含有可从机体组织中分离的ssea-3阳性的多能干细胞的同种异体移植用细胞治疗用组合物的制作方法

含有可从机体组织中分离的ssea-3阳性的多能干细胞的同种异体移植用细胞治疗用组合物的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供含有多能干细胞的同种异体移植用细胞治疗用组合物，该同种异体移植用细胞治疗用组合物含有可从机体组织分离的、SSEA-3阳性、不表达HLAII类抗原的多能干细胞。
【专利说明】含有可从机体组织中分离的SSEA-3阳性的多能干细胞的同种异体移植用细胞治疗用组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及含有机体组织来源的SSEA-3阳性的多能干细胞的同种异体移植用细胞治疗用组合物。
【背景技术】
[0002]近年来，可贡献于组织再生的成人干细胞或组织干细胞受到关注。
[0003]作为由成体得到的具有分化能的细胞，有人报道了例如通过施加分化诱导得到的具有分化为骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等各种细胞的分化能的骨髓间充质细胞部分(MSC:骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell))(参照非专利文献I和2)。但是，骨髓间充质细胞部分是含有多个细胞种类的细胞群，施加诱导时的分化效率并不高。可以推测MSC中的一部分细胞承担分化，但上述细胞本身尚不明确，这成为人们长时间讨论的课题。另外，为了分化为特定的细胞，必须进行特定化合物的刺激或基因导入等，必须构建分化诱导系统。
[0004]作为成体来源的多能干细胞，更有人报道了由体细胞人工制作的iPS细胞(诱导多能干细胞)(参照专利文献1、专利文献2、非专利文献3等)。但是，iPS细胞的建立必须对作为间充质细胞的皮肤成纤维细胞部分进行使用特定物质的诱导操作，将特定的基因或特定的化合物导入体细胞。
[0005]还有人报道了可由机体组织分离的阶段特异性胚胎抗原-3 (SSEA-3)阳性多能干细胞，它是目前尚未了解的机体来源的干细胞(参照专利文献3和非专利文献4等)。
[0006]现有技术文献`
专利文献1:日本特许第4183742号公报
专利文献2:日本特开2008-307007号公报
专利文献3:国际公开第W02011/007900号国际公开小册子
非专利文献 1:M.DEZAWA等人.，The Journal of Clinical Investigation, 113, 12,1701-1710 页(2004)
非专利文献 2:M.DEZAWA等人.，SCIENCE, 2005 July 8, 309, 314-317页，(2005)非专利文献 3:0kita K.等人.，SCIENCE, 2008 年11月7 日，322(5903)，949-953
页
非专利文献 4:Proc.Natl.Acad.Sci USA, 107(19):8639-43, 2010。

【发明内容】

[0007]本发明的目的在于提供含有SSEA-3阳性、不表达HLA II类抗原的多能干细胞的同种异体移植用细胞治疗用组合物。
[0008]本发明人由皮肤或骨髓、以及皮肤成纤维细胞或骨髓间充质细胞分离了一种SSEA-3阳性、且具有以往干细胞中未见到的抗原表达概况的干细胞，命名为Muse细胞(多谱系分化应激持久细胞)(国际公开第W02011/007900号国际公开小册子；Proc.Natl.Acad.Sci USA, 107(19):8639-43, 2010)。
[0009]本发明人等对所得Muse细胞的特性进行分析，结果发现:该细胞表达HLA抗原中的I类抗原，但并不表达II类抗原，并认为在进行同种异体移植时，即使不结合使用免疫抑制剂也可能不被排斥，进行了深入的研究。
[0010]其结果发现:可将Muse细胞用于同种异体移植，从而完成了本发明的含有Muse细胞的同种异体移植用细胞治疗用组合物。
[0011]S卩，本发明如下所述。
[0012][I]同种异体移植用细胞治疗用组合物，该组合物含有可从机体组织分离、具有以下(i)-(iv)的所有性质、SSEA-3阳性、不表达HLA II类抗原的多能干细胞:
(i)端粒酶活性低或没有；
(?)具有分化为三胚层中任意胚层的细胞的能力；
(iii)不显示肿瘤性增殖；以及
(iv)具有自我复制能力(自我更新能力)。
[0013][2] [I]的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞可抑制由单核细胞向树突细胞的诱导以及T细胞的活化。
