反映了样品中猪成分比例。
[0029] 图3是对猪模板分子梯度稀释后用padlock-RCA等温数字化检测方法观测到的分 子微球的图像。模板分子浓度分别为〇. 1ηΜ，0. 05nM，0.OlnM，0. 005nM，0.OOlnM。显微镜为 10倍镜。
[0030] 图4是猪模板分子数与观测到的单视野下分子微球平均数的关系曲线。
[0031] 图5是猪肉和牛肉混合样品的padlock-RCA分子微球图像，猪肉的比例分别为 50%，10% ,5%，1%，0.5%，显微镜为 10 倍镜。
[0032] 图6是猪肉比例测量值和理论值的柱状图。
【具体实施方式】
[0033] 通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实 施例。
[0034] 实施例1
[0035] 本实施例对猪和牛特异性padlock探针的特异性、灵敏度和线性相关性进行验 证。
[0036] 探针序列由美国IDT生物有限公司合成，padlock锁式探针5'端连接磷酸基团， 捕获探针5'端标记生物素，检测探针5'端标记荧光素。具体序列见下表。
[0037] 表 1
[0038]
[0039] 1.基因模板提取：
[0040] 利用美国Qiagen公司的动物组织DNA提取试剂盒，根据产品说明书肉样品中提取 总DNA。使用Haelll酶（英国NEB公司），按照产品说明书酶切所提取的总DNA。用于酶切 的50μ1体系由以下组成：10由缓冲液（5冲液），HaeIII5μ1，总DNA40μ1。37°C酶切 2h〇
[0041] 2.检测主要步骤：
[0042] 1)连接反应
[0043] 50μ1连接反应体系由以下组成：10XAmpligase缓冲液（美国Epicentre公 司）5μ1，Ampligase(美国Epicentre公司）5U,padlock探针SEQIDNO. 1、2 (101)各 1. 5ID N模板（101)0. 5D，余量为去离子水。
[0044] 反应条件为60 °C持续lh。
[0045] 通过该连接反应，使猪、牛生长激素基因的直链DNA序列成环。
[0046] 2)捕获反应
[0047] 将50μ1捕获探针SEQIDΝα3(100ηΜ)加到玻片反应孔（SurModicsIVD，美 国），室温放置30min，吸出溶液，用PBST清洗1次，加入由步骤1)获得的连接产物（每孔 加 42μ1)，37°C孵育lh，用PBST(0. 05%Tween20)清洗玻片 1 次。
[0048] 通过该捕获反应，使成环的DNA序列被固定在玻片上。
[0049] 3)滚环复制反应
[0050] 在玻片反应孔中进行滚环复制反应（RCA)。RCA反应体系由以下组成：10Xphi29 缓冲液（英国NEB公司）5μl，dNTP25mM(λ5(λ55n205U，检测探针SEQIDNα4、5(10μM) 各0. 5μ1和44μ1去离子水。将RCA体系加入步骤2)所得到的玻片的反应孔中，反应条 件为 37°Clhr。
[0051] 通过该RCA复制反应，使固相玻片上的捕获序列得到了扩增。
[0052] 4)观察
[0053] 将步骤3)处理后的玻片用PBST(0. 05%TWeen20)清洗2次，去除覆盖板，加荧光 封装剂（VectorLaboratories,Inc.，USA)后在焚光显微镜（CSWDY02,蔡司，德国）下观 察。
[0054] 3.特异性检测
[0055]按照以上1)至4)的检测步骤，对合成的猪生长激素基因靶序列（浓度InM)、牛生 长激素基因革序列（浓度InM)以及两者各InM等量混合物进行padlock-RCA-microscopy 检测。
[0056] 结果如图1所示，猪基因模板呈现大量清晰的微球结构（A，红色标记），牛基因模 板也呈现大量清晰的微球结构（C，绿色标记），猪和牛基因模板混合物呈现两种颜色标记 的清晰微球结构（B，红绿色标记）。
[0057] 该结果表明，本发明的方法可以对目标基因进行检测，微球结构良好，在显微镜下 呈现边界清晰的球状，物种之间不存在交叉反应，混合样品可以准确检测到两个物种成分， 微球比例与预期吻合。
[0058] 4.灵敏度和线性相关性检测
[0059] 按照上述基因模板制备方法提取猪总DNA和牛总DNA，浓度均为InM。制备猪和牛 总DNA的系列梯度混合物，其中猪总DNA的具体比例分别为50%、10%、5%、1 %、0. 5%。进 行上述步骤1)至4)的反应。然后，使用图像分析软件（Cellprofilerv.1)自动识别不同 颜色标记微球并计数，从而对反应产物进行定量检测。
[0060] 以混合梯度为横坐标，定量检测所获得的猪模板比例为纵坐标作曲线。结果如图 2所示。图2显示该曲线为高度线性的，最低模板比例为0. 5%，R2达到0. 99,说明该方法 可以对样品中目标基因模板进行准确定量，定量限达到〇. 5%。
