一种家猪印记基因Rasgrf1的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种家猪印记基因Rasgrfl的鉴定方 法。
【背景技术】
[0002] 基因组印记是一种表观遗传现象，印记基因具有单等位表达和亲本特异性。通过 每个染色体的印记可以对其亲本来源进行判断。然而印记标记的机制研宄表明，DNA甲基 化在基因组印记现象中起重要作用，因此甲基化动态和印记机制成为研宄热点。大部分印 记基因成簇存在，绝缘子调控模型或长链非编码RNAs调控模型对其表达进行调控。越来越 多的证据表明DNA甲基化不仅仅与印记基因表达相关，同时，印记基因的表达调控还与翻 译后组蛋白修饰有关。
[0003] 目前，对基因组印记的研宄主要集中在人和鼠中，而在家畜，特别是猪上的研宄较 少。因此在猪上鉴定印记基因对于基因组印记在物种间的保守性研宄具有重要意义。此 外，家畜大多数印记基因是调控生长发育的主效基因，这些基因对胚胎早期发育、出生后的 生长速度、产肉量、瘦肉率、饲料效率等数量性状有极大影响。基于印记基因在生长和发育 中的重要调控作用，鉴定出新的猪印记基因是一个值得探讨的新课题。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种效果理想、成本低、操作简便的家猪印记基 因Rasgrfl的鉴定方法。
[0005] (1)采用PCR-SSCP-PAGE的方法查找Rasgrfl基因外显子序列SNP (single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性）：
[0006] I.提取皖南黑猪和巴克夏猪的DNA，进行Rasgrfl基因外显子1和外显子14部分 序列的克隆；
[0007] II. PCR-SSCP 方法分型；
[0008] III.不同基因型个体PCR产物的纯化、克隆和测序。
[0009] (2)总RNA的提取和cDNA的制备：
[0010] I.正反杂交模型的建立：正交：巴克夏猪6 X皖南黑猪早；反交：皖南黑猪古X 巴克夏猪早；巴克夏猪6与皖南黑猪早交配产生的F1代仔猪为正交F1，皖南黑猪6与巴克 夏猪早交配产生的F1代仔猪为反交F1 ;
[0011] II. SNP位点杂合个体的筛查：出生1日龄的正反交F1代仔猪各8头，分别提取各 亲本以及F1代仔猪个体的基因组DNA，用于杂合子鉴定；采用PCR-RFLP方法，基于步骤（1) 查找到的SNP位点，该SNP位点处杂合基因型的个体为F1代杂合子仔猪个体；
[0012] III.总RNA的提取和cDNA的制备：提取F1代1日龄正反交仔猪各8头以及杂合 子仔猪7头的14种不同组织的RNA，反转录成cDNA ;7头杂合子仔猪中包括正交3头，反交 4头；14种不同组织为脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、胰脏、背膘、睾丸、子宫、小肠、背 最长肌和垂体；
[0013] (3)采用RT-PCR-RFLP方法鉴定印记状态
[0014] I. RT-PCR-RFLP 鉴定印记状态：
[0015] 取F1代1日龄正交3头、反交4头杂合子仔猪的14种不同组织cDNA，利用锚定引 物进行RT-PCR ;采用RT-PCR-RFLP方法检测杂合子仔猪各组织器官mRNA酶消化带型，并根 据其亲本的基因型判断Rasgrfl基因在特定阶段和组织是父系印记还是母系印记或者不 存在印记；所述锚定引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2所示；
[0016] II.q-RT-PCR
[0017] 取F1代1日龄正反交仔猪各8头的14种不同组织cDNA，利用锚定引物进行 q-RT-PCR，检测Rasgrfl基因在14个组织，即脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、胰脏、背 膘、睾丸、子宫、小肠、背最长肌和垂体的mRNA表达水平；所述锚定引物对应的核苷酸序列 如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
[0018] (4)目的基因蛋白水平的检测
[0019] 取F1代1日龄正交3头、反交4头杂合子仔猪，选取其Rasgrfl基因双等位基因 表达的两种组织心和脾，单等位基因表达的两种组织肝和小肠进行Rasgrfl基因编码的蛋 白质分布的研宄，包括石蜡组织切片的制作和免疫荧光观察两大步骤；