[0014][3] [I]或[2]的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞为CD105阳
性。
[0015][4] [1]-[3]中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞为CDl 17阴性和CD 146阴性。
[0016][5] [1]-[3]中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞为⑶117阴性、⑶146阴性、NG2阴性、⑶34阴性、vWF阴性和⑶271阴性。
[0017][6] [1]-[3]中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、SoxlO阴性、Snail阴性、Slug阴性、Tyrpl阴性和Dct阴性。
[0018][7] [1]-[6]中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞为应激耐性的。
[0019][8] [1]-[6]中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞的吞曬能力闻。
[0020][9] [1]-[8]中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞来源于间充质组织。
[0021][10] [1]-[8]中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞来源于脐带或脂肪组织。
[0022]本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2011-076643号说明书和/或附图所记载的内容。
[0023]附图简述
图1是表示人骨髓间充质细胞来源的SSEA-3阳性细胞的HLA I类和HLA II类抗原的表达的图。
[0024]图2是表示人成纤维细胞来源的SSEA-3阳性细胞的HLA I类和HLA II类抗原的表达的图。
[0025]图3是表示Muse细胞和非Muse细胞中的HLA I类的表达的图。
[0026]图4是表示Muse细胞和非Muse细胞中的HLA II类的表达的图。
[0027]图5是表示Muse细胞和非Muse细胞中的第二抗体_Alexa568的反应性(阴性对照)的图。
[0028]图6是表示为了用于淋巴细胞试验而对采自人外周血的细胞用FACS进行分析的结果的图。
[0029]图7是表示对进行了由单核细胞向单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞的分化诱导后的细胞用FACS进行分析的结果的图。
[0030]图8是表示Muse细胞抑制由单核细胞向单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞的分化诱导的图。
[0031]图9是表示对进行了由单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞向树突细胞的分化诱导后的细胞用FACS进行分析的结果的图。
[0032]图10是表示Muse细胞抑制由单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞向树突细胞的分化诱导的图。
[0033]实施发明的方案 以下详细说明本发明。
[0034]本发明是含有多能干细胞的用于同种异体移植的细胞治疗用组合物或细胞治疗剂。
[0035]Muse细胞是被称为Muse细胞的多能干细胞。本发明中，提及Muse细胞时，也包括细胞部分，Muse细胞部分是指以至少一定量含有Muse细胞的细胞群。例如，Muse细胞部分是含有1%以上、10%以上、30%以上、50%以上、70%以上、90%以上或95%以上Muse细胞的细胞群，包括由Muse细胞的培养得到的细胞团或将Muse细胞浓缩而成的细胞群。有时也将上述Muse细胞部分称为实质上均匀的Muse细胞部分。
[0036]Muse细胞是可由机体组织分离的、SSEA-3阳性的多能干细胞。