[0061] 将所合成的猪生长激素基因模板从0.InM到0.OOlnM进行梯度稀释后，仅使用猪 padlock探针和检测探针进行上述步骤1)至4)的反应。通过自动识别微球并计数，对模板 绝对数量进行检测。结果如图3所示，显示最低检测限为0.OOlnM，单视野下微球数量随着 模板浓度降低有规律减少。
[0062] 将图3观测到的微球数量与基因模板数作图。如图4所示，使用图像软件（同上） 对5个视野平均值进行计算，得到横坐标为猪基因模板数量，纵坐标为单视野平均观测值 的曲线，R2达到〇. 99,说明该方法对样品中基因模板的绝对量可以进行准确计数。
[0063] 实施例2
[0064] 将猪肉和牛肉按比例混合后，确定本发明的方法的可行性、灵敏度、准确性等。
[0065] 在本实施例中，所使用的探针如表1所示，并且进行padlock-RCA-microscopy的 实验操作条件如实施例1中1)-4)步骤中所述。
[0066] 将猪肉和牛肉按不同重量比例混合，其中猪肉的比例分别为50 %、10 %、5 %、 1 %、0. 5 %。按照上述方法分别从不同比例的所述混合物中提取DNA(Qiagen，德国） 后，使用Haelll限制性内切酶进行酶切，37°Clhr。通过实施例1的步骤1)至4)进行padlock-RCA-microscopy检测。结果如图5所示，不同浓度混合肉品的显微镜图片显示检 测低限为0.5%。
[0067] 图6是对肉品中猪肉成分的定量检测结果，误差和标准误差分别为3. 8%、2. 5%、 0· 2%、0· 3%、0· 14%和 7. 6%、25%、4%、30%、28%〇
[0068] 虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到， 在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明 意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
【主权项】
1. 通过padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法检测牛肉中猪肉成分的组合 物，所述组合物包含牛padlock探针序列SEQIDNo. 1、猪padlock探针序列SEQIDNo. 2、 捕获探针序列SEQIDNo. 3、牛检测探针序列SEQIDNo. 4和猪检测探针序列SEQIDNo. 5， 其中在捕获探针序列5'端连接有生物素，在检测探针5'端连接有荧光素。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中在牛检测探针的5'端连接FITC，在猪检测探针 的5'端连接cy3。3. 用于基于padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法鉴别牛肉中猪肉成分的试 剂盒，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的组合物。4. 检测牛肉中猪肉成分的padlock-RCA-microscopy等温数字化检测方法，所述方法 包括使用权利要求1或2所述的组合物或权利要求3所述的试剂盒。5. 根据权利要求4所述的方法，包括步骤： 1) 获得来自待测牛肉产品的总DNA样品； 2) 使用牛padlock探针序列SEQIDNo. 1和猪padlock探针序列SEQIDNo. 2进行连 接反应，获得环状DNA序列； 3) 使用捕获探针SEQIDNo. 3进行捕获反应，将环状DNA序列捕获在固相； 4) 使用牛检测探针序列SEQIDNo. 4和猪检测探针序列SEQIDNo. 5在所述固相上进 行滚环复制反应，从而扩增所捕获的序列； 5) 通过荧光显微镜检测扩增序列。6. 权利要求5所述的方法，其中包括对所述总DNA样品进行酶切。7. 权利要求6所述的方法，其中所述酶切过程使用Haelll酶。8. 权利要求5所述的方法，其中包括使用图像分析软件对扩增序列进行定量。
【专利摘要】本发明涉及检测牛肉中猪肉成分的等温数字化padlock-RCA-microscopy方法。本发明还涉及用于所述方法的寡核苷酸探针组合物。本发明还涉及包含所述组合物的padlock-RCA试剂盒。使用本发明的组合物进行等温数字化检测，能够简单、快速、特异且灵敏地检测牛肉中的猪肉成分。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105274224
【申请号】CN201510689229
【发明人】吴亚君, 陈磊, 陈颖
【申请人】中国检验检疫科学研究院
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月21日