用于牛肉中猪肉成分定量检测的组合物、试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于定量检测牛肉中猪肉成分 的等温数字化padlock-RCA-microscopy方法，用于所述方法的寡核苷酸探针组合物，以及 包含所述组合物的padlock-RCA试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肉类掺假是重要的食品检验项目。目前肉类掺假的分子生物学检测技术主要采用 PCR或实时荧光PCR技术。该技术的原理是根据动物特异性的基因片段序列、设计引物和探 针，通过聚合酶链式反应，产生针对该特异性基因片段的信号，从而判断样品中是否含有该 动物成分。这种方法在进行定量检测时，需要制备不同含量的标准样品，通过实时荧光PCR 定量曲线计算样品中目标成分的含量。由于肉品加工方式多样，样品与标准样品之间的差 异会带来巨大的误差。
[0003]目前的数字化PCR技术通过将样品DNA模板物理分隔，使每个微小的反应体系仅 包含单个模板，通过统计大数量反应体系的扩增信号，推算样品中目标模板的比例。该技术 摆脱了对标准样品的依赖，实现对样品的直接数字化检测。但该技术依赖于昂贵的数字化 PCR仪和试剂盒，而且每次实验只能检测一个或少数样品。
[0004] 利用滚环复制技术（RCA，rollingcircleamplification)检测革E核酸序列一般 具有两种途径，一种直接扩增环形单链模板，然后检测扩增信号；另一种途径利用锁式探针(padlockprobe)，锁式探针的两端与祀核酸序列特异性互补，通过连接反应环化与模板链 杂交的探针，再扩增已经环化的探针，然后检测扩增信号。
[0005]目前，国内外少见报道能同时简单、快速、特异且灵敏地检测牛肉中猪肉含量的方 法。
【发明内容】
[0006] 本申请提供了padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法，该方法采用基于 padlock探针的RCA技术，设计针对猪和牛生长激素基因的特异性padlock探针，在液相环 境中完成探针对生长激素基因序列的识别和成环连接，通过固定在玻片上的捕获探针捕获 padlock环，利用带荧光标记的检测探针进行固相RCA滚环复制，最后在显微镜下通过检测 探针的荧光标记鉴定序列。
[0007] 本发明的方法在等温条件下进行，能够实现常规操作条件下的数字化检测，同时 突破了实时荧光PCR方法受标准品限制，数字化PCR操作繁琐，仪器昂贵，通量低等瓶颈。
[0008] 在本发明的一个方面，提供了定量检测牛肉中猪肉成分的特异性牛padlock寡核 苷酸探针SEQIDNo.l(5'AGCTTTGGGCTTTAGATGCTGCTCTTCTCCAGCGATGGATGTGTTCAG3'）和 特异性猪padlock寡核苷酸探针SEQIDNo. 2(5'AACCTTGGGCTTTGGGGCTGCTCATAGACTAGTGC CAGATGGATGGGGCACC3'）。在所述两个序列的的5'端是磷酸基团。该padlock探针分别识 别牛和猪生长激素基因的DNA序列，并使其连接成环。
[0009] 在本发明的一个方面，还提供了捕获探针序列SEQID No. 3(GTACAGCAGCAGCATTGAGGAT3'）。在捕获探针5'端有连接分子，例如生物素。通过该捕 获探针，使连接成环的DNA序列富集在固相上，例如固定在玻片上。
[0010] 在本发明的一个方面，还提供了牛检测探针序列SEQID No.4(5'CAGTGAATGCGAGTCCGTCT3'）和猪检测探针序列SEQIDNo.5(5'CTAGTGCTGGATGATC GTCCUUUU-3'），在所述两种检测探针的5'端连接有不同的荧光素，例如在牛检测探针的5' 端标记FITC，在猪检测探针的5'端标记cy3。该检测序列对固相上的成环DNA序列进行 RCA滚环复制，用于在显微镜下进行进一步的观测。
[0011] 在本发明的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。
[0012] 在本发明的另一个方面，提供了用于定量检测牛肉中猪肉成分的padlock-RCA试 剂盒，所述试剂盒中包含所述寡核苷酸序列或所述组合物。
