9N2亚型禽流感病毒以来，H9N2 亚型禽流感在我国一直呈上升趋势，国际范围内也广泛发生。我国学者先后从不同地区不同宿主体内分离到了相同亚型的禽流感病毒。特别是1999年以来H9N2亚型禽流感病毒感染人事件的多次发生，严重威胁人类健康、畜牧业生产和畜产品国际贸易，尤其是公共卫生意义引起了全世界的广泛关注，对该亚型病毒的研究也取得了较快的进展。由于H9亚型禽流感病毒引起的轻微呼吸道症状，产蛋鸡产蛋量下降等和新城疫、 传染性喉气管炎、传染性支气管炎等禽类疾病极为相似，在临床上较难区分。为了在疫情出现后能够快速及时地作出反应，建立一种方便快捷的H9亚型禽流感病毒的检测方法具有重要的意义。禽流感的检测方法有病毒分离、血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、IFA、ELISA、 RT-PCR、Real-time、PCR、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)和微阵列芯片(Microarray)等，RT-PCR技术是研究的热点之一。快速诊断和及时监测是禽流感防控的首要步骤和重要一环。目前，有关禽流感的检测方法较多，经典的流感病毒病原学诊断方法中病毒分离及其生物学特性的研究是最为可行和最能说明问题的，但病毒的分离鉴定需要将病料接种鸡胚或组织培养，需要较长的时间(几天到一周)，不能够满足急性烈性传染病紧急疫情防制工作的需要，同时由于高致病性禽流感病毒存在感染哺乳动物的潜在危险，病毒的操作需要在生物安全三级实验室进行，一般检疫部门不具备这种试验条件。快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术， 如RT-PCR，RT-PCR-ELISA，real-time RT-PCR已经在禽流感病毒检测中发挥着重要作用 (Shan, 2003 ；Collins, 2002 ；Wang，2005 ；Spackman，2003 ；Poddar, 2002)。但都需要复杂的检测仪器(如PCR仪，荧光定量PCR仪等)，在一些基层的实验室操作时受到限制。环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification Method, LAMP)技术是一种新的体外扩增特异性DNA片段的分子生物学方法(Notomi，2000)。该方法不需要额外的反转录步骤，只需要简单的水浴锅，在30-90min内即可扩增大量的核酸，不需要通过核酸电泳的方法来检测结果，只需通过其副产物-白色的焦磷酸镁沉淀来观察结果(如果加入荧光染料后会更易观察)。LAMP所具有的简单、快速、高效、实用的特点，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。该方法已经成功地应用于H9和H9亚型AIV的检测。建立一种能够灵敏、特异的H9亚型AI V的RT-LAMP检测方法的前提是需要针对H9HA基因保守区设计得到特异性引物。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种能够灵敏、特异的检测H9亚型禽流感病毒RT-LAMP 的引物组；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种用于H9亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP 引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述内引物对序列分别为SEQ ID No. 3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对序列分别为SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。本发明还提供一种检测H9亚型禽流感病毒的方法，其特征在于使用所述的引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增。本发明的所述的RT-LAMP引物组可用于制备检测或诊断H9亚型禽流感病毒的生物试剂。本发明还涉及一种用于H9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒，包括Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water，其特征在于还包括荧光检测试剂及以上所述的引物组；Reaction Mix、Enzyme Mix 和 Distilled Water 均可按照常规现有方法制备； 在本发明的一具体实施例中所述的Reaction Mix、Enzyme Mix来自RNAAmplification Kit (RT-LAMP)(购自日本荣研公司)。