专利名称：猪胚胎冷冻保存方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及哺乳动物胚胎的冷冻保存。
背景技术：
哺乳动物胚胎的冷冻保存开始于1972年，由Whittingham等(1972)首先发明了慢速冷冻法(常规冷冻法)，在小鼠上取得胚胎冷冻成功；1977年Willadson等对上述方法进行了改良，发明了快速冷冻法，相继在大鼠、牛、兔、山羊、绵羊等动物上获得成功，目前牛胚胎冷冻技术已达到商业化水平。但这些方法冷冻程序较繁琐、费时，而且冷冻过程中需要昂贵的程序降温仪。1985年Rall等首次发明了玻璃化冷冻方法，对小鼠8-细胞冷冻保存取得成功。此后研究者不断改进，使这项技术日趋成熟，有逐渐替代传统方法的趋势。
猪胚胎超低温冷冻对地方猪种的长期保存意义重大。长期以来，由于猪胚胎脂质含量较高等原因，进展一直较为缓慢。猪的卵母细胞和胚胎脂滴含量较高，与其他家畜(牛、羊等动物)相比对低温的耐受性较差，其研究一直处于探索阶段(Hayashi等，1989；Kashiwazki等，1991；Fujino等，1993；Dobrinsky等，1997；冯书堂等，1991；王祖昆等，1998；徐晓波等，1996)；虽然通过离心、显微操作去除脂滴后在一定程度上提高了冷冻效率，但这些方法的重复性不好(Nagashima等，1994；Hiroshi等，1998)；自Vajta等人在1997年首次报道利用开放性拉细麦管(OPS，open pulled straw)玻璃化方法冷冻猪胚胎，使胚胎解冻活率、受胎率有了较大的提高(Vajta等，1997；Berthelot等，2000；2001；Misumi等，2003)。但OPS拉制有一定的难度，当OPS管拉至0.8mm时，在狭窄处变得很脆，易于裂口；另外OPS管在液氮中容易上浮和炸裂，难于储存，成功率低，损耗严重。
因此，本领域迫切需要一种新的猪胚胎超低温冷冻承载工具，从而使运用此新的承载工具的冷冻方法，成本低，成功率高。
发明内容
本发明旨在提供一种猪胚胎超低温冷冻方法。
本发明的另一个目的是提供用上述的猪胚胎超低温冷冻方法是获得的猪胚胎，以及它的用途。
本发明的再一个目的是提供一种可用作猪胚胎超低温冷冻方法中的承载工具的玻璃管。
在本发明的第一方面，提供了一种玻璃化冷冻猪胚胎的方法，它包括步骤(a)在体外，对离体胚胎进行冷冻预处理，(b)将步骤(a)获得的预处理过的胚胎与玻璃化溶液混合，获得混合物；(c)将混合物置于冷冻胚胎承载体中，然后在液氮中冷冻保存，其中使用玻璃管作为冷冻胚胎承载体。
在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的内径为0.1-1mm。
在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的内径为0.2-0.8mm。更佳地为0.3-0.5mm，最佳为0.3mm。
在另一优选例中，所述的玻璃管剖面基本为圆形，至少有一端的管壁厚度0.01-0.1mm。
在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的管壁厚度0.01-0.1mm。
在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的管壁厚度0.01-0.06mm。
在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端开口。
在另一优选例中，所述的玻璃管剖面内径为0.1-1mm的一段有20-30mm。
在另一优选例中，所述的对离体胚胎进行冷冻预处理是将胚胎在渗透性防冻保护剂中放置2-6分钟，所述的渗透性防冻保护剂含有TCM199培养液、胎牛血清、乙二醇和二甲亚砜。
在另一优选例中，所述的渗透性防冻保护剂含有40-80％TCM199培养液、10-30％胎牛血清、5-20％乙二醇和5-20％二甲亚砜。
在另一优选例中，所述的胎牛血清为新出生的牛的血清。
在另一优选例中，所述的玻璃化溶液含有TCM199培养液、胎牛血清、乙二醇、二甲亚砜和蔗糖。
在另一优选例中，所述的玻璃化溶液含有40-80％TCM199培养液、10-30％胎牛血清、10-30％乙二醇、10-30％二甲亚砜和0.2-0.6M蔗糖。