[0037]机体是指哺乳动物的机体，是指发育到某种程度的动物体。本发明中，机体不包含发育阶段在受精卵或囊胚期之前的胚胎，但包含囊胚期以后的发育阶段的胚胎，包含胎儿和囊胚。哺乳动物不受限定，例如包含人、猴等灵长类，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等啮齿类，猫、狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊、雪貂等。由于可由机体组织直接获得，Muse细胞可与胚胎干细胞(ES细胞)和胚胎生殖干细胞(EG细胞)明确区分开来。
[0038]中胚层组织是指在动物的早期发育过程中表现出的中胚层起源的组织，包含肌肉系统组织、结缔组织、循环系统组织、排泄系统组织、生殖系统组织等。例如Muse细胞可由骨髓液或真皮结缔组织等的皮肤组织获得。
[0039]间充质组织是指骨、软骨、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韧带、肌腱、心脏等组织。例如Muse细胞可由骨髓或皮肤获得。还可由脐带或脂肪干细胞获得。
[0040]细胞可由组织直接获得，这是指可由组织直接分离，或者可暂时培养来自这些组织的间充质细胞，再由其中分离，而不经过外源基因或外源蛋白的导入或化合物的给予等的化合物处理等人工诱导操作即可获得。这里，外源基因并没有限定，例如是指可使体细胞的核重编程的基因，例如0ct3/4基因等的Oct家族基因、Klf基因等的Klf家族基因、c-Myc基因等的Myc豕族基因、Sox2基因等Sox豕族基因。另外，外源蛋白质可举出这些基因所编码的蛋白质或细胞因子。此外，化合物例如可举出:诱导可使上述体细胞的核重编程的基因表达的低分子化合物或DMS0、发挥还原剂功能的化合物、DNA甲基化剂等。由于可由机体或组织直接获得，Muse细胞可与iPS (诱导多能干细胞)细胞和ES细胞明确地区别开来。本发明中，人工诱导操作不包含细胞培养、以细胞的表面标志为指标来分离细胞或细胞部分、将细胞暴露于细胞应激、以及对细胞给予物理性冲击。Muse细胞的特征还在于:无需诱导重编程或去分化即可获得。
[0041]可以认为Muse细胞存在于机体的中胚层组织或间充质组织等中，本发明中，将存在于这些组织中的细胞或细胞部分分离。Muse细胞例如可能存在于骨髓中，经由血液等由骨髓供给到机体的各组织。因此，可由骨髓或皮肤等机体的各组织、进一步由血液分离。
[0042]多能干细胞是指具有多能性的细胞，具有以下特性。
[0043](I)表达 Nanog、0ct3/4、SSEA-3、PAR-4 和 Sox2 等多能性标志。
[0044](2)具有由I个细胞进行增殖、持续制作自身克隆的克隆性。
[0045](3)具有自我复制(自我更新)能力。
[0046](4)可体外和体内分化成三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)。
[0047](5)移植到小鼠的睾丸或皮下时，不形成肿瘤。
[0048](6)碱性磷酸酶染色呈阳性。
[0049]Muse细胞具有多能性，由此可以与通常已知的神经干细胞或造血干细胞等成人干细胞、组织干细胞明确区分开来。另外，由于可作为具有多能性的单个或多个细胞分离，Muse细胞可以与骨髓间充质细胞、脂肪来源的间充质细胞等常规的间充质细胞部分明确区分开来。
[0050]此外，Muse细胞具有以下特性。
[0051](i)增殖速度比较缓慢，分裂周期为I天以上、例如1.2-1.5天。但不显示ES细胞或iPS细胞所显示的无限增殖。
[0052](ii)移植到免疫缺陷小鼠中时，显示形成包含内胚层、中胚层和外胚层的要素的畸胎瘤。ES细胞或iPS细胞在短期间内形成畸胎瘤，与此相比，Muse细胞的特征是:半年以上也未形成畸胎瘤。
[0053](iii)通过悬浮培养，由I个细胞形成Muse来源的胚状体样细胞团。
[0054](iv)通过悬浮培养形成胚状体样细胞团，10-14天左右增殖停止。之后通过转移至贴壁培养进行再增殖。
[0055](V)增殖时伴随有不对称分裂。
[0056](vi)核型正常。
[0057](vii)端粒酶活性没有或低。这里端粒酶活性没有或低是指例如使用TRAPEZE XL端粒酶检测试剂盒(Millipore社)检测端粒酶活性时，无法检测或低。端粒酶活性低例如是指具有与人成纤维细胞相同程度的端粒酶活性，或者与Hela细胞相比，具有1/5以下、优选1/10以下的端粒酶活性。
[0058](viii)关于甲基化的状态，对于由Muse细胞诱导的iPS细胞，Nanog和0ct3/4的启动子区域的去甲基化高。
[0059](ix)吞曬能力高。[0060](χ)不显示肿瘤性增殖。这里，不显示肿瘤性增殖是指进行悬浮培养时，如果达到一定大小的细胞团(簇)则增殖停止，不无限增殖。另外即使移植到免疫缺陷小鼠的睾丸中也不形成畸胎瘤。上述(i)-(iv)等也与不显示肿瘤性增殖有关。