其中，所述的RT-LAMP引物由一对外引物(H9-F3和H9-B3)，一对内引物(H9-FIP 和H9-BIP)和一对环引物(H9-LF和H9-LB)组成；所述外引物对序列为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述内引物对序列为SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示，所述环引物对序列为 SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。所述引物可按照现有方法制成冻干粉，PAGE纯或HPLC纯。在本发明的一个具体实施例中，所述的荧光检测试剂为Fluorescent Detection Reagent，购自日本荣研公司。本发明还提供了所述的H9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒在制备检测或诊断H9亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。本发明的另一目的是提供一种上述检测H9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测方法的使用，包括1、将下述组分加入到反应管中
4Reaction Mix12.5 pL
100 ρ mol SEQ ID No. 1 ( H9 FIP )0.4 μL
100 ρ mol SEQ ID No.2 ( H9 BIP )0.4 μL
10 ρ mol SEQ ID No.3 ( H9 F3 )0.5 μL
10 ρ mol SEQ ID No.4 ( H9 B3 )0.5 μL
100 ρ mol SEQ ID No.5 ( H9 LF )0.2 μL
100 ρ mol SEQ ID No.6 ( H9LB )0.2 μL
Enzyme Mix1.0 pL
待检测的样品RNA5.0 pL
朴充 Distilled Water 至25 pL。2、将反应管置于PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62. 5°C反应Ih，80°C作用 IOmin结束反应；3、检测(1)直观检测反应物中加入 1. Ομ L Fluorescent Detection Reagent 染料，艮口可直接显示结果阳性反应发出绿色荧光，阴性反应保持原黄色不变；(2)琼脂糖凝胶电泳用2. 0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析阳性反应呈现特有的梯状条带，阴性反应则无条带出现。本发明通过分析流感数据库中H9AIV的亚型流感病毒HA基因序列找出HA基因保守区，在此基础上设计了 RT-LAMP特异性引物。这些基因序列涵盖了多种家禽及野鸟的HA 基因，具有普遍性和代表性。利用该引物建立的RT-LAMP检测试剂盒对Hl H16亚型禽流感病毒以及鸡新城疫病毒等其他7种禽病病原进行检测，结果表明该检测试剂盒仅能特异性扩增H9亚型禽流感病毒核酸，而不能扩增其他病毒核酸，具有很好的特异性。 禽流感病毒的潜伏期从数小时到数天，最长可达21天。禽流感暴发流行初期，最先做的应该是禁止家禽在市场上的流通，实行区域封锁，并寻找病毒的来源。因此对活禽和野禽的监测显得尤为重要(Sakar et al，2010)，AIV带有囊膜，对消毒剂比较敏感，但在生产实际中，AIV常从感染禽的鼻腔分泌物中及粪便物中排出，使病毒处于有机物的保护之下，可通过空气、接触和粪便传播。据报道，试验鸡攻毒18h后即可从泄殖腔及喉头拭子中分离到病毒，持续到攻毒后第7d左右；攻毒后36h才可以从脑、肝、脾、肾、胰腺的混合样品中分离到病毒，可持续到攻毒后第IOd左右(LIA0，et al，2004)，这表明通过棉拭子可在未出现症状时即可检测到AIV，可真正做到早发现早防控。本发明通过鼻腔接种模仿自然感染，对感染后不同时间采取的棉拭子用病毒分离、RT-PCR和本发明RT-LAMP检测试剂盒进行平行检测。其中，病毒分离和H9-RT-LAMP方法在感染后第1天即可检测到病毒，第3天三种方法均可检测到病毒。但检测所需时间却不同，应用本发明RT-LAMP检测试剂盒检测病原仅需要60-30min ；病毒分离方法至少需要2_3d ；RT-PCR方法需要6_7h，用时虽短但敏感性低于本发明RT-LAMP检测试剂盒。本发明针对家禽中流行较为广泛、危害较大的H9亚型禽流感病毒的血凝素基因建立了 RT-LAMP检测方法，该方法对H9AIV RNA的最小检测限为0. 1PFU，其敏感性较常规的RT-PCR高10倍，可同时用于高致病力和低致病力H9亚型AIV的检测。通过对16个AIV亚型病毒和其他禽病毒病病原RNA的检测，表明该方法只能特异性扩增H9亚型AIV，具有良好的特异性。本发明检测试剂盒具有用样少、特异性强、敏感性高、快速准确等特点，为H9亚型禽流感的防控预警机制提供了简捷、有效的早期快速诊断途径。