在另一优选例中，步骤(c)中在液氮中保存2-5个月。
在另一优选例中，步骤(b)中将1-5μl含胚胎的冷冻液吸入胚胎冷冻载体中。
在另一优选例中，步骤(c)中胚胎与玻璃化溶液的混合物在10-100秒内吸入冷冻载体中。
在另一优选例中，所述的胚胎为囊胚或桑椹胚。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(d)在基础液中解冻后保存在基础液中，所述的基础液含有TCM199培养液、胎牛血清。
在另一优选例中，所述的基础液含有60-90％TCM199和10-40％胎牛血清。
在另一优选例中，解冻时基础液中加入0.03-0.3M蔗糖。
在本发明的第二方面，提供了一种用上述方法获得的冷冻猪胚胎。
在另一优选例中，所述的胚胎为桑椹胚或囊胚。
在本发明的第三方面，提供了一种上述冷冻猪胚胎的用途，它可用于猪胚胎移植。
在本发明的第四方面，提供了一种玻璃管的用途，所述的玻璃管可用作玻璃化冷冻猪胚胎方法中的冷冻猪胚胎承载体。
据此，本发明提供了一种新的猪胚胎超低温冷冻承载工具，并使运用此新的承载工具的冷冻方法，成本低，成功率高。
图1显示了猪胚胎超低温冷冻承载工具GMP(玻璃微细管)，直径0.3mm。
图2显示了应用GMP进行猪胚胎超低温冷冻的过程，其中a表示第一步，在含有10％乙二醇和10％二甲亚砜的预处理液中孵育3分钟；b表示第二步，在含有20％乙二醇、20％二甲亚砜和0.4M蔗糖的玻璃化溶液中孵育1分钟；c表示在液氮中冷却的步骤。
图3显示了应用GMP进行猪胚胎超低温冷冻后的解冻过程。
图4显示了应用GMP进行猪胚胎超低温冷冻所获得的猪胚胎移植后所产生的1日龄的后代。
图5显示了应用GMP进行猪胚胎超低温冷冻所获得的猪胚胎移植后所产生的4月龄的后代。
具体实施例方式
发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现利用GMP(glass micropipette玻璃微细管)作为猪胚胎超低温冷冻的承载工具，热传导性能好，降温速率快，冷冻效果好；拉制容易，可拉得极细而不破裂；易于在液氮中保存；而且所获得的猪胚胎移植后具有较高的妊娠率和存活率。
如本文所用，“冷冻胚胎承载工具”、“冷冻胚胎载体”、“冷冻胚胎承载体”、“承载工具”、“载体”、“承载体”可互换使用，都是指在玻璃化冷冻胚胎过程中装盛冷冻胚胎的用具，以便于在液氮中保存。
如本文所用，GMP是指至少有一端内径0.1-1mm，管壁0.01-0.1mm的玻璃管。
冷冻胚胎承载工具本发明的冷冻胚胎承载工具可以是本领域熟知的玻璃化冷冻胚胎技术中所使用的承载体。一种优选的承载体是玻璃管，更优选GMP。
本发明的冷冻胚胎承载工具的横截面可以是任意形状，优选基本圆形。
本发明的冷冻胚胎承载工具至少有一端是开口的，优选内径0.1-1mm、管壁0.01-0.1mm的一端开口。
本发明的冷冻胚胎承载工具长度为5-10cm，优选剖面内径为0.1-1mm的一段的长度为10-20mm的GMP。
本发明的冷冻胚胎承载工具可以用本领域熟知的方法制得。一种优选的方法是将内径为2-4mm的玻璃管在酒精灯外焰上加热煅烧，当煅烧部分变得很柔软后，脱离火焰用双手捏住玻璃管两端迅速向相对的方向牵拉，拉制成内径为0.1-1mm的微管，用作胚胎冷冻载体。
玻璃化胚胎冷冻方法超低温冷冻胚胎的存活取决于渗透性抗冻保护剂通透性的快慢、化学毒性的大小和非渗透性抗冻保护剂的渗透压作用及有无冰晶生成。
本发明的玻璃化胚胎冷冻可以用本领域熟知的方法进行，一种优选的方法是胚胎先在冷冻液1(TCM199+20％胎牛血清+10％乙二醇+10％二甲亚砜)中平衡3min，然后胚胎立即转入冷冻液2，即玻璃化溶液(TCM199+20％胎牛血清+20％乙二醇+20％二甲亚砜+0.4M蔗糖)中1min，在这一分钟里，要尽快将胚胎吸入GMP较细的一端，投入液氮，保存3个月。
本发明的玻璃化胚胎冷冻操作在22-39℃下进行。
TCM199培养液可用本领域熟知的市售产品或自己配制，但不限于此，例如使用Gibco公司出品的TCM199培养液。
