检测csf3r点突变的引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，一种使用RT-PCR及sanger测序法检测CSF3R 点突变的方法及引物。 技术背景
[0002] 慢性中性粒细胞白血病（chronic neutrophilic leukemia, CNL)是比较罕见的特 殊类型慢性白血病，多见于老年人，起病隐匿。WHO国际血液肿瘤分类标准中已将其划为慢 性骨髓增殖性疾病的独立分型。该病目前无明确有效的治疗手段，其诊断、鉴别较为困难， 其诊断需要与类白血病，慢性髓细胞白血病、骨髓纤维化等进行鉴别。不典型慢性髓系白血 病（atypical chronic myeloid leukemia，aCML)，BCR-ABL 阴性是一种初诊时兼有骨髓增 生异常与骨髓增殖特点的白血病疾患。其特征为主要累及中性粒细胞系别，伴有形态学发 育异常的中性粒细胞及其前体细胞增多而致成的白细胞增多，其诊断、鉴别较为困难。aCML 患者预后不良，缺乏有效的治疗手段。CNL和aCML，这两种肿瘤的诊断均基于粒细胞瘤样扩 增并且排除已知发生于其他骨髓增生性肿瘤和骨髓增生-骨髓增生异常重叠肿瘤的遗传 驱动的原因，这两种血液肿瘤的分子原因尚不清楚。
[0003] 集落刺激因子 3 受体（colony stimulating factor 3receptor (granulocyte)， CSF3R)基因位于1号常染色体短臂，是细胞因子受体家族成员，控制髓系祖细胞的增殖 和分化。CSF3R突变最早发现于严重先天性中性粒细胞减少的柯文氏综合征（Kostmann syndrome)，近期的研宄发现CSF3R突变常见于CNL或aCML患者，是CNL和aCML的决定性 分子异常，并代表诊断这些肿瘤的一种可能有用的标准。检测这些突变不仅有助于诊断这 两种罕见疾病，而且有助于评估以中性粒细胞增多为特征的病因不明的其他疾病。
[0004] CSF3R突变发生在两个不同的区域，即近膜突变和截断突变。近膜端突变（T615A 和T618I)活化下游JAK激酶激活，该突变患者对JAK激酶抑制剂鲁索替尼（ruxolitinib) 治疗敏感；截断突变（Q741X和S783fs)使下游激酶信号分子SRC family-TNK2激活，该突 变患者多靶点药物达沙替尼（dasatinib)治疗敏感。突变检测有助于个体化治疗的实施。 已有CSF3R T618I突变CNL患者针对该靶向位点，使用鲁索替尼（ruxolitinib)治疗，病情 相著改善的成功案例。
[0005] 目前用于CSF3R突变检测的方法主要有：Sanger测序法和NGS(Next-generation sequencingtechnology)测序。Sanger测序法目前是临床应用于检测基因突变极其普遍 的一种手段，应用灵活，但是其灵敏度不高，且每次测序长度较为有限，一般一次测序只能 测定800bp左右的基因片段。目前CSF3R测序主要是以DNA为模板进行PCR扩增，因为测 序片段限制，通常两个热点区域需要进行分别扩增，增加了检测成本。NGS测序技术，即高通 量测序技术，具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点，适用于没有明确候选基 因或候选基因数量较多的大样本病例筛查。NGS对于有致病基因位点明确并且数量有限的 单基因遗传疾病的致病基因的检测，成本太高且操作相较于Sanger更为复杂，对数据分析 的要求较高。
【发明内容】
[0006] 鉴于目前CSF3R突变位点检测方法的不足，本发明提供了一种以cDNA为模板使用 Sanger测序法检测CSF3R点突变的引物，其特征在于所述扩增引物的核苷酸序列包括：
[0007] CSF3R-MF 5' -CCGCCAGTCTGTATCACATC-3'
[0008] CSF3R-MR 5, -CCAAAGACACAGTCGTCCTC-3，
[0009] 所述测序引物的核苷酸序列包括：
[0010] CSF3R-MF 5' -CCGCCAGTCTGTATCACATC-3'
[0011] CSF3R-MR 5 ' -CCAAAGACACAGTCGTCCTC-3 '。
[0012] 进一步地，所述扩增引物在如下扩增体系中使用：10yM引物CSF3R-MF和 10 y MCSF3R-MR 各 0? 4ul ; 10 y 1 的 2 X KOD Buffer，0? 4 y 1 的 KOD 酶，2 y 1 的 d NTP ;5. 8 y 1 去离子水；1 U 1的cDNA模版。
[0013] 进一步地，所述扩增引物在如下扩增程序下进行：94°C 5min ;98°C 10s，58°C 25s， 68°C 30s，共 40 个循环；68°C 2min。
[0014] 本发明还提供检测CSF3R基因点突变的方法，包括以下步骤：
[0015] ⑴提取人全血样本中的RNA，逆转录获得cDNA ;
[0016] ⑵利用扩增引物进行PCR扩增，得到扩增产物；所述PCR扩增条件为：94°C 5min ; 98°C 10s，58°C 25s，68°C 30s，共 40 个循环；68°C 2min ;