[0061]S卩，本发明的细胞例如是以下的多能干细胞。
[0062](A)多能干细胞，该多能干细胞是由机体的中胚层组织或间充质组织等获得的细胞，无需向该细胞内导入化学物质、外源基因或外源蛋白质即可直接获得。
[0063](B)具有上述(I)的特性的多能干细胞，其中，机体的中胚层组织或间充质组织等选自骨髓、皮肤、血液、脐带、脂肪等。
[0064](C)上述㈧或⑶的多能干细胞，其中，无需诱导重编程或去分化即可获得。
[0065](D)上述㈧或⑶的多能干细胞，其中，在移植到睾丸中时，至少半年内不形成肿瘤。
[0066](E)上述㈧或⑶的多能干细胞，其不显示如ES细胞、iPS细胞那样的无限增殖。
[0067](F)多能干细胞，其是机体的中胚层组织或间充质组织等来源的多能干细胞，在对机体的中胚层组织或间充质组织等细胞用蛋白酶进行处理时存活，对蛋白酶具有抗性。
[0068]Muse细胞可以利用在Muse细胞表面大量表达的细胞表面标志进行分离，例如可以以SSEA-3的表达为指标进行分离。也将Muse细胞称为SSEA-3阳性Muse细胞。并且Muse细胞表达间充质细胞标志CD105，为SSEA-3阳性，为CD105阳性。因此，可以以SSEA-3和CD105两者的表达为指标进行分离。通过利用这些细胞表面标志，可以将Muse细胞以单一细胞的形式分离，可通 过培养使分离的单一细胞增殖。本发明也包含可通过与SSEA-3相当的标志从人以外的哺乳动物的机体组织中分离的多能干细胞。
[0069]另一方面，Muse细胞是NG2、CD34、vFW(血管假性血友病因子)、c_kit (CD117)、CD146、CD271 (NGFR)阴性。并且是 SoxlO、Snail、Slug、Tyrpl、Dct 阴性。
[0070]NG2、⑶34、vWF、⑶117、⑶146、⑶271等表面抗原是否为阴性、是否弱表达，是对这些抗原的抗体反应，通过使用显色酶、荧光化合物等标记的抗体，显微镜观察细胞是否染色等来确定。例如使用这些抗体对细胞进行免疫染色，可以确定是否有表面抗原。还可以使用与该抗体结合的磁性珠来确定。还可以使用FACS或流式细胞仪，确定是否有表面抗原。流式细胞仪例如可以使用FACSAria(卜 > 于? > 乂 >社制造)、FACS vantage (夕卜 > 〒W W V >社制造)、FACS CalibuH?夕卜 > 〒D W ” >社制造)、MACS (磁式细胞分离法)等。
[0071]关于SoxlO、Snai1、Slug、Tyrpl、Dct等的转录因子,可以通过RT-PCR等方法研究
其表达。
[0072]这些表面抗原为阴性，是指在如上所述使用FACS进行分析时，不会以阳性细胞的形式被分选出，或者通过RT-PCR研究其表达时，未见表达，即使存在无法通过这些方法检测出的程度的表达，在本发明中也视为阴性。另外，虽然上述标志为阳性，但是与公知的造血干细胞等细胞同时测定，与这些阳性细胞比较，如果几乎未检出或者表达量显著低，则可视为阴性。
[0073]Muse细胞可以根据这些细胞表面的抗原特性进行分离。
[0074]如上所述，Muse细胞可以以SSEA-3阳性为指标分离，并且可以以SSEA-3和⑶105的共表达为指标进行分离，还可以以选自NG2、⑶34、vWF(血管假性血友病因子)、c-kit (CDl 17)、CD146、CD271 (NGFR)、SoxlO、Snai1、Slug、TyrpI 和 Dct 的 11 个标志中的至少I个、例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个标志的不表达为指标进行分离。例如可以以⑶117和⑶146的不表达为指标进行分离，还可以进一步以⑶117、⑶146、NG2、⑶34、vffF和⑶271的不表达为指标进行分离，还可进一步以上述11个标志的不表达为指标进行分离。
[0075]使用表面标志进行分离时，无需经过培养等即可以直接由机体组织分离I个或多个的Muse细胞。另外，除上述标志之外，Muse细胞还有其它特定因子的高表达的特征。
[0076]通过培养Muse细胞，可得到Muse细胞来源的胚状体(EB)样细胞团。通过对在Muse细胞、作为Muse细胞的来源群的间充质细胞、Muse来源的胚状体样细胞团以及人ES细胞中表达的因子进行比较研究，可以了解在Muse细胞中高表达的因子。这里，因子包含基因转录产物、蛋白质、脂质、糖。
[0077]在Muse细胞中，以下的18个因子高表达。
[0078](i) SSEA-3
(ii)v-fosFBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物