本发明的渗透性冷冻保护剂可以选用乙酰基乙二醇、乙二醇、二甲亚砜、甘油，优选乙二醇和二甲亚砜。乙二醇、二甲亚砜分子量较小，通过胚胎细胞膜的速度较快，在1分钟内使细胞内外达到平衡，即投入液氮中冷冻保存。乙二醇的分子量(62.07)较小、对细胞膜的通透性较强、化学毒性较小，但玻璃化形成的状态稍差些；而二甲亚砜的分子量为78.14，渗透性较乙二醇差，化学毒性较大，但是形成玻璃化状态要好一些，将两种抗冻剂混合后，既提高了抗冻剂的渗透性，又缓解了二甲亚砜的化学毒性，玻璃化状态形成得比较彻底混合后起到了互补作用。
本发明在玻璃化溶液中添加的物质选自聚蔗糖、聚乙烯吡洛烷酮、包有聚乙烯吡洛烷酮的硅胶颗粒等大分子聚合物和蔗糖，优选蔗糖。添加大分子物质聚蔗糖是当溶液急速冷却后，溶液由液态变为半固态，最后成为玻璃化固态。在此急速冷却过程中由于玻璃化溶液首先形成半固态现象、加之此溶液不生成冰晶，因此在冷冻过程中对胚胎的压力能够得到缓冲，使胚胎免受膨胀造成物理性的损伤。玻璃化溶液中添加蔗糖主要是提高胚胎细胞外液渗透压作用，冷冻过程中使胚胎脱水，同时使渗透性抗冻保护剂渗透到胚胎内部。而解冻时蔗糖的渗透压作用又能脱出细胞内部的抗冻剂，解除其对胚胎的化学毒性作用。
玻璃化冷冻猪胚胎本发明的玻璃化冷冻猪胚胎为4-8细胞阶段至囊胚期，优选处于桑椹胚、囊胚阶段透明带完整的胚胎玻璃微细管(GMP)的用途本发明提供的GMP可用作玻璃化冷冻猪胚胎方法中的冷冻胚胎的承载工具，一般是将含有胚胎的玻璃化冷冻液微滴1-5μl(优选1-3μl)吸入玻璃管开口的较细的一端，投入液氮中冻存。可以用本领域熟知的方法将玻璃化冷冻液微滴吸入玻璃微细管，一种优选的方法是利用虹吸法。吸入含有胚胎的玻璃化冷冻液微滴的一端可以不封口而直接投入液氮中。
玻璃化冷冻猪胚胎用途可以将本发明的方法所获得的猪胚胎利用本领域熟知的方法进行胚胎移植，达到保存地方猪种资源、以及不受时间、地点限制高效推广优良猪种资源的目的。
本发明的主要优点在于1、GMP的内径小，热传导性能好，降温速率快，冷冻效果好；2、GMP在拉制时狭窄处不易裂口；3、GMP在液氮中不易上浮和炸裂，便于储存；4、成本低(比使用OPS(open pulled straw开放式拉长麦管减少80％以上)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
实施例1玻璃微细管GMP(glass micropipette)的拉制将内径为0.25-0.40cm的玻璃管在酒精灯外焰上加热煅烧，当煅烧部分变得很柔软后，脱离火焰用双手捏住玻璃管两端迅速向相对的方向牵拉，拉制成内径为0.3mm的微管，见图1，用作胚胎冷冻载体。
制得的GMP较细的一端开口，横截面基本为圆形，内径0.3mm；较粗一端开口，内径为1.0mm。
对比例1开放式拉长麦管(open pulled straw；OPS)的制备用自制小酒精灯，明火将0.25ml的麦管(France)拉成外径约为0.7mm的开放式小管。
用实施例1及对比例1的方法各制得GMP和OPS100根，结果为
实施例2猪胚胎玻璃化冷冻〔动物与试剂〕供体试验猪是广西巴马小型猪(BM)，体重在30-50Kg、年龄在8-10个月，购自上海市农业科学院畜牧兽医研究所。
受体母猪系成年枫泾猪和香猪，枫泾猪(FJ)购自上海市金山区种猪场。
TCM199培养液购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自上海生物制品公司；乙二醇(EG)购自上海试剂一厂；二甲基亚砜(DMSO)购自Merck公司；蔗糖(SUC)购自上海试剂一厂；氯前列烯醇(PG)购自上海市计划生育科学研究所；孕马血清促性腺激素(PMSG)购自天津实验动物中心；人绒毛膜促性腺激素(hCG)购自宁波市激素制品厂。
〔方法与步骤〕一、超排处理PG+PMSG+hCG法于小型猪发情周期的16-17天肌注PG0.2mg和PMSG1000IU，小型猪发情后与公猪自由交配，并在首次配种后肌注hCG 500IU。
二、胚胎的手术回收首次配种日计为第0天，在第5-6天回收胚胎。
1.小型猪的麻醉与保定采用耳静脉注射2.5％戊巴比妥钠30-50ml、8％水和三氯乙醛(含5％硫酸镁)50-100ml进行全身麻醉，仰卧保定。