[0017] ⑶使用酶法纯化PCR产物；
[0018] ⑷利用测序引物进行sanger测序，得到不同片段长度的测序产物；所述PCR扩增 条件为：95°C预变性4min ;95°C变性15s，50°C退火20s，68°C延伸2min，25个循环；
[0019] (5)测序产物纯化及上测序仪进行测序；
[0020] (6)对得到的测序结果进行分析；
[0021] 所述扩增引物的核苷酸序列包括：
[0022] CSF3R-MF 5' -CCGCCAGTCTGTATCACATC-3'
[0023] CSF3R-MR 5' -CCAAAGACACAGTCGTCCTC-3'
[0024] 所述测序引物的核苷酸序列包括：
[0025] CSF3R-MF 5' -CCGCCAGTCTGTATCACATC-3'
[0026] CSF3R-MR 5' -CCAAAGACACAGTCGTCCTC-3'。
[0027] 进一步地，检测CSF3R基因点突变的位点分别是T615、T618、Q741好S782。
[0028] 进一步地，所述点突变的原始序列分别是：
[0029] CSF3R T615 野生型：ACC
[0030] CSF3R T618 野生型：ACC
[0031] CSF3R Q741 野生型：CAA
[0032] CSF3R S783 野生型：AGC。
[0033] 本发明的有益效果是：在现有的技术中，CSF3R基因突变的检测是基于DNA为模 板，要检测近膜突变和截断突变，就需要分别针对近膜突变和截断突变进行两个PCR扩增， 分两段进行测序。而本发明所述引物和检测方法是基于cDNA为模板，只要进行一个PCR扩 增和测序反应，即可同时检测近膜突变和截断突变，节省了成本，增加了检测通量。有助于 快速、准确地诊断患者CSF3R突变位点基因的突变状况和突变类型，对于临床上慢性中性 粒细胞白血病患者的治疗和用药有极大的指导意义。
【附图说明】
[0034] 图1是使用本发明引物测序方法对一个待检血液样本进行筛查的T615位点测序 图。（框选中位置为T615位点）
[0035] 图2是使用本发明引物测序方法对一个待检血液样本进行筛查的T618位点测序 图。（框选中位置为T618位点）
[0036] 图3是使用本发明引物测序方法对一个待检血液样本进行筛查的Q741位点测序 图。（框选中位置为Q741位点）
[0037] 图4是使用本发明引物测序方法对一个待检血液样本进行筛查的S783位点测序 图。（框选中位置为S783位点）
【具体实施方式】
[0038] 实施例1 :
[0039] 血液RNA的提取及逆转录：1. 5ml离心管中加1ml红细胞裂解液和0. 5ml全血标 本，颠倒混匀，室温放置5min ;期间颠倒混匀2-3次；离心4000rpm，3min ;吸弃上清；观察 细胞团块体积，达到10-30ul，加lml红细胞裂解液重悬细胞，吹打混匀（若细胞团块体积 未达到10ul，重复上述步骤）；离心4000rpm，3min，吸弃上清；加lml红细胞裂解液重悬细 胞，吹打混勾；离心4000rpm，3min，吸弃上清；向细胞团块中加入1 ml Trizol Reagent; 用移液枪反复吹打直至裂解液中无细胞团块；每管加入〇. 2ml氯仿，漩涡混匀30s，呈均 勾粉红状后冰上放置lOmin。14, 000rpm，4°C离心10min ;新取1. 5ml离心管，加入预冷 异丙醇450ul，标记流水号；取离心后的上层水相450ul，漩涡混匀10s，冰上静置lOmin ; 14,000rpm，4°C离心10min ;缓慢倒弃上清，在吸水纸上沥干管口残余液体，缓慢地加入1 ml 75 %的DEPC-乙醇（切勿触及沉淀），轻轻颠倒洗涤离心管，使沉淀悬浮；14000rpm，4°C 离心5min ;缓慢倒弃上清，在吸水纸上沥干管口残余液体，加入无水乙醇lml，使沉淀悬浮； 14000rpm, 4°C离心5min ;倒弃上清，在吸水纸上沥干管口残余液体，室温干燥5min ;加入 15-50ulRNase-free 水；取 4ul RNA 加入 lul Oligo (dT) 20 (lOpmol/ y 1)，70°C变性 5min， 冰上静置 2min，再加入 lOul RNase Free H20,4ul 5XRT Buffer，lul ReverTra Ace (东洋 纺（上海）生物科技有限公司）。按照如下程序进行逆转录：37°C 45min ;98°C 5min。反应 结束后，保存于-20 °C待用。
[0040] 其中，所述 10X红细胞裂解液配方为：NH4C1 82g，NaHC038 . 4g，EDTA-Na23. 72g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0041] 实施例2:
[0042] PCR扩增：按如下试剂及试剂量配置PCR扩增体系，其中扩增引物 CSF3R-MF(10yM)和 CSF3R-MR(10yM)各 0.4ul;2XK0D Buffer 10ul，K0D 酶（1U/ ul)0.4ul，d NTP(2mM)2ul(东洋纺（上海）生物科技有限公司）；加去离子水5.8ul ;最后 加 DNA 模版 lul。其扩增程序