(iii)溶质载体家族16，成员6(—元羧酸转运蛋白7)
(iv)酪氨酸酶相关蛋白I
(V)钙通道，电压依赖的，P/Q型，a IA亚基
(vi)染色体16开放阅读框81` (vii)几丁质酶-3样I(软骨糖蛋白-39)
(viii)蛋白酶，丝氨酸，35
(ix)犬尿氨酸酶(L-犬尿氨酸水解酶)
(X)溶质载体家族16，成员6 (—元羧酸转运蛋白7)
(xi)载脂蛋白E
(xii)突触结合蛋白样5
(xiii)几丁质酶-3样I(软骨糖蛋白-39)
(xiv)ATP结合盒，亚家族A(ABCl)，成员13 (XV)血管生成素样4
(xvi)前列腺素内过氧化物合酶2(前列腺素G/Η合酶和环氧合酶)
(xvii)司腺I丐蛋白I
(xviii)含卷曲螺旋结构域的102B
Muse细胞或多能干细胞部分的特征是:上述因子的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个高表达，可以以至少2
个因子高表达作为指标进行分离。
[0079]以下的20个因子中，本发明的Muse细胞相对于人ES细胞的表达量之比高。
[0080](a)基质金属肽酶I (间质胶原酶)
(b)上皮调节蛋白
(c)几丁质酶-3样I(软骨糖蛋白-39)
(d)转录基因座(Transcribedlocus)(e)几丁质酶-3样I(软骨糖蛋白-39)
(f)丝甘蛋白
(g)MRNA 全长插入片段 cDNA 克隆 EUROIMAGE 1913076
(h)Ras和Rab相互作用因子2
(i)腔蛋白聚糖
(j) CLCA家族成员2,氯离子通道调节蛋白
(k)白细胞介素8
(I)类似于 L0C166075
(m)皮连蛋白(dermatopontin)
(n)EGF, Iatrophilin和含七跨膜结构域的I
(ο)胰岛素样生长因子结合蛋白I
(P)溶质载体家族16,成员4 ( 一元羧酸转运蛋白5)
(q)丝甘蛋白
(r) gremlin 2,半胱氨 酸结超家族，同源物(非洲爪蟾)
(s)胰岛素样生长因子结合蛋白5 (t)硫化物醌还原酶样(酵母)
Muse细胞的特征是:上述因子的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个高表达，可以以至少2个因
子高表达作为指标进行分离。
[0081]此外，Muse细胞可以是上述(i)-(xviii)的因子的至少2个与上述(a)-(t)的因子的至少2个同时高表达，可以以这些基因高表达作为指标进行分离。
[0082]此外，Muse细胞的特征是:表达多能性标志以外的气味受体(嗅觉受体)群以及趋化因子受体群的因子，即，为特定的气味受体或趋化因子受体阳性。
[0083]在Muse细胞中表达的气味受体例如可举出以下22个受体。
[0084]嗅觉受体，家族8，亚家族G，成员2 (0R8G2)；
嗅觉受体，家族7，亚家族G，成员3 (0R7G3)；
嗅觉受体，家族4，亚家族D，成员5 (0R4D5)；
嗅觉受体，家族5，亚家族AP，成员2 (0R5AP2)；
嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员4 (0R10H4)；
嗅觉受体，家族10，亚家族T，成员2 (0R10T2)；
嗅觉受体，家族2，亚家族M，成员2 (0R2M2)；
嗅觉受体，家族2，亚家族T，成员5 (0R2T5)；
嗅觉受体，家族7，亚家族D，成员4 (0R7D4)；
嗅觉受体，家族I，亚家族L，成员3 (0R1L3)；
嗅觉受体，家族4，亚家族N，成员4 (0R4N4)；
嗅觉受体，家族2，亚家族A，成员7 (0R2A7)；
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，α激活活性多肽，嗅觉型(GNAL)；
嗅觉受体，家族6，亚家族Α，成员2 (0R6A2)；
嗅觉受体，家族2，亚家族B，成员6 (0R2B6)；嗅觉受体，家族2，亚家族C，成员I (0R2C1)；
嗅觉受体，家族52，亚家族A，成员I (0R52A1)；
嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员3 (0R10H3)；
嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员2 (0R10H2)；
嗅觉受体，家族51，亚家族E，成员2 (OR51E2)；
嗅觉受体，家族5，亚家族P，成员2 (OR5P2);和 嗅觉受体，家族10，亚家族P，成员I (ORlOPl)