2.手术冲胚采用常规外科手术方法在猪倒数第1、2对乳头之间沿腹中线切开7-8cm，暴露一侧子宫角，并沿子宫角、输卵管取出该侧卵巢，观察排卵点情况。从子宫角距尖端1/2-2/3部位朝子宫角方向插入牛用冲卵管或胚胎回收针(自制)并固定；用注射器吸取60ml冲卵液(添加2％新生牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液)，从宫管结合部子宫角尖进针，缓缓注入冲卵液及少许空气，将含胚冲卵液收集于50ml带盖离心管内，以相同方法冲洗另一侧子宫角。
3.胚胎运送将上述带盖离心管盖严后置于37℃保温瓶内，10分钟内送回实验室。
4.检卵含胚液在离心管中静置10min后，吸取下层液体至培养皿内，在实体显微镜下检取。
三、胚胎冷冻和解冻胚胎冷冻的操作均在室温下进行，胚胎先在冷冻液1(TCM199+20％FBS+10％EG+10％DMSO)中平衡3min，然后胚胎立即转入冷冻液2(TCM199+20％FBS+20％EG+20％DMS0+0.4M SUC)中1min，在这一分钟里，要尽快将胚胎吸入实施例1制得的玻璃微细管GMP(glass micropipette)管的细端，投入液氮，保存3个月，见图2。
解冻液的温度均为37℃，解冻液的基础液均为TCM199+20％FBS。解冻时，将GMP、OPS置空气中10秒种，将其中胚胎吹入0.13M SUC溶液，一分钟后将胚胎转移到相同浓度SUC溶液中平衡5min，再将胚胎转入0.075M SUC溶液中平衡5min，最后将胚胎保存在37℃、5％CO2、饱和湿度下的基础液中等待移植，见图3。
实施例3玻璃化冷冻猪胚胎的胚胎移植胚胎移植在其发情周期的第6天。子宫角暴露前的手术操作与实施例2中的胚胎手术回收相同。一侧子宫角暴露后，插入自制注胚针，将实施例2中冷冻保存的胚胎吹入一侧子宫。
〔效果〕实施例2中用于冷冻的胚胎(采自巴马小型猪)为203枚(囊胚/桑葚胚)，移植于受体母猪8头，每头移植25-26枚。移植结果详见表1和图4、5。
结果表明3头第一情期返情；2头第二情期返情；1头手术失败；2头受体母妊娠，其中巴马小型猪妊娠产仔10头，其中8头存活，目前胚胎冷冻后代生长良好。
表1冷冻胚胎移植结果
注BM巴马小型猪；FJ枫泾猪在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种玻璃化冷冻猪胚胎的方法，其特征在于，包括步骤(a)在体外，对离体胚胎进行冷冻预处理；(b)将步骤(a)获得的预处理过的胚胎与玻璃化溶液混合，获得混合物；(c)将混合物置于冷冻胚胎承载体中，然后在液氮中冷冻保存，其中使用玻璃管作为冷冻胚胎承载体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玻璃管至少有一端的内径为0.1-1mm。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的玻璃管至少有一端的内径为0.2-0.8mm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玻璃管剖面基本为圆形，至少有一端的管壁厚度0.01-0.1mm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玻璃管至少有一端的管壁厚度0.01-0.1mm。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玻璃管至少有一端开口。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玻璃管剖面内径为0.1-1mm的一段有20-30mm。
8.一种如权利要求1所述的方法获得的冷冻猪胚胎。
9.一种如权利要求8所述的冷冻猪胚胎的用途，其特征在于，用于猪胚胎移植。
10.一种玻璃管的用途，其特征在于，所述的玻璃管用作玻璃化冷冻猪胚胎方法中的冷冻猪胚胎承载体。
全文摘要
本发明公开了一种玻璃化冷冻猪胚胎的方法，其中使用玻璃微细管作为冷冻胚胎的承载工具，所述的玻璃微细管至少有一端的内径为0.1－1mm，这种冷冻方法成本低，成功率高。本发明还公开了由此方法所获得的猪胚胎及其用途。
文档编号A01N1/02GK101091486SQ200610027830
公开日2007年12月26日 申请日期2006年6月20日 优先权日2006年6月20日
发明者张德福, 刘 东, 吴华莉 申请人:上海市农业科学院