肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒(pcr-荧光探针法)的制作方法

专利名称：肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒(pcr-荧光探针法)的制作方法
技术领域：
本发明涉及实时荧光PCR试剂盒，特别是涉及利用实时荧光PCR技术检测肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)的试剂盒。试剂盒通过对样本中的肺炎克雷伯菌进行检测，可广泛应用于肺炎克雷伯菌感染的辅助诊断。
背景技术：
肺炎克雷伯菌是临床上最常见的革兰阴性杆菌，是引起医院获得性泌尿系统感染、医院获得性肺炎和腹腔感染的重要病原体。同时，肺炎克雷伯菌也是社区获得性感染如社区获得性肺炎的潜在病原体。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)广泛分布于自然界及人和动物的胃肠道内，是临床标本中常见的细菌，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，可引起典型的原发性肺炎。肺炎克雷伯菌也能引起各种肺外感染，包括肠炎和脑膜炎(婴儿)、泌尿道感染(儿童和成人)及败血症。典型的肺炎克雷伯杆菌肺炎常发生于中老年男性、长期饮酒的慢性支气管肺病患者，有较典型的临床表现和X线征象，结合痰培养结果，不难诊断。但在有严重原发疾病基础上的发病者，临床表现多不典型，诊断较为困难。凡在原有疾病过程中出现高热、白细胞和中性粒细胞增多，X线胸片上出现新的浸润病灶，而青霉素治疗无效者应考虑本病。连续2次或2次以上痰培养阳性，或胸腔积液、血培养阳性可以确诊。多数败血症患者的白细胞总数明显增多，嗜中性粒细胞增高；但血液病患者或用抗代谢药物者白细胞数可不增加，或反有减少。利用PCR方法可以直接检测病毒核酸，灵敏度更高。2008年I月，FDA通过第一个利用多重PCR方法，基于Luminex xTAG 技术，检测包括呼吸道合胞病毒在内的多种呼吸道病毒核酸检测试剂盒(xTAG RVP试剂盒)[Mahony，J.，S.Chong,et al.(2007)." Development of a respiratory virus panel test for detectionof twenty human respiratory viruses by use of multiplex PCR and a fluidmicrobead-based assay." J Clin Microbiol 45(9):2965-70]，该方法主要是在提取病毒核酸RNA或/和DNA后，经混合逆转录，再使用14对病毒特异引物进行多重PCR ;扩增产物经处理，与含有tag序列的21对引物再进行多重靶特异引物延伸(TSPE)反应；其后，TSPE产物与标记有ant1-tag序列的带不同突光微球反应,通过Luminex 100流式细胞检测仪进行检测，记录并分析得到结果。实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。实时荧光PCR只要加入模板和特异性引物即可实现在同一反应管内进行PCR反应，中途不需加入任何试剂，在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，设置了 UNG酶+dUTP防污染措施有效地防范了 PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果，提高临床诊断依据的可靠性，并已在多个领域得到应用。与传统的PCR技术(终点检测)相比，实时定量监测方法具有如下优点:实现了低拷贝数靶多核苷酸的分析，特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点，而且实时荧光PCR可以得到更高的灵敏度，与传统的PCR技术(终点检测)技术相比，操作更简单，耗时更少，只需2小时即可完成全部检测。
本发明设计的试剂盒通过对KP核酸进行直接检测和研究，有利于加深对这种病毒的认识，不仅对于了解患病程度、预测、评价治疗效果有十分重要意义，而且使得病毒感染发病机制的研究进入量化阶段，为新药的研究与试用提供极为重要的研究手段。

发明内容
本发明的目的在于提供一种实时荧光RT-PCR方法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒(下面简称KP试剂盒)，该试剂盒包括:(I) DNA提取液；PCR检测试剂:KP PCR反应液Α、ΚΡPCR反应液B ;质控品:阴性质控品、KP阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为:(I)针对肺炎克雷伯菌保守序列设计能够与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。(2)寡核苷酸探针标记荧光发生基团，使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合。(3)适宜于RT-PCR扩增的反应体系和荧光检测体系。核酸扩增反应体系包括耐热DNA聚合酶、UDG酶、2’ -脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能 够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。(4)从待测样本中提取DNA，加入前述的反应体系中，直接PCR扩增。(5)确定荧光发生基团所产生的荧光量，分析循环扩增后产生的荧光量以确定靶多核苷酸的存在。本发明一个优选的实施方案，其中试剂盒的KP PCR反应液A由对应的PCR反应Buffer、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、纯水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5 ’ -GCGCGCACCTATTGTGTTG-3，(SEQ ID NO:1)和5’-TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3’ (SEQ ID NO:2)。根据本发明一个优选的实施方案，KP PCR反应液中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5’X-CCGTCTACACCCGGGCGCC-Y 3’ (SEQ ID NO:3)，其中X/Y表示荧光标记检测体系，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。