作为在Muse细胞中表达的趋化因子受体，可举出以下的5个受体。
[0085]趋化因子(C-C基序)受体5 (CCR5)；
趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)；
趋化因子(C-C基序)受体I(CCRl)；
达菲血型，趋化因子受体(DARC);以及
趋化因子(C-X-C基序)受体7 (CXCR7)
Muse细胞表达上述嗅觉受体的至少I个，或者表达上述趋化因子受体的至少I个。
[0086]通过这些气味受体或趋化因子受体和与受体结合的趋化因子的作用，作为多能干细胞的Muse细胞可以趋 化至损伤组织并存活，根据情形分化。例如肝脏、皮肤、脊髓、肌肉损伤时，通过特定的趋化因子和在细胞表面表达的气味受体的作用，趋化至各组织中，存活，分化为肝脏(内胚层)、皮肤(外胚层)、脊髓(外胚层)、肌肉(中胚层)细胞，可以使组织再生。
[0087]并且，在Muse 细胞中可见 Rexl、Sox2、KLF-4、c_Myc、DPPA2、ERAS、GRB7、SPAG9、TDGFl等的表达升高，在Muse细胞的细胞团中，可见DAZL、DDX4、DPPA4、Stella、HoxbUPRDMl、SPRY2等的表达升高。
[0088]另外，在Muse细胞中未见作为造血干细胞标志的⑶34和⑶117的表达或表达极低。
[0089]并且，通过对机体的中胚层组织或间充质组织等的细胞施加细胞应激，回收存活的细胞，可以提高Muse细胞含有率。这里，细胞应激是指外部应激，是指通过蛋白酶处理、低氧条件下的培养、低磷酸条件下的培养、血清饥饿状态下的培养、糖饥饿状态下的培养、放射线暴露下的培养、热休克暴露下的培养、有害物质存在下的培养、活性氧存在下的培养、机械刺激下的培养、压力处理下培养等来暴露于应激。其中，优选蛋白酶处理，即蛋白酶存在下的培养。蛋白酶没有限定，可以使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶，胃蛋白酶等的天冬氨酸蛋白酶，木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等的半胱氨酸蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等的金属蛋白酶，谷氨酸蛋白酶、N-末端苏氨酸蛋白酶等。将蛋白酶添加到培养中时的添加浓度并没有限定，通常可以以在培养皿等中培养的贴壁细胞剥离时所使用的浓度使用。本发明的多能干细胞Muse细胞可以称作对上述外部应激具有耐性的干细胞、例如对胰蛋白酶具有耐性的细胞。
[0090]机体中的中胚层组织或间充质组织等没有限定，包含骨髓单核细胞、皮肤细胞等成纤维细胞部分，牙髓组织、眼球组织、毛根组织等。作为细胞，也可以使用培养细胞或从组织采集的细胞。其中，优选骨髓细胞、皮肤细胞，例如可举出:人骨髓间充质细胞(MSC)部分或人皮肤成纤维细胞部分。骨髓间充质细胞部分可通过将骨髓穿刺液培养2-3周获得。[0091]经受了上述各种应激的组织的细胞大部分死亡，存活的细胞中含有本发明的多能干细胞Muse细胞。对细胞施加应激后，必须除去死细胞，使用蛋白酶时，这些死细胞可被蛋白酶的作用分解。
[0092]还可以在对细胞施加应激后再对细胞给予物理冲击，除去容易破碎的细胞。物理冲击例如可通过剧烈的吸移液、剧烈搅拌、涡旋等给予。
[0093]对细胞施加细胞应激、根据需要给予物理冲击后，将细胞群离心，以沉淀的形式获得并回收存活的细胞，由此可提高本发明的多能干细胞Muse细胞的含有率。还可以以下述表面标志为指标，进一步由这样得到的细胞中分离Muse细胞或多能细胞部分。
[0094]另外，培养经受了外伤或火伤等应激的机体的中胚层组织或间充质组织等，回收趋化的细胞，也可以分离Muse细胞。受到了伤害的组织的细胞暴露于应激，因此，本发明中，培养受到了伤害的机体的中胚层组织或间充质组织等，这也称为对机体的中胚层组织或间充质组织细胞等施加细胞应激。
[0095]作为一个例子，就对这些细胞进行胰蛋白酶处理的方法进行说明。此时的胰蛋白酶浓度没有限定，例如在贴壁细胞的常规培养中，只要是以将贴壁于培养容器的贴壁培养物剥离时所使用的浓度范 围使用即可，可例举0.1-1%，优选0.1-0.5%。例如，将含有10-50万个细胞的、机体的中胚层组织或间充质组织等来源的细胞在5ml上述浓度的胰蛋白酶溶液中进行孵育，由此可以暴露于外部应激。胰蛋白酶处理时间是5-24小时,优选5-20小时左右。本发明中，将8小时以上胰蛋白酶处理、例如8小时或16小时的处理称为长时间胰蛋白酶处理。