图1为不同浓度底物进行RT-LAMP以及RT-PCR的敏感性扩增结果；图IA为H9-RT-LAMP扩增结果；图IB为H9-RT-PCR扩增结果；1-8所对应的病毒 RNA 浓度为分别为 1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0. 1PFU、0. 01PFU、0. 001PFU、0. 000IPFU图2为不同浓度的底物浓度进行RT-LAMP扩增的实时监控图显示结果；1-8 所对应的病毒 RNA 浓度为分别为 1000PFU、1OOPFU, 10PFU、1PFU、0. 1PFU、 0.01PFU、0. 001PFU、0. 000IPFU图3为用RT-LAMP检测Hl H16亚型禽流感病毒的实时监控图显示结果；1. MD/HLJ/390/06 (HlNl) ；2. MD/HLJ/135/06 (H2N2) ；3. MD/HLJ/90/06 (H3N2)； 4.MD/HLJ/499/06 (H4N6) ；5.DK/AH/1/06 (H5N1) ；6.MD/HLJ/87/06 (H6N1)； 7.CK/HeB/1/02(H7N2) ；8.A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04(H8N1) ；9.CK/ HuN/33/08 (H9N2) ；10.MD/HLJ/108/06 (H10N2) ；11.MD/HLJ/80/06 (H11N2) ；12.A/ Duck/Alberta/60/76(H12N5) ；13.A/gull/Maryland/704/77(H13N6) ；14.A/mallard/ Gurjer/263/82 (H14N5) ； 15.A/duck/AUST/34/83 (H15N8) ； 16.A/cormonant/ Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；图4为用RT-LAMP检测Hl H16亚型禽流感病毒的特异性试验结果；1. MD/HLJ/390/06 (HlNl) ；2. MD/HLJ/135/06 (H2N2) ；3. MD/HLJ/90/06 (H3N2)； 4.MD/HLJ/499/06 (H4N6) ；5.DK/AH/1/06 (H5N1) ；6.MD/HLJ/87/06 (H6N1)； 7.CK/HeB/1/02(H7N2) ；8.A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04(H8N1) ；9.CK/ HuN/33/08 (H9N2) ；10.MD/HLJ/108/06 (H10N2) ；11.MD/HLJ/80/06 (H11N2) ；12.A/ Duck/Alberta/60/76(H12N5) ；13.A/gull/Maryland/704/77(H13N6) ；14. A/mallard/ Gurjer/263/82 (H14N5) ； 15.A/duck/AUST/34/8 3 (H15N8) ； 16.A/cormonant/ Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；图5为用RT-LAMP检测其它禽病病毒核酸的特异性试验结果；M :DL2000DNAMarker ；1 :H9N2 ；2 鸡新城疫病毒(NDV) ；3 鸡传染性支气管炎病毒 (IBV) ；4:鸡传染性法氏囊病毒(IBDV) ；5:鸡马立克氏病病毒(MDV) ；6 鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV) ；7 鸡传染性贫血病毒(CIAV) ；8 鸡白血病病毒(ALv)；图6为用RT-LAMP检测其它禽病病毒核酸的实时监控图显示结果。1 :H9N2 ；2 鸡新城疫病毒(NDV) ；3 鸡传染性支气管炎病毒(IBV) ；4 鸡传染性法氏囊病毒(IBDV) ；5 鸡马立克氏病病毒(MDV) ；6 鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV) ；7 鸡传染性贫血病毒(CIAV) ；8 鸡白血病病毒(ALV)。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例11试验材料和方法
1.1毒株和试剂本试验所用禽流感病毒Hl H16亚型标准参考毒株(购自中国兽医药品监察所)；H9亚型禽流感病毒及其鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡白血病病毒(ALV)(购自中国兽医药品监察所)。RNA Amplification Kit (RT—LAMP)禾口 Fluorescent Detection Reagent 购自日本荣研公司；RNAgents Total RNA Isolation 系统和 Access RT-PCR系统均购自 Promega 公司。10日龄SPF鸡胚、6周龄SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供，所有SPF鸡都在负压隔离器内饲养。1. 2LAMP引物的设计和合成分析了流感数据库中H9亚型流感病毒HA基因序列的同源性，找出HA基因保守区，设计了 6个引物，分别是外引物(H9-F3(SEQ ID No. 1所示)和H9-B3 (SEQ ID No. 2 所示))，内引物H9-FIP(SEQ ID No. 3所示)和H9-BIP (SEQ ID No.4所示))和环引物 (H9-LF (SEQ ID No. 5 所示)和 H9_LB(SEQ ID No. 6 所示))(表 1)。表1 RT-LAMP引物序列
