应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫检测技术领域，尤其是涉及一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法。
【背景技术】
[0002]癌基因的表达是由多个功能转录元件(transcript1n elements, TEs)结合位点的组合所调控的，这些转录调控元件结合在癌基因启动子序列中的特殊位点上(transcript1n factor binding sites，TFBSs)，起着调控转录的重要作用。DNase I 内切酶可以灵敏地识别全基因组染色质中开放区域，能预测出肿瘤细胞中与肿瘤基因表达相关的功能调控元件(如启动子、增强子、沉默子以及绝缘子等)在基因组上的特异结合位点。
[0003]目前DNase-seq技术只在国外应用，并未在国内推广，并且该方法也只是用于细胞样本中，对于调控元件结合位点的研宄也只限于细胞水平，没有很好的应用于临床。没有对临床样本的DNase I最佳酶切方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法。
[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0006]一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法，该方法包括以下步骤:
[0007](I)组织样本前处理:
[0008]无菌条件下，取组织样本加预冷的含有蛋白抑制剂的PBS洗涤剂洗涤3次；所述的PBS洗涤剂中蛋白抑制剂cocktail (单位为100X)的含量为1X(即稀释至一倍)，所述的蛋白抑制剂具体由 AEBSF、EDTA、Leupeptin 及 Pepstatin A 组成。
[0009](2)组织匀浆研磨收集细胞核:
[0010]经过前处理的组织样本中加入NEHB溶液和1.15wt%的KCL，用组织研磨器，在冰浴中研磨后，25000rpm的转速30分钟超速离心收集细胞核；
[0011]所述的NEHB溶液具体包括:10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、25mM KC1、0.15mM精胺、
0.5mM亚精胺、ImM EDTA、2M鹿糖、10v/v%甘油、1mM NaF、lmM原f凡酸盐、ImM苯甲基磺酰氟、0.5mM 二硫苏糖醇以及IX蛋白酶抑制剂cocktail，其pH为7.9。
[0012](3)脱氧核糖核酸酶I酶切反应:
[0013]将细胞核用PBS洗涤2次后，悬浮在预冷的酶切消化缓冲液A(具体包括:15mMTris-ClU5mM NaCl、60mM KClUmM EDTA、0.5mM EGTA，其 pH 为 8.0)中，37°C水浴 2 分钟，加入脱氧核糖核酸酶I (DNase I酶，0-60U不等)，37°C酶切5分钟后，加入与脱氧核糖核酸酶I等量的酶切终止液(含有1mM Tris与5mM EDTA, pH为7.6)；
[0014](4)纯化提取酶切DNA:
[0015]步骤(3)所得液中加入4ul核糖核酸酶(RNase酶)，55°C孵育15分钟，再加2ul20mg/ml的蛋白酶K，55°C孵育2小时，用纯化液(体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液)抽提DNA片段；
[0016](5)胶回收DNA片段:
[0017]将抽提的DNA片段放置在2被％的琼脂糖胶中，80V，I小时电泳，切胶回收150bp以下的DNA片段；
[0018](6)方法有效性评估:
[0019]用实时定量PCR方法检验DNase I的酶切效率。
[0020](7) DNA-seq文库构建与测序:
[0021]文库按照illumina公司的建库试剂盒说明书构建，将建好文库进行Hiseq2000的50SE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。
[0022]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:
[0023]本发明对组织的细胞核的前期收集方法进行改进，并通过细胞核的数量，优化酶切反应条件，提高了 DNase I的酶切效率；其次，采用DNase I的梯度酶切方法与高通量方法的结合，不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低由于前期研磨样本产生的假阳性，能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点，提高了临床样本的研宄进程。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0025]实施例1
[0026]采取临床肺腺癌组织样本。具体方法如下:
[0027]在无菌条件下，取约50mg肺腺癌癌症组织，加预冷的Iml PBS(含IX蛋白抑制剂 protein inhibitor)洗涤 3 次；加 NEHB 溶液(1mM HEPES pH 7.9，25mM KCl，0.15mMspermine,0.5mM spermidine，ImM EDTA，2M sucrose，10 % glycerol,1mM NaF，ImMorthovanadate,ImM PMSF,0.5mM DTT, and IX protease inhibitor cocktai)和 L 15%的KCL，用50ml的组织研磨器，在冰浴中反复研磨匀浆，25000rpm，30分钟超速离心收集细胞核。用PBS洗涤2次后，悬浮在预冷的酶切消化缓冲液A中(15mM Tris-Cl，pH 8.0;15mM NaCl ；60mM KCl ；lmM EDTA, pH 8.0 ；0.5mM EGTA, pH 8.0)中，37 度水浴 2 分钟。加入DNase I酶(0-60U不等)，37度酶切5分钟后，加入等量酶切终止液(1mM Tris, ρΗ7.6，5mM EDTA)。加入4ul RNase酶，55度孵育15分钟。再加2ul 20mg/ml的蛋白酶K，55度孵育2小时。用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提DNA片段。将抽提的DNA放置2%的琼脂糖胶，80V，1小时电泳，切胶回收150bp以下的DNA片段。用实时定量PCR方法检验DNase I的酶切效率。
[0028]按照illumina公司的建库试剂盒说明书构建测序文库，并进行Hiseq2000，50SE的高通量测序，测序结果进行生物信息手段分析后，定位与癌症发生发展相关的转录调控元件的结合位点。
[0029]实施例2
[0030]应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法，包括以下步骤:
[0031](I)组织样本前处理:
[0032]无菌条件下，取约50mg小鼠肝组织，加预冷的Iml含有蛋白抑制剂的PBS洗涤剂洗涤3次；PBS洗涤剂中蛋白酶抑制剂cocktail (单位为100X)的含量为IX(即稀释至一倍)，蛋白抑制剂具体由AEBSF、EDTA、Leupeptin及Pepstatin A组成。
[0033](2)组织匀浆研磨收集细胞核:
[0034]经过前处理的组织样本中加入NEHB溶液和1.15wt%的KCL，用组织研磨器，在冰浴中研磨后，25000rpm的转速30分钟超速离心收集细胞核；
[0035]NEHB溶液具体包括:10mM 4_羟乙基哌嗪乙磺酸、25mM KCl,0.15mM精胺、0.5mM亚精胺、ImM EDTA、2M鹿糖、10v/v%甘油、1mM NaF、ImM原f凡酸盐、ImM苯甲基磺酰氟、0.5mM二硫苏糖醇以及IX蛋白酶抑制剂cocktail，其pH为7.9。
[0036](3)脱氧核糖核酸酶I酶切反应:
[0037]将细胞核用PBS洗涤2次后，悬浮在预冷的酶切消化缓冲液A(具体包括:15mMTris-ClU5mM NaCl、60mM KClUmM EDTA,0.5mM EGTA，其 pH 为 8.0)中，37°C水浴 2 分钟，加入脱氧核糖核酸酶I (DNase I酶，0-60U不等)，37°C酶切5分钟后，加入与脱氧核糖核酸酶I等量的酶切终止液(含有1mM Tris与5mM EDTA, pH为7.6)；
[0038](4)纯化提取酶切DNA:
[0039]步骤(3)所得液中加入4ul核糖核酸酶(RNase酶)，55°C孵育15分钟，再加2ul20mg/ml的蛋白酶K，55°C孵育2小时，用纯化液(体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液)抽提DNA片段；
[0040](5)胶回收DNA片段:
[0041]将抽提的DNA片段放置在2被％的琼脂糖胶中，80V，I小时电泳，切胶回收150bp以下的DNA片段；
[0042](6)方法有效性评估:
[0043]用实时定量PCR方法检验DNase I的酶切效率。
[0044](7) DNA-seq文库构建与测序:
[0045]文库按照illumina公司的建库试剂盒说明书构建，将建好文库进行Hiseq2000的50SE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。
[0046]上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)组织样本前处理: 无菌条件下，取组织样本加预冷的含有蛋白抑制剂的PBS洗涤剂洗涤； (2)组织匀浆研磨收集细胞核: 经过前处理的组织样本中加入NEHB溶液和1.15被％的KCL，用组织研磨器，在冰浴中研磨后，超速离心收集细胞核； (3)脱氧核糖核酸酶I酶切反应: 将细胞核用PBS洗涤2次后，悬浮在预冷的酶切消化缓冲液A中，37°C水浴2分钟，加入脱氧核糖核酸酶I，37°C酶切5分钟后，加入与脱氧核糖核酸酶I等量的酶切终止液； (4)纯化提取酶切DNA: 步骤(3)所得液中加入核糖核酸酶，55°C孵育15分钟，再加蛋白酶K，55°C孵育2小时，用纯化液抽提DNA片段； (5)胶回收DNA片段: 将抽提的DNA片段放置在2被％的琼脂糖胶中，80V，I小时电泳，切胶回收150bp以下的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的PBS洗涤剂中蛋白抑制剂cocktail的含量为IX，所述的蛋白抑制剂 cocktail 由 AEBSF> EDTA、Leupeptin 及 Pepstatin A 组成。
3.根据权利要求1所述的一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切方法，其特征在于，步骤(2)所述的NEHB溶液具体包括:10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、25mMKCl,0.15mM精胺、0.5mM亚精胺、ImM EDTA、2M蔗糖、10v/v%甘油、1mM NaFUmM原钒酸盐、ImM苯甲基磺酰氟、0.5mM 二硫苏糖醇以及IX蛋白酶抑制剂cocktail，其pH为7.9。
4.根据权利要求1所述的一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切方法，其特征在于，步骤(2)所述的离心过程中采用25000rpm的转速。
5.根据权利要求1所述的一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切方法，其特征在于，步骤(3)所述的酶切消化缓冲液A具体包括:15mM Tris-Cl U5mM NaCl,60mM KClUmM EDTA,0.5mM EGTA，其 pH 为 8.0。
6.根据权利要求1所述的一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切方法，其特征在于，步骤(3)所述的酶切终止液含有1mM Tris与5mM EDTA, pH为7.6。
7.根据权利要求1所述的一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切方法，其特征在于，步骤(4)所述的纯化液为体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液。
【专利摘要】本发明涉及一种应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切方法，首先进行组织样本前处理，然后向组织样本中加入NEHB溶液和1.15％的KCL，用组织研磨器，在冰浴中研磨后，超速离心收集细胞核；再进行脱氧核糖核酸酶I酶切反应，纯化提取酶切DNA最后胶回收DNA片段。与现有技术相比，本发明对组织的细胞核的前期收集方法进行改进，并通过细胞核的数量，优化酶切反应条件，提高了DNase I的酶切效率；其次，采用DNase I的梯度酶切方法与高通量方法的结合，不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低由于前期研磨样本产生的假阳性，能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点，提高了临床样本的研究进程。
【IPC分类】C12Q1-44, C12Q1-68
【公开号】CN104673906
【申请号】CN201510073438
【发明人】李旦, 刘小乐
【申请人】同济大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月11日