[0096]胰蛋白酶处理后，优选如上所述，通过吸移液、搅拌、涡旋等施加物理冲击。这是为了破坏除去已死亡的细胞或即将死亡的细胞。
[0097]胰蛋白酶处理后的悬浮培养时，为了防止细胞之间的聚集，例如优选在甲基纤维素凝胶等凝胶中进行孵育。另外，为了防止细胞与培养容器的贴壁以保持悬浮状态，优选用聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)等涂布容器。
[0098]将暴露于外部应激的细胞通过离心收集，进行悬浮培养，则形成细胞团(细胞簇)。该细胞团的大小是直径25μπι至150μπι左右。Muse细胞在暴露于该外部应激并存活下来的细胞群中是以浓缩的状态含有。将该细胞群称为富Muse细胞部分(富Msue群)。富Muse细胞部分中Muse细胞的存在比例根据应激处理的方法而不同。
[0099]如上所述，Muse细胞在施加应激后也存活,这显示了 Muse细胞的应激耐性。
[0100]机体的中胚层组织或间充质组织等来源的细胞的培养中使用的培养基、培养条件可采用在常规的动物细胞的培养中使用的培养基、培养条件。还可以使用公知的干细胞培养用培养基。培养基中可以适当添加胎牛血清等血清或青霉素、链霉素等抗生素以及各种生理活性物质。
[0101]并且，Muse细胞也包含作为Muse细胞的衍生细胞或诱导细胞的多能干细胞。衍生细胞或诱导细胞是指培养Muse细胞得到的细胞或细胞群、或者对Muse细胞进行外源基因的导入等人工诱导操作得到的细胞，也包含后代细胞。本发明时报道的iPS细胞是通过向皮肤成纤维细胞等的机体组织的分化了的细胞中导入外源基因等来进行重编程的结果，称为是被诱导成多能干细胞的细胞，而对本发明的可由组织直接获得、已经具有多能干细胞的性质的细胞进行外源基因的导入等人工诱导操作所得到的细胞是与iPS细胞不同的。[0102]Muse细胞也包含通过将Muse细胞悬浮培养得到的胚状体样细胞团。胚状体是将Muse细胞悬浮培养，由此形成细胞团的形式。此时，可将通过培养Muse细胞得到的胚状体称为Muse细胞来源的胚状体样细胞团(也称为M簇)。用于形成胚状体样细胞团的悬浮培养方法可举出:使用含有甲基纤维素等的水溶性聚合物的培养基进行的培养(Nakahata, T.等人.，Blood 60, 352-361 (1982))或悬滴培养(Keller, J.Physiol.(Lond) 168:131-139, 1998)等。并且Muse细胞还包含由上述胚状体样细胞团进行自我更新得到的胚状体样细胞团、以及包含在胚状体样细胞团中的细胞和多能干细胞。这里，自我更新是指培养胚状体样细胞团中所含的细胞，再次形成胚状体样细胞团。自我更新可以反复进行1-多个周期。另外，Muse细胞也包含上述任意的胚状体样细胞团和由包含在胚状体样细胞团中的细胞分化所得的细胞和组织。
[0103]同种异体移植是指移植他人(其他个体)的组织或细胞。
[0104]Muse细胞在表面表达HLA (人淋巴细胞抗原)中的HLA I类抗原，但不表达HLA II类抗原。同种异体移植具有HLA II类抗原的组织或细胞时，由于供体组织或细胞的HLA II类抗原的抗原呈递，细胞介导的免疫被激活，发生排斥。因此，即使将不表达HLA II类抗原的Muse细胞进行同种异体移植时，也难以发生排斥反应，可以存活。因此移植时无需使用免疫抑制剂。
[0105]Muse细胞还具有免疫抑制效果。即，抑制机体内由单核细胞向单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞的分化诱导，还抑制由单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞向树突细胞的分化诱导。这显示:在将Muse细胞进行同种异体移植时，Muse细胞抑制供体的免疫活性，从而不会因所移植的供体的免疫系统而发生排斥，可以存活、分化。
[0106]Muse细胞具有多能性，可分化为所有的组织。因此，Muse细胞可以用于再生医疗等，通过对功能受损的组织等实施补充Muse细胞的细胞治疗，组织可再生。例如可用于各种组织、各种器官等的再生。具体可举`出皮肤、脑脊髓、肝脏、肌肉等。通过将Muse细胞直接或给予到受到损伤或损害的组织、器官等的附近，Muse细胞侵入该组织、器官内，分化成该组织特有的细胞，可贡献于组织、器官的再生、重建。还可以通过静脉给予等进行全身给予。这种情况下，Muse细胞例如通过归巢等定向于受损的组织或器官，到达并侵入该处，然后分化为该组织或器官的细胞，可贡献于组织、器官的再生、重建。
[0107]BP, Muse细胞可在用于再生医疗的同种异体移植用的细胞治疗中使用。