根据本发明一个优选的实施方案，PCR检测试剂中的KP PCR反应液B包含UNG酶、热启动Taq酶和dNTPs。根据本发明一个优选的实施方案，核酸扩增反应体系由(a)耐热DNA聚合酶、(b)UDG酶、(c) 2’-脱氧核苷三磷酸、(d)能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、(e)能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、(f)能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、(g)含有镁离子的缓冲液组成。根据本发明一个优选的实施方案，阳性质控品的建立技术路线为:使用引物5，-GCGCGCACCTATTGTGTTG-3’ (SEQ ID NO:1)和引物 5，-TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3，(SEQID NO:2)定性扩增病毒核酸，扩增产物纯化后克隆至PMD18-T载体中，阳性克隆测序确定目的片段是否正确插入并确定插入方向，提取重组质粒PMD18-T-KP质粒并利用紫外分光光度计测定A260，对KP-DNA进行定量以制备相应的阳性质控品；其特征还在于阳性质控品包含下列序列或80%同源的核苷酸序列:GCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGA。根据本发明一个优选的实施方案，其中阴性质控品为生理盐水、正常人或其它病毒感染者的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液样本。根据本发明一个优选的实施方案，其中阳性质控品为重组质粒pMD18-T-KP或KP阳性的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液样本，用于实际检测中的质量控制。根据本发明一个优选的实施方案，用DNA提取试剂进行阴性质控品、待测样本(咽拭子，鼻咽分泌物或痰液)的DNA提取，DNA提取试剂除本发明提及的方法外，还可以使用其它成熟的DNA提取方法和试剂盒。根据本发明一个优选的实施方案，将提取的DNA和阳性质控品加入到含有KP PCR反应液A和KP PCR反应液B的KP-PCR反应管中，进行RT-PCR扩增，使用荧光定量PCR检测仪进行检测。根据本发明一个优选的实施方案，其特征还在于试剂盒检测机理为有一条两端标记有荧光基团和淬灭基团的特异性荧光探针与目标序列上游弓I物和下游弓I物之间的序列配对，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团则在3’末端，当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭；在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭基团分离；随着扩增循环数的增力口，释放出来的荧光基团不断积累，荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。根据本发明一个优选的实施方案，针对肺炎克雷伯菌检测中的特殊性，反应体系中引物最终浓度为0.4umol/ml,探针最终浓度为0.2umol/ml。根据本发明一个优选的实施方案，针对肺炎克雷伯菌检测中的特殊性，反应体系中引物Mg2+最终浓度为3mM。根据本发明一个优选的实施方案，针对肺炎克雷伯菌检测中的特殊性，反应体系中最终引物退火温度为55摄氏度。根据本发明一个优选的实施方案，研制出用于肺炎克雷伯菌核酸检测的试剂盒，其中KP试剂盒检测标本的灵敏度至少可达到1.0X 102copies/ml。本发明与现有技术相比，具有如下优点:①灵敏度更高；②全封闭反应，提取DNA后，直接用于RT-PCR检测，避免了污染发生设置了 UNG酶+dUTP防污染措施有效地防范了 PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果，提高临床诊断依据的可靠性；④检测速度快，整个过程仅需2小时；⑤操作简单，可控性强，可进行大批量样品检测，有利于产业化。


图1显示KP试剂盒检测肺炎克雷伯菌的条件设置。图2显示KP试剂盒检测肺炎克雷伯菌时不同浓度样本的扩增曲线，三个标本的Ct值均小于27，扩增曲线为S形，均能够判定为阳性。图3显示KP试剂盒五个阴性标本的扩增曲线，均不具S形特征，能够判定为阴性。
图4显示KP试剂盒两个阴性标本的扩增曲线，与荧光检测阈值线没有交点，能够判定为阴性。图5显示阳性质控品扩增曲线。图示扩增曲线为S型曲线，且CT值< 27，说明检测体系有效扩增了肺炎克雷伯菌核酸。图6显示阴性质控品扩增曲线。图示扩增曲线为较平直的折线，与荧光检测阈值线没有交点，且曲线不呈S型，说明检测过程中没有肺炎克雷伯菌核酸的污染。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1:肺炎克雷伯菌的KP试剂盒检测方法(I)标本采集、运送和保存由临床医师根据实际情况进行标本采集。可检测的标本包括，咽拭子，鼻咽分泌物或痰液。采集方法如下:①咽拭子:用棉拭子取咽部分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密封送检；②鼻咽分泌物:负压下吸取鼻咽分泌物，密封送检；③人痰液标本:无菌采集指导病患从呼吸道深部咳出痰(不可含有唾液)，装于40ml无菌塑胶容器，盖上容器盖子，密封送检。标本可立即用于测试，也可以保存于_70°C待测，保存期为6个月。标本运送采用0°C冰壶(2)标本处理咽拭子，鼻咽分泌物(鼻咽分泌物处理步骤同2、3、4)1.加灭菌生理盐 水1.5ml到无菌玻璃管，充分震荡摇匀，挤干棉拭子，立即离心；或置4°C冰箱过夜；2.12，OOOrpm离心5分钟；去上清，沉淀加灭菌生理盐水Iml混匀，12，OOOrpm离心5分钟；3.去上清，沉淀中加入50 μ I DNA提取液充分混匀，100°C恒温处理10± I分钟；4.12，OOOrpm 离心 5 分钟，备用。痰液1.痰液中加入4倍体积的4% NaOH溶液，混匀后室温或65水浴30分钟；2.用枪头或吸管混匀后吸取Iml至1.5ml离心管中，5，OOOrpm离心5分钟；3.去上清，留沉淀及液体约20 μ 1，加入Iml I XPBS,混匀后12，OOOrpm离心5分钟；4.去上清，沉淀中加入50 μ I DNA提取液充分混匀，100°C恒温处理10± I分钟；5.12，OOOrpm 离心 5 分钟，备用。(3)核酸提取取出阴性质控品和处理过的标本，8，OOOrpm离心数秒，吸50 μ I至0.5ml灭菌离心管中，加入50 μ I DNA提取液充分混匀，100°C恒温处理10± I分钟。12，OOOrpm离心5分
