指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，是一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检 测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]肉苁蓉被称为"沙漠人参"，具有极高的药用价值，是广泛使用的中国传统的名贵 中药材，早在1，800多年前的《神农本草经》就已有记载。肉苁蓉味甘、性温，具有补肾壮阳、 增强免疫、养血润燥、延年益寿、保肝护肝等功效。肉苁蓉药食两用，在历史上就被西域各国 作为珍品上贡朝廷，也是历代补肾壮阳类处方中使用频度最高的补益药物之一。肉苁蓉的 宜食人群主要包括：体虚便秘、产后便秘、病后便秘及老年便秘者；患有男子遗精、早泄、阳 痿、精子稀少不育等病症者；妇女带下、不孕症、四肢不温、月经不调、腰膝酸痛等病症患者 以及高血压患者。忌食人群主要是经常大便溏薄者。
[0003]目前，家庭生活中，肉苁蓉主要用于泡酒、泡茶、煮粥、炖汤等，国内外都有众多的 肉苁蓉制品投放市场，有肉苁蓉优质饮片、提取物、配方颗粒、肉苁蓉胶囊、茶包、速溶茶、肉 苁蓉酒保健品等。近年来随着人民生活水平的提高和人口老龄化，人们对保健品的需求量 也越来越大，因此肉苁蓉的用量也逐年增大。但是在肉苁蓉的生药材市场中，其来源混乱， 主要药用成分差异不明确，分级开发及应用还有待提高和加强。
[0004] 肉灰蓉的主要药用成分为苯乙醇苷（Phenylethanoidglycosides,PhGs)类化合 物，随着分离提取和检测技术的飞速发展，至今已从肉苁蓉肉质茎中分离出20多种类型的 苯乙醇苷，目前，对肉苁蓉的质量评价主要是对其所含的松果菊苷和毛蕊花糖苷进行测定， 《中国药典》2010年版肉苁蓉项下也将上述两个成分定为药用价值指标。常用的测定方法 有薄层色谱（TLC)分析和高效液相色谱法（HPLC)等。但是，对于肉苁蓉苯乙醇苷含量的 检测，上述这些主要的检测方法，都需要将采挖回来的肉苁蓉，先进行至少半个月的晾干处 理，晾干后进行研磨，该过程耗时长，且实验流程繁琐、复杂。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是在生药材采挖后提供一种简单有效的快速指示肉苁 蓉生药材总苷含量范围的方法；本发明还提供一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速 检测试剂盒。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：采用实时荧光定量PCR法测 定肉苁蓉生药材中下述引物序列所扩增基因的表达值：
[0011] 其中基因SEQ2为与总苷含量呈正相关，基因SEQ1和基因SEQ3呈负相关；基因 SEQ4为内参基因。
[0012] 本发明包括下述步骤：
[0013] (1)RNA提取及cDNA反转：提取待测肉苁蓉的总RNA，RNA经纯化后进行逆转录反 应；
[0014] (2)PCR扩增：对提取RNA的SEQ1、SEQ2和SEQ3进行RT-qPCR反应，SEQ4作为内 参基因；
[0015] (3)计算总苷含量:A、将生药材分别将分为3个等级，右旗SGW~2. 5%、 G22. 5%~6. 8%和G36. 8%~14. 6%，左旗为GW~1. 2%、G21. 2%~2. 1%和G32. 1%~ 6.0% ；
[0016] B、根据PCR扩增得到的CT值，采用式（I)计算SEQ1、SEQ2和SEQ3三个基因的 ACT;记为分别与SEQ1、SEQ2、SEQ3对应的叫、n2、n3;
[0017] n.= 2 ACT= 2 (CT(所测基因）CT(内参基因）） (I)
[0018] 其中，T= 1、2、3,分别对应SEQ1、SEQ2、SEQ3 ;
[0019] C、将η!、n2、n3分别与Nu、Ni2、Ni3按照公式（Π)计算Pi;
[0021] 其中，i= 1、2、3,分别对应GpGpGy
[0022] 右旗中：Nn= 0· 04、N12= 3· 33、N13= 0· 38,N21= 0· 01、N22= 8· 02、N23= 0· 06， N21= 0、N32= 21. 33、N33= 0· 02 ;
[0023] 左旗中：Nn= 0· 02、N12= 1. 63、N13= 0· 01，N21= 0· 01、N22= 4. 50、N23= 0· 04， N21= 0、N32= 9. 64、N33= 0· 01 ;
[0024] D、比较ΡρP2、P3，总苷含量处于最小P#对应的Gi的范围内。
[0025] 本发明所述步骤（2)PCR扩增的反应条件为：95°C、2min，95°C、15s，然后56°C、 30m，72°C、30s;共 40 个循环。
[0026] 本发明试剂盒包括RT-qPCR反应液和一组引物，这组引物包括1个正相关变化基 因SEQ2的正、反向引物，2个负相关变化基因SEQ1和SEQ3的正、反向引物，1个内参基因 SEQ4的正、反向引物。
[0027] 本发明试剂盒所述RT-qPCR反应液中包括RT-qPCR反应所需的试剂盒酶。
[0028] 实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR，RT-qPCR)也称为qPCR、 qRT-PCR，其基本原理是，在PCR反应体系中加入荧光基团，通过监测反应过程中荧光信号 的不断累积来监测整个PCR过程，待反应结束后通过标准曲线对样品中的底物模板DNA进 行定量分析。CT值是每个PCR管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数，起始 拷贝数越多，CT值越小。PCR体系中每种底物模板的CT值与该模板起始拷贝数的对数存在 线性关系。由于已知标准品的起始拷贝数，可据此作出标准曲线，只要获得待测样品的CT 值，就可以通过与标准曲线比较计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR具有灵敏 度高、特异性强、检测耗时少等优势，整个过程可在2~3个小时内完成。采用该检测系统， 结合我们已有的基因表达和肉苁蓉总苷含量的关系表，即可计算转换指示待测样本的总苷 含量级别，是一种快速、有效并且操作简单的方法，整个检测过程可以缩短在一至两天内高 通量实现。
