专利名称：山羊绒和绵羊毛的实时荧光pcr鉴别方法
技术领域：
本发明提供了一种山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法。
背景技术：
山羊绒即通常所说的羊绒，是一种珍稀而昂贵的动物纤维。其纤维细度均勻，手感滑糯柔软而细腻，拉力强而富有弹性，素有“软黄金”之称。其羊绒制品具有极高的品质和舒适的服用性能，受到人们的喜爱，价格也很高。生产者为了降低成本，将与山羊绒外观相似的细支绵羊毛或经处理改性的绵羊毛混入织物中，使市场上出现假冒或含量降低的山羊绒纺织品，大大损伤了消费者的利益。因而有效鉴别山羊绒与绵羊毛就显得非常重要。山羊绒与绵羊毛同属蛋白质纤维，化学性质的差异不大，而仅在鳞片结构及纤维细度上有些差异，目前鉴别方法主要有光学投影显微镜法、溶液法、染色法和扫描电子显微镜法等，但存在误差较大、误判率较高，试样准备繁琐、操作复杂，带有检测者的主观判断， 结果欠客观等缺点。山羊绒和绵羊毛的准确、客观鉴别是当前检验工作中迫切需要解决的重要技术难题之一。近年来，分子生物学检测技术飞速发展，在生物学各个领域已得到广泛应用。由于不同毛类纤维的遗传物质DNA存在差异，因此可利用基于DNA基础上的分子生物学方法(如实时荧光PCR法)来鉴别区分山羊绒和绵羊毛，以达到灵敏、准确、客观的目的。据检索，国外已有采用PCR-RFLP方法来鉴别不同动物毛纤维的报道，但未见有应用其他基于DNA基础上的分子生物学方法(如实时荧光PCR法)的报道。我国虽然是进口羊毛和出口羊绒大国， 但是在山羊绒和绵羊毛分子生物学鉴别方法的研究上还是空白。我们首次建立了山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够灵敏、准确地鉴别山羊绒和绵羊毛的实时荧光 PCR方法。本发明采取的技术方案如下
本发明的一种山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法，所述方法包括提取样品 DNA;针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针；通过实时荧光PCR，对DNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增；根据扩增曲线和Ct值鉴别待测样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。用于鉴别山羊绒的引物、探针为12SG-F:5，-CGC CCT CCA AAT CAA TAA-3，、 12SG-R 5' -CTA TAG TGT ATC AGC TGC A_3，、12SG_P 5' -FAM-AAA CGT GTT AAA GCA CTA CAT C-TAMARA-3，;用于鉴别绵羊毛的引物、探针为12SS-F :5，-ATA TCA ACC ACA CGA GAG GAG AC-3M2SS-R :5，_TM ACT GGA GAG TGG GAG A_3，、12SS_P :5，-FAM_ACT AAT CCT CAT CCT CAT GC-TAMARA-3，。所述PCR 反应体系为..2XPremix Ex Taq 12. 5 μ L，50XROX Reference Dye110. 5 yL, 10 μ mol/L 引物、探针各 0.75 μ L，DNA 模板 5 μ L, ddH20 4. 75 μ L ；鉴别山羊绒的PCR反应条件为95 °C, 30 s ；95 °C，5 s，54 °C，35 s，40个循环；鉴别绵羊毛的PCR 反应条件为95 °C, 30 s ；95 °C, 5 s，52 °C，35 s，40 个循环。本发明建立的山羊绒、绵羊毛实时荧光PCR鉴别法特异性好、灵敏度高，能够满足轻纺日常检测的要求。
图1为优化前的山羊、绵羊成分的实时荧光PCR结果；其中A.绵羊成分；B.山羊成分。图2为实时荧光PCR反应体系的优化结果，其中A.绵羊成分；B.山羊成分。图3为绵羊成分的灵敏度测定结果，其中A. DNA系列稀释内参基因；B. DNA系列稀释绵羊成分；C.含量内参基因；D.含量绵羊成分。图4为山羊成分的灵敏度测定结果，其中A. DNA系列稀释内参基因；B. DNA系列稀释山羊成分；C.含量内参基因；D.含量山羊成分。图5为供试材料中山羊绒、绵羊毛的实时荧光PCR鉴别结果；其中A.内参基因； B.绵羊成分；C.山羊成分。
具体实施例方式1 试验材料
