【附图说明】
[0027] 图1是设计引物对4种人体疟原虫的多重PCR反应结果，M:50bpDNALadder;1: 恶性疟原虫；2 :三日疟原虫；3 :卵形疟原虫；4 :间日疟原虫；C:阴性对照。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1
[0029] 1.临床采集的发热病人血液样品总DNA的提取，按常规方法进行，用灭菌的去离 子水将样品的DNA浓度稀释到0. lug/ml-0. 4ug/ml，
[0030] 2?聚合酶链式反应：
[0031] (一）聚合酶链式反应以20ul为参考，各物品的用量分别为：
[0032] 10XPCR反应缓冲液 2 ul MgCl2 (25mM) 2 ul dNTP (各 lOmM) 1, 6 u 1 引物PI、P2、P3、P4 和P5 (lOuM) 各1 Ul 供试用DNA模板 1 ul Taq DNA 聚合酶 0. 2 u 1 灭菌去离子水 补齐至总量为20 P 1
[0033] (二）PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，反应条件如下：
[0034] 95°C预变性3min，然后按以下条件进行35个循环。
[0035] 95 °C预变性30秒
[0036] 59°C 退火 40 秒
[0037] 72°C延伸 40秒；35个循环；
[0038] 循环结束后，在72 C保持5分钟补齐，反应结束后在4 C保存。
[0039] (三）PCR反应的电泳监测：取上述反应液8ill与1.6ill载样缓冲液混合，用2% 的琼脂糖进行电泳，EB染色，用凝胶成像系统进行紫外检测。
[0040] 3.鉴定结果的判断：若出现一条268bp条带为恶性疟、446bp清晰的条带为三日 疟、394bp清晰的条带为卵形疟，清晰的323bp条带为间日疟原虫，而非疟疾患者不能产生 条带，或者不能产生清晰地条带。
[0041] 实施例2
[0042] 1.提取镜检阳性的临床恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟病例的样本总DNA，应用 属特异引物P6和P7获得4种人疟原虫的18S rDNA部分序列，并制备和获得足量的质粒 DNA，经DNA测序确定插入的DNA片段准确无误后，测定质粒DNA 0D值，计算其Copy数浓 度，并以10的倍数依次稀释，并应用本检测体系检测，直至检测结果呈阴性或为出现目的 片段。
[0043] 2?聚合酶链式反应：
[0044] (一）聚合酶链式反应以20ul为参考，各物品的用量分别为：
[0045] 10XPCR反应缓冲液 2 MgCl2 (25mM) 2 p 1 dNTP (各 lOmM) 1. 6 P 1 引物 PI、P2、P3、P4 和 P5 (lOuM) 各 1 ul 供试用DNA模板 1 ul Taq DNA 聚合酶 0. 2 u 1 灭菌去离子水 补齐至总量为20 u 1
[0046] (二）PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，反应条件如下：
[0047] 95°C预变性3min，然后按以下条件进行35个循环。
[0048] 95 °C预变性30秒
[0049] 59°C 退火 40 秒
[0050] 72°C延伸 40秒；35个循环；
[0051] 循环结束后，在72 C保持5分钟补齐，反应结束后在4 C保存。
[0052] (三）PCR反应的电泳监测和结果判断：取每次反应液8ill与1. 6ill载样缓冲液 混合，用2%的琼脂糖进行电泳，EB染色，用凝胶成像系统进行紫外检测。若电泳结果出现 一条268bp条带为恶性疟、446bp清晰的条带为三日疟、394bp清晰的条带为卵形疟，清晰的 323bp条带为间日痕原虫,而非痕疾患者不能产生条带,或者不能产生清晰地条带。
[0053] (四）检测体系敏感性判定
[0054] 应用本体系扩增，能够出现预期目的片段的质粒DNA浓度，即判定为本体系的最 低检测浓度（表1)。
[0055] 表1改进检测体系对不同痕原虫18S rDNA质粒模板的最低检测浓度
[0056]
【主权项】
1. 一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：包含五条特异性的引物，其 碱基序列分别如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 所 /_J、i〇
2. 根据权利要求1所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：还含 有聚合酶链式反应试剂、Taq DNA聚合酶、属特异引物、阳性对照和阴性对照。
3. 根据权利要求2所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：所述 的属特异引物的序列分别如SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7所示。
4. 根据权利要求2所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：所述 的聚合酶链式反应试剂中含有10倍聚合酶链式反应缓沖液、灭菌的去离子水、四种脱氧核 苷酸，四种脱氧核苷酸的浓度均为10mM。
5. 根据权利要求3所述的一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其特征在于：所述 的10倍聚合酶链式反应缓沖液包括如下成份： Tris-HCl 100 mM ； MgCl2 25 mM。
6. 采用权利要求1所述的试剂盒鉴别疟原虫种类的方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 收集待检测的血液样品，提取总DNA，用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到 0. lM-g/ml-〇. 4M-g/ml ； 2) 采用特异性的引物扩增DNA片段，所述的特异性的引物的碱基序列分别如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 所示； 3) 将扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，比较PCR扩增产物结果，如果DNA片段的 大小为268 bp,则表不该DNA片段代表的血液样品中含有恶性痕原虫，如果DNA片段的大 小为446bp，则表不该DNA片段代表的血液样品中含有三日痕原虫，如果DNA片段的大小 为394bp，则表不该DNA片段代表的血液样品中含有卵形痕原虫，如果DNA片段的大小为 323bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有间日疟原虫，如果DNA片段不产生条带或 者不能清晰的产生条带，说明该血液样品中不含有疟原虫。
7. 根据权利要求6所述的鉴别疟原虫种类的方法，其特征在于：当提取的DNA浓度较 低时，先用SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7所述的引物进行首轮扩增后，再以其PCR扩增产物为 模板 DNA，应用 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 所示 特异引物进行扩增。
8. 根据权利要求6所述的鉴别疟原虫种类的方法，其特征在于：取8W PCR产物进行 电泳，使用50bp DNA ladder检测PCR片段大小。
【专利摘要】本发明一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其包含五条特异性的引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示。本发明还提供了采用上述的试剂盒鉴别疟原虫种类的方法，收集待检测的血液样品，提取总DNA；采用特异性的引物扩增DNA片段，将DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，比较PCR扩增产物，若出现一条268bp条带为恶性疟、446bp清晰的条带为三日疟、394bp清晰的条带为卵形疟，清晰的323 bp条带为间日疟原虫。本发明能够简便、快速的鉴别疟原虫的种类，对于疟疾的快速鉴定和控制具有十分重要的意义。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-04, C12R1-90
【公开号】CN104673919
【申请号】CN201510089711
【发明人】李美, 夏志贵, 燕贺
【申请人】中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月27日