长度
引物名称类型序列(5’ to 3’) _(s)_
H9-F3 正向外引物 18-mer CAGTTCGGCTTTCTGCTG ( SEQID No. 1 )
H9-B3 反向外引物 18-mer AATGGAACACCCAACTCA ( SEQID No.2)
AGTGCAAATTGATAACATTTACCGGGGGACATTTGGGTGACAAG
「00481 H9-FIP 正向内引物 44-mer
(SEQ ID No.3 )
TGGACAACAAACACTCAAATGGCTTCATTAAAAGGGTTCGATGAG
H9-BIP 反向内引物 45-mer
(SEQ ID No.4 )
H9-LB 正向环引物 18-mer ACAATACATGATAGAATC ( SEQID No.5) H9-LF 反向环引物 22-mer ATCACATGACACATAAGGTTCT ( SEQ ID No.6)1.3RNA 提取RNA的提取采用Trizol LS试剂盒(inVitrogen公司)。病毒尿囊液或口咽泄殖腔拭子按常规处理后，取样品250ul，加750ul Trizol LS裂解液，混合震荡5分钟(尽量保证裂解后的液体透明)，加200ul氯仿，12000转，4°C离心15分钟，取上清，加500ul异丙醇， 室温沉淀10-15分钟，12000转，4°C离心15分钟，弃上清，缓慢加入75%乙醇洗沉淀一次， 倒置滤纸吸干管壁余液，真空抽干或37°C烘干，加入无RNA酶的水20ul，-70°C保存备用。
1. 4RT-LAMP 和 RT-PCR 的反应体系 H9-RT-LAMP 反应总体积为 25 μ L,组成成分如下=Reaction Mix 12. 5 μ L ；IOOpmol H9 FIP 0.4 μ L、100p mol H9 BIP 0.4 μ LUOp mol H9 F3 0. 5 μ LUOp mol H9 B30. 5μ L, IOOp mol Η9 LF 0. 2 μ L, IOOp mol Η9 LB 0. 2 μ L, Enzyme Mix 1 μ L，加入 5. OyL抽提获得的RNA到体系中，加Distilled Water至25 μ L，置于浊度仪、PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62. 5°C反应lh，80°C作用IOmin结束反应。反应物中加入1. 0μ L 的 Fluorescent Detection Reagent,艮口可直接 示结果阳性反应发出绿色荧光，阴性反应保持原黄色不变；或用2. 0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析阳性反应呈现特有的梯状条带，阴性反应则无条带出现。H9-RT-PCR的弓|物序列为H9Up :5， TCAACAAACTCCACCGAAACTGT3，；H9Low 5' TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA3，；扩增片段大小为732bp。反应总体积为25 μ L，组成成分如下5. 0 μ L 5Χ反应缓冲液、0.5yL 10M dNTPU. 0μ L 15Μ 硫酸镁、0· 25 μ L 20pmol H9 Up,0. 25 μ L20p mol Η9 Low.O. 5μ L A MV反转录酶、0. 5yL Taq DNA聚合酶、14 μ L DEPC处理的灭菌双蒸水。加入2. 5μ L RNA到体系，置于PCR仪反应，循环参数为45°C逆转录45min，94°C预变性2min， 94°C 30s,52°C 45s,68°C 45s，；35 个循环，最后 68°C延伸 &iiin。PCR 产物用 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳进行分析(Hongmei, et al，2009)。1. 5敏感性试验对测定病毒含量的H9亚型标准参考毒株(购自中国兽医药品监察所)(Garten et al,1985)的尿囊液提取核酸，将抽提所得的H9AIV总RNA进行10倍倍比稀释(分别为 1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0. 1PFU、0. 01PFU、0. 001PFU、0. 0001PFU)。对上述各浓度 RNA 用H9-RT-LAMP和H9-RT-PCR方法同时进行检测。1. 6特异性试验用该H9-RT-LAMP方法分别检测Hl H16亚型禽流感标准参考毒株，检测不同亚型病毒之间是否存在非特异性扩增。检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡白血病病毒(ALV)等其他7种禽病病原，检测 H9-RT-LAMP方法的特异性。