钟，备用。提取后的核酸样品可直接用于后续PCR检测或于_20°C保存。若保存一个月以上，最好存于_70°C。DNA提取试剂除本发明提及的方法外，还可以使用其他成熟的DNA提取方法和试剂。(4) RT-PCR 检测取5ul上述核酸溶液加入至PCR反应液中，8000rpm离心数秒，荧光定量PCR上机。PCR反应条件设置为:50°C 2分钟，I个循环；95°C 15分钟，I个循环；94°C 15秒一55°C45秒(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行(参见附图1);设探针检测模式设置为:Reporter Dye:FAM, Quencher Dye:N0NE, Passive Reference:N0NE。(5)结果分析分析条件设置:根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3 15、End值可设在5 20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。(6)结果判定如果检测样品的扩增曲线无对数增长期或Ct值> 38，可判样品为肺炎克雷伯菌阴性(参见附图2和附图3)；如果检测样品Ct值< 38，且曲线有明显的对数增长期，可判样品为肺炎克雷伯菌阳性(参见附图4)。实施例2:肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒中质控品的配制及使用肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒中质控品包括阳性质控品和阴性质控品，用于临床试验中质量控制，KP阳性质控品离心后直接加样上机，阴性质控品操作方法同待检样本。质量控制标准:要求在一次实验中同时满足以下条件——阳性质控品为阳性(参见附图5)、阴性质控品为阴性(参见附图6);否则，结果无效，需重新检测。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110〉中山大学达安基因股份有限公司
<120〉肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
<140>
<141>
<160>5
<210> I <211〉 19 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉
<223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400> I
gcgcgcacctattgtgttg<210〉 2
<211〉20
<212>DNA <213〉人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>2
tcgctgtgcttgtcatcctt
<210> 3 <211> 19 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉
<223>根据特定核苷 酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。
权利要求
1.一种实时荧光RT-PCR法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，该试剂盒包括:(1)DNA提取液；PCR检测试剂:KP PCR反应液A、KP PCR反应液B ;质控品:阴性质控品、KP阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中KP PCR反应液A由对应的PCR反应Buffer、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、纯水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5 ’ -GCGCGCACCTATTGTGTTG-3，和5’ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3’ ； 靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5’ X-CCGTCTACACCCGGGCGCC-Y3’，其中X/Y表示荧光标记检测体系，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阴性质控品为生理盐水、正常人或其它病毒感染者的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液样本。
3.根据权利要求1的试剂盒，阳性质控品为重组质粒pGEM-T-KP或KP阳性的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液样本，其特征还在于阳性质控品包含下列序列或80%同源的核苷酸序列:GCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGA。
4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于RT-PCR反应酶系包含耐热DNA聚合酶、UDG酶和dUTP。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于反应体系中引物最终浓度为0.4umol/ml，探针最终浓度为0.2umol/ml。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于反应体系中引物Mg2+最终浓度为3mM。
7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于反应体系中最终引物退火温度为55摄氏度。
全文摘要
本发明涉及实时荧光PCR试剂盒，特别是涉及利用实时荧光PCR技术检测肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)的试剂盒。试剂盒通过对样本中的肺炎克雷伯菌进行检测，可广泛应用于肺炎克雷伯菌感染的辅助诊断。
文档编号G01N21/64GK103160574SQ201110412000
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者李明, 肖湘文, 高秀洁, 陈华云, 程钢, 何蕴韶 申请人:中山大学达安基因股份有限公司