兔毛，自行收集。浅绿色毛衣料、深墨绿色毛衣料、灰色毛衣料、肉色毛衣料(标牌显示 70 %绵羊毛和30 %山羊绒)、墨绿色毛衣料(标牌显示70 %绵羊毛和30 %山羊绒)、灰色格子西装布料、灰色男西服布料、蓝色毛衣料(标牌显示纯山羊绒)、黑白灰三色毛衣料(标牌显示73. 9%绵羊毛、11. 6%山羊绒和14. 5%驼绒)均由本单位轻纺实验室收集。紫色羊绒衫料、驼毛由参加“第八届CU系列纤维细度仪应用研讨会暨目光统一交流会”代表馈赠。紫羊绒、貉子毛由国家纺织科学研究院国家纺织制品质量监督检验中心张艳研究员馈赠。其中墨绿色毛衣料、蓝色毛衣料、紫色羊绒衫料经张艳老师用纤维细度仪鉴定，墨绿色毛衣料和蓝色毛衣料同时含有绵羊毛和山羊绒，而紫色羊绒衫料的山羊绒含量很高(超过96%)，仅含少量绵羊毛。山羊绒取自内蒙农家同一头山羊，绵羊毛取自山东农家同一头绵羊，洗净、 晾干、去杂质。2主要试剂
组织和毛发DNA提取试剂盒[与DNA IQ 系统结合使用]为!Iomega公司产品。办 Ex Taq (Perfect Real Time) (2X )为宝生物工程(大连)有限公司产品。3.主要仪器与设备
电子天平、涡旋仪、瞬时离心机、超净工作台、微孔干浴器、1.5mL磁力架、实时荧光定量 PCR仪(美国ABI公司的7500)。4. 引物、探针
1，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用TE溶液(pH8. 0)稀释至lOymol/ L，-20°C保存备用。
4表1实时焚光PCR所用的引物、探针
权利要求
1.一种山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法，其特征在于所述方法包括提取样品DNA ；针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针；通过实时荧光PCRJiDNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增；根据扩增曲线和Ct值鉴别待测样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。
2.根据权利要求1所述的山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法，其特征在于用于鉴别山羊绒的引物、探针为:12SG-F :5，-CGC CCT CCA AAT CAA TAA-3，、12SG-R :5，-CTA TAG TGT ATC AGC TGC A_3，、12SG_P :5，-FAM_MA CGT GTT AM GCA CTA CAT C-TAMARA-3'； 用于鉴别绵羊毛的引物、探针为12SS-F :5，-ATA TCA ACC ACA CGA GAG GAG AC-3，、 12SS-R :5’ -TAA ACT GGA GAG TGG GAG A_3，、12SS_P :5’ -FAM-ACT AAT CCT CAT CCT CAT GC-TAMARA-3’。
3.根据权利要求2所述的山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法，其特征在于所述 PCR 反应体系为2X/￥e iz 位 Taq 12. 5 μ L, 50 X ROX Reference Dye II 0. 5 μ L, 10 μ mol/L引物、探针各0. 75 μ L，DNA模板5 μ L，ddH20 4. 75 μ L ；鉴别山羊绒的PCR反应条件为95 °C, 30 s ；95 °C, 5 s，54 °C，35 s，40个循环；鉴别绵羊毛的PCR反应条件为95 "C, 30 s ；95 "C, 5 s, 52 "C, 35 s，40 个循环。
全文摘要
本发明提供了一种山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法。所述方法包括提取样品DNA；针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针；通过实时荧光PCR，对DNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增；根据扩增曲线和Ct值鉴别待测样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。本发明建立的山羊绒、绵羊毛实时荧光PCR鉴别法特异性好、灵敏度高，能够满足轻纺日常检测的要求。
文档编号C12Q1/68GK102304579SQ201110254979
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者彭娟, 林志武, 缪婷玉, 邵碧英, 陈文炳 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心