H9AIV毒株作为阳性对照。2实验结果2. IRT-LAMP的敏感性结果由病毒含量为IO3PFU的H9RNA，进行10倍倍比稀释后用本发明的RT-LAMP检测试剂盒和RT-PCR方法进行平行检测，发现RT-PCR方法可检测IPFU滴度的病毒(图IB所示)，RT-LAMP反应的特征性阶梯状条带亮度随浓度减少有渐暗的改变(图IA所示)，最终病毒在0. IPFU时仍然可以扩增出明显的阶梯状目的条带(图IA和B)，即可敏感地检测到 0. IPFU的病毒核酸，比常规RT-PCR方法(图1B)敏感10倍，RT-LAMP扩增的实时监控图显示(如图2所示)，随着稀释度的增加，反应曲线的起始点向后逐渐推移，表明该方法对浓度的变化很敏感。2. 2RT-LAMP的特异性结果为了检测H9-RT-LAMP的引物的特异性，用RT-LAMP检测Hl H16亚型禽流感病毒标准参考毒株，结果表明仅对H9亚型禽流感病毒扩增出特征性阶梯状条带和呈现绿色荧光(如图4所示)。H9-RT-LAMP扩增的实时监控图也显示仅有H9亚型禽流感病毒有扩增曲线，其它亚型病毒则呈阴性结果(如图3所示)。同时对鸡新城疫等其他7种禽病也进行了检测，其他禽病核酸也没有扩增出特征性阶梯状条带和显示出绿色荧光(如图5所示)。，H9-RT-LAMP扩增的实时监控图也显示仅有H9亚型禽流感病毒有扩增曲线，其它禽病病毒核酸 则呈阴性结果(如图6所示)。表明本发明RT-LAMP检测试剂盒能特异性扩增 H9亚型禽流感病毒，而不与其它亚型的AIV和其它禽病病毒核酸发生交叉反应。另外，通过对加入环引物的前后进行比较发现，环引物的加入可以大大缩短反应时间，由原来的60min 可缩短为30min。
权利要求
1.一种用于H9亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别为SEQ ID No. 1 和SEQ ID No. 2所示，所述内引物对序列分别为SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，所述环引物对序列分别为SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。
2.一种检测H9亚型禽流感病毒的方法，其特征在于使用权利要求1所述的引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的扩增反应是将反应管置于PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62. 5°C反应lh，80°C作用IOmin结束反应。
4.权利要求1所述的RT-LAMP引物组在制备检测或诊断H9亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。
5.一种用于H9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒，包括Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water，其特征在于还包括荧光检测试剂及权利要求1所述的引物组。
6.按照权利要求5所述的H9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的荧光检测试剂是Fluorescent Detection Reagent，购自日本荣研公司。
7.权利要求5或6所述的H9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒在制备检测或诊断 H9亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了一组用于H9亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组、检测方法及应用，所述的引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别如SEQ ID No.1、2所示，内引物对序列分别如SEQ ID No.3、4所示，环引物对序列分别如SEQ ID No.5、6所示。本发明的引物组可用于制备H9亚型禽流感病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括Reaction Mix；Enzyme Mix；DistilledWater；荧光检测试剂以及本发明的引物组。本发明检测试剂盒具有用样少、特异性强、敏感性高、快速准确等特点，为H9亚型禽流感的防控预警机制提供了简捷、有效的早期快速诊断途径。
文档编号C12R1/93GK102329891SQ201110255250
公开日2012年1月25日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者包红梅, 王秀荣, 陈化兰 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所