[0108]给予例如可通过皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射等非口服给予或口服给予，或者通过对胚胎的子宫内注射等进行。可以局部给予也可以全身给予。局部给予例如可利用导管进行。给予量可根据要再生的器官、组织的种类或尺寸适当确定。
[0109]要再生的器官并没有限定，包含骨髓、脊髓、血液、脾脏、肝脏、肺、肠道、眼、脑、免疫系统、循环系统、骨、结缔组织、肌肉、心脏、血管、胰脏、中枢神经系统、末梢神经系统、肾脏、膀胱、皮肤、上皮附属器、乳房-乳腺、脂肪组织、角膜、以及包含口腔、食道、阴道、肛门在内的粘膜等。另外作为治疗对象的疾病可举出:癌症、心血管疾病、代谢疾病、肝脏疾病、糖尿病、肝炎、血友病、血液系统疾病、脊髓损伤等的退行性或外伤性神经疾病、自身免疫疾病、遗传缺陷、结缔组织疾病、贫血、感染症、移植排斥、贫血、炎症、皮肤或肌肉的损伤等。
[0110]细胞可以与作为药学上可接受的基料一起给予。该基料例如是由胶原等制成的生物相容性高的物质、或由生物降解性的物质制成，可以制成颗粒状、板状、筒状、容器状等形状，可以将细胞与该基料结合或收纳于该基料中进行给予。
[0111]还可以对Muse细胞进行体外分化诱导，进一步使用分化的细胞构建组织，也可以将该分化的细胞或该组织进行同种异体移植。Muse细胞不形成肿瘤，因此，即使所移植的上述分化的细胞或该组织中含有未分化状态的Muse细胞，癌化的可能性也低，安全。
[0112]还可进一步将Muse细胞用于病因为组织的退化或功能缺陷的疾病的治疗。这种情况下，例如可以将Muse细胞离体浓缩，增殖，或者使其分化，再返回体内，例如还可以使Muse细胞分化为特定的组织的细胞，再将该细胞移植到要治疗的组织中。还可以通过细胞的移植进行原位细胞治疗。这种情况下，对象细胞的例子可举出:肝脏细胞、神经细胞或神经胶质细胞等神经系统细胞，皮肤细胞、骨骼肌细胞等肌肉细胞，还可以使Muse细胞分化为这些细胞并移植，进行原位治疗。通过该治疗，可治疗例如帕金森病、脑梗塞、脊髓损伤、肌肉退行性疾病等。Muse细胞不形成肿瘤，因此，即使用于这样的治疗，癌化的可能性也低，安全。
[0113]通过使Muse细胞分化，形成血液或血液成分，可以离体、体外形成血液或血液成分。血液成分可举出:红细胞、白细胞、血小板等。可以将这样形成的血液或血液成分用于异体输血。
[0114]如上所述，将Muse细胞用于治疗时，可以离体、体内或体外进行分化。Muse细胞例如可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓间质、骨骼肌、平滑肌、心肌、目艮、内皮、上皮、肝脏、胰脏、造血、神经胶质、神经细胞、少突胶质细胞等。Muse细胞的分化可在分化因子的存在下通过培养实现。分化因子可举出:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、二甲基亚砜(DMSO)和异丙肾上腺素；或者成纤维细胞生长因子4(FGF4)、肝细胞生长因子(HGF)等。
[0115]将Muse细胞用于 具有治疗药物的递送功能。上述物质例如可举出抗血管生成药。
[0116]本发明包含同种异体移植用细胞治疗用组合物或同种异体移植用细胞治疗用组合物，其包含Muse细胞、由Muse细胞形成的胚状体样细胞团以及由Muse细胞或上述胚状体样细胞团分化得到的细胞或组织、器官。可以将它们称作同种异体移植用再生医疗用材料或同种异体移植用再生医疗用组合物。该组合物除Muse细胞、由Muse细胞形成的胚状体样细胞团或者由Muse细胞或上述胚状体样细胞团分化得到的细胞或组织、器官之外,还包含药学上可接受的缓冲液或稀释液等。
[0117]通过以下实施例具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
[0118]实施例1 Muse细胞中的HLA抗原的表达
通过流式细胞仪确认人骨髓间充质细胞来源的SSEA-3阳性细胞的HLA I类和HLA II类抗原的表达。图1表示结果。如图1所示，在人骨髓间充质细胞中，HLAl为阳性，但HLA2为阴性。
[0119]同样确认人成纤维细胞来源的SSEA-3阳性细胞的HLA I类和HLA II类抗原的表达。图2表示结果。如图2所示，在人成纤维细胞中，HLAl为阳性，HLA2为阴性。
[0120]实施例2
通过使用抗人HLA-ABC抗体(eBioscience)的免疫细胞化学染色(第二抗体使用抗小鼠IgG抗体(使用Alexa568标记)，研究Muse细胞(SSEA-3阳性)和非Muse细胞(SSEA-3阴性)中的HLA I类的