[0029] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明采用与肉苁蓉总苷含量协同 变化的基因检测，能达到对左旗和右旗肉苁蓉生药材的总苷含量进行快速指示并分级的效 果；只需提供极少量采挖出来的新鲜肉苁蓉样品，可在两天内完成检测，无需对新鲜生药材 进行晾干，大大缩短了检测周期。
[0030] 本发明采用二代测序技术及HPLC技术鉴定到三个和苁蓉总苷含量协同变化的基 因，利用实时焚光定量PCR(Real_timequantitativePCR，RT-qPCR)即可快速指示生药材 主要药用成分含量范围的快速检测方法，为肉苁蓉生药材分级、高效的产品开发等应用提 供指导及标准参考；具有特异性强、灵敏度高、高效快速的特点。
【附图说明】
[0031] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0032] 图1是本发明右旗3个基因表达与总苷含量的协同变异图；
[0033] 图2是本发明左旗3个基因表达与总苷含量的协同变异图；
[0034] 图3是本发明协同变异正相关基因引物的特异扩增曲线图；
[0035] 图4是本发明协同变异负相关基因引物的特异扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0036] 本指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒的设计过程如下所 述：
[0037] 首先，确定与肉苁蓉生药材总苷含量协同变异的基因。分别采集来自内蒙古阿拉 善盟左旗和右旗两个肉苁蓉主产地的多份肉质茎材料，分别采用高通量测序获得肉质茎的 转录本序列信息和基因表达信息，和采用高效液相色谱法（HPLC)测量获得对应肉苁蓉肉 质茎样品的总苷（松果菊苷和毛蕊花糖苷）含量。通过转录本基因表达与总苷含量的协同 变化分析，确定3个与肉苁蓉生药材总苷含量协同变化的基因。基因SEQ2为与总苷含量呈 正相关，基因SEQ1和基因SEQ3呈负相关，结果见附图1和附图2 ;协同变异正相关基因引 物的特异扩增曲线见图3,协同变异负相关基因引物的特异扩增曲线见图4。
[0038] 其次，设计三套特异性强、灵敏度高、可高效快速检测上述基因表达值的引物序 列；3个与肉苁蓉生药材总苷含量协同变异的基因的引物序列见表1，其中Left和Right分 别为正向引物序列和反向引物序列信息。
[0039] 表1:引物序列信息
[0040]
[0041] 最后，快速检测试剂盒的构建及检测方法的建立：本指示肉苁蓉生药材总苷含量 范围的快速检测试剂盒，包括RT-qPCR反应液和一组引物，这组引物包括1个正相关差异基 因（SEQ2)的正、反向引物，2个负相关差异基因（SEQ1和SEQ3)的正、反向引物，1个内参基 因（SEQ4)的正、反向引物；其中，RT-qPCR反应液还包括常规RT-qPCR反应所需的试剂盒 酶。
[0042] 本指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法的具体检测步骤如下所述：
[0043] (1)RNA提取：依照操作说明书使用TRIzol试剂盒提取肉苁蓉的总RNA，实验步骤 如下：
[0044] (A)先将研钵用液氮遇冷，每次取适量水稻叶片组织放入加有液氮的研钵中，充分 研磨组织块（成粉末状）。
[0045] (B)将研粹的粉末样品转入2mL离心管中，加入lmL的Trizol试剂悬浮，使其裂 解，再加入〇. 5ml的Trizol试剂悬浮，使其充分裂解，保存于-80°C或进行RNA提取。
[0046] (C)向上述离心管中加入300μL(l/5体积）氯仿，充分混匀（用力不要十分剧 烈），萃取去除杂蛋白，冰上静置5分钟。（注：禁用漩涡震荡器，以免基因组DNA断裂，造成 基因组DNA污染）
[0047] (D)4°C、13000转/分钟，离心15分钟，此时溶液分为三层：下层的酚-氯仿，白 色浑浊的中间相多为变性蛋白，上层的是水相（RNA所在相），转上清约900μL于另一干净 2mL离心管中。
[0048] (E)向上清中加入等体积（约900μ1)氯仿，充分混匀，室温静置5分钟。
[0049](F) 4°C、13000转/分钟，离心15分钟，转上清于另一干净2mL离心管中。
[0050] (G)加入等体积异丙醇和2μL20mg/ml糖原，充分混勾，_80°C沉淀4小时以上或 沉淀过夜。
[0051](H) 4°C、14000转/分钟，离心30分钟，弃上清，加入lmL的75%乙醇，洗涤沉淀， 4°C、14000转/分钟，离心5分钟。
[0052] (I)弃上清，室温晾干沉淀。
[0053] (J)加入适量体积（约20~50μL)RNasefree水溶解沉淀。
[0054] (K)应用琼脂糖电泳检测RNA的完整性，完整的RNA其28S亮度是18S的至少1 倍；
[0055] (L)检测 0D值：纯RNA样品的 0D260/0D280 值为 1. 9 ~2. 1。
[0056] (2)RNA的纯化：采用DNaseI(RNase-free)消化所得RNA样本中的杂质，具体步 骤如下：
[0057] (A)所得RNA每 60μ1 中依次加入 10μ1 的lOXDNaselBuffer、2μ1 的RNase Inhibitor、2μ1 的DNasel、26μ1 的NF-Water，总体积为 100μ1 ;
[0058] (B) 37°C水浴 10min，洗涤沉淀