[0020] (5)亚硫酸氢盐修饰后测序的甲基化分析方法
[0021] 通过对猪Rasgrfl基因启动子活性的分析，预测核心启动子区和该片段内CTCF结 合区域，经软件预测确定此两区域GpG岛的分布情况；样品经过亚硫酸盐处理后，通过设计 特异性引物对其进行PCR扩增，而后测序进行基因甲基化程度分析。
[0022] 本发明所述的家猪印记基因Rasgrfl的鉴定方法，其中，步骤（4)中石蜡组织切片 的制作具体包括如下步骤：
[0023] (1)固定：脾在新鲜配制的Bouin溶液中固定24h，其他组织在10%中性甲醛固定 液固定24h ;
[0024] (2)脱水：使用浓度逐级升高的梯度乙醇依次脱水，30%- 50%- 60%- 70% -80% - 90% - 95% I、II -无水乙醇 I、II，各 60min ;
[0025] (3)透明：体积比为1 : 1二甲苯无水乙醇混合液20min-二甲苯I、II，各 lOmin ；
[0026] (4)浸蜡：体积比为1 : 1二甲苯石蜡混合液lh -石蜡I、II，各lh ;
[0027] (5)包埋：将溶化的石蜡倒入包埋盒内，用镊子将浸蜡彻底的组织块放入，蜡块大 小满足切片需要、便于切片机固定和切片；
[0028] (6)切片：组织块制成蜡块，稳固置于切片机上即可开始切片，厚度为6 ym ;
[0029] (7)展片：展片温度控制在43°C以下；
[0030] 免疫荧光：
[0031] (1)烤片温度为 6(TC，2-8h ;
[0032](2)二甲苯I、II脱蜡各 15min;
[0033] (3)梯度酒精复水：100%酒精1、11各101^11 - 95%酒精1、11各10111111 - 80% 酒精51^11 - 70%酒精5111111 - 50%酒精5111111-蒸馏水3111111\2次一？83 5111111;
[0034](4)抗原修复：切片置于枸橼酸修复液中，100%火力3min至微微沸腾一50%火力 维持7min -停止加热自然冷却30min ;
[0035] (5)封闭：PBS 3min，滤纸擦去标本外的PBS -滴加封闭血清1 % BSA -湿盒中 37°C封闭30min -滤纸擦去封闭液；
[0036] (6)-抗：滴加200 yL体积比为1:100稀释的兔抗人Rasgrfl蛋白多克隆抗体， 4°C孵育过夜一PBS 3minX5次洗去一抗，滤纸擦去标本外的PBS ;
[0037] (7)二抗：滴加200yL体积比为1:100稀释的荧光标记山羊抗兔IgG，室温孵育 lh - PBS 3minX5次洗去二抗，滤纸擦去标本外的PBS ;
[0038] (8)染核：滴加PI避光孵育8min - PBS3minX3次洗去PI，滤纸擦去标本外的 PBS ；
[0039] (9)甘油封片，立即在共聚焦显微镜下观察。
[0040] 本发明所述的家猪印记基因Rasgrfl的鉴定方法，其中，步骤（5)中甲基化分析方 法具体包括如下步骤：
[0041] DNA修饰（根据Milli-pore甲基化试剂盒说明书），具体步骤如下：
[0042] (l)DNA 修饰：
[0043] 100 y L含1. 0 y g DNA溶液中加入7. 0 y L 3mol/L的氢氧化钠，充分混匀；50°C孵 育DNAlOmin后加550 y L现配的DNA修饰试剂I，涡旋；50°C避光孵育16h;
[0044](2)首次脱盐
[0045] 在DNA溶液中加入5 y L充分涡旋重悬DNA修饰试剂III，再加入750 y L DNA修饰 试剂II，混匀；室温孵育10min，5000g离心10s，弃上清；加1.0mL70%乙醇，涡旋，5000g离 心l〇s，弃上清，重复三次；第三次弃上清后，高速离心2min，吸去上清；
[0046] (3)第二次脱盐
[0047] 在上述沉淀中加入50yL 20mmol/L Na0H/90%乙醇，涡旋重悬颗粒于室温孵育 5min ;5000g离心10s，收集内容物于管底；加1.0ml 90 %乙醇，涡旋洗涤颗粒，离心，弃上 清，重复一次；第二次洗涤，弃上清后高速离心3min，吸净上清，室温干燥20min ;加TE缓冲 液，50-60°C孵育样品15min，洗脱DNA，高速离心3min，将上清转入新的PCR管，分装-20°C 保存；
[0048] 甲基化特异性PCR引物设计：
[0049] 通过甲基化预测网站（www. ebi. ac. uk/emboss/cpgplot/)预测猪Rasgrfl基因上 游2kb左右区域的CpG岛的分布情况，用甲基化在线软件MethPrimer设