[0013] 本发明提供的试剂盒包括本发明的用于padlock-RCA方法检测牛肉中猪肉成分 的特异性padlock探针和使用说明书。在一个实施方案中，本发明的牛肉和猪肉特异性 padlock探针分别根据牛和猪的生长激素基因序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒 中包含牛padlock探针序列为padlockcow:5'AGCTTTGGGCTTTAGATGCTGCTCTTCTCCAGCGATGG ATGTGTTCAG3'（SEQIDNo. 1)，猪padlock探针序列为padlockpig:5'AACCTTGGGCTTTGGGGC TGCTCATAGACTAGTGCCAGATGGATGGGGCACC3'（SEQIDNo. 2)。在一个实施方案中，所述试剂盒 中还包含捕获探针序列：5'GTACAGCAGCAGCATTGAGGAT3'（SEQIDNo. 3)。在一个实施方案 中，所述试剂盒中还包含牛检测探针序列SEQIDNo. 4(5'CAGTGAATGCGAGTCCGTCT3'）和猪 检测探针序列SEQIDNo. 5(5'CTAGTGCTGGATGATCGTCCUUUU-3'）。在优选的实施方案中， 所述试剂盒还包括用于padlock-RCA反应的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒 的使用说明书中包括对用于定量检测牛肉中猪肉成分的padlock-RCA扩增的条件的描述。 在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的padlock探针成环连接反应条件 是：60°Clhr，捕获反应的条件是：37°Clhr，RCA扩增反应的条件是37°Clhr。在一个具体 的实施方案中，本发明的用于检测牛肉中猪肉成分的试剂盒还包括对照品。任选地，对照品 包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。
[0014] 本发明的另一个方面，提供了定量检测牛肉中猪肉成分的 padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法，所述方法使用了本发明的寡核苷酸序列、 组合物或者试剂盒。该方法能在无需标准样品，无需数字化PCR仪的情况下，对牛肉中猪肉 成分及其含量进行检测。本发明的另一个方面，提供了本发明的特异性padlock寡核苷酸 探针、本发明寡核苷酸序列、组合物或者试剂盒在检测牛肉中猪肉成分中的应用。
[0015] 所述padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法包括步骤：
[0016] 1)获得来自待测牛肉产品的总DNA样品；
[0017] 2)使用牛padlock探针序列SEQIDNo. 1和猪padlock探针序列SEQIDNo. 2进 行连接反应，获得环状DNA序列；
[0018] 3)使用捕获探针SEQIDNo. 3进行捕获反应，将环状DNA序列捕获在固相；
[0019] 4)使用牛检测探针序列SEQIDNo. 4和猪检测探针序列SEQIDNo. 5在所述固相 上进行滚环复制反应，从而扩增所捕获的序列；
[0020] 5)通过荧光显微镜检测扩增序列。
[0021] 在一个实施方案中，本发明的牛肉中猪肉成分的padlock-RCA-microscopy等温 数字化检测方法还进一步包括对所述总DNA样品进行酶切。
[0022] 在一个实施方案中，所述酶切过程使用Haelll酶。
[0023] 在一个实施方案中，padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法还包括使用图 像分析软件对扩增序列进行定量。
[0024] 在一个实施方案中，所述padlock-RCA检测方法检测出10pM浓度下猪基因模板成 分的检测限为0. 5%。在一个实施方案中，所述padlock-RCA检测方法检测猪肉和牛肉混样 中猪肉成分检测限可达到〇. 5%。
[0025] 本发明的Padlock-RCA-microscopy方法通过探针识别牛和猪基因特异序列，连 接成环后通过荧光检测探针进行RCA滚环复制，加入后在荧光显微镜下直接对牛和猪分子 扩增产物进行成像和计数，从而对样品中猪成分进行定性和定量检测。
[0026] 本发明使用一种基于padlock-RCA的技术，能够在等温条件使特异性探针与目标 序列杂交成环、复制。本发明即基于该技术原理，设计牛和猪特异性探针，优化技术条件，建 立了能够对样品中牛和猪特异性基因片段比例进行数字化检测的技术，在无需标准样品的 情况下，利用实验室常规的恒温设备及荧光显微镜，实现对多个样品的同时简单、快速、特 异且灵敏的定量检测。另外，本发明的padlock-RCA法又无需数字化PCR仪和前处理试剂 盒，极大降低成本，能同时处理多个样品，很大程度地提高方法通量。
【附图说明】
[0027] 图1是使用padlock-RCA等温数字化检测方法对合成的猪生长激素基因靶序列 (A)、牛生长激素基因靶序列（B)以及两者的混合物（C)进行检测。显微镜成像使用20倍 视野。A图是100%猪模板分子（浓度InM)。B图是100%牛模板分子（浓度InM)。C图是 猪和牛模板分子（浓度InM)等比例混合。
[0028] 图2是不同比例混合猪、牛生长激素基因靶序列模板分子时猪模板分子理论混合 比例和观测值关系曲线。观测值是利用padlock-RCA等温数字化检测方法对样品中猪和牛 模板分子进行识别和成环复制后显微镜成像的分析结果，表示一个视野下猪模板分子在所 有分子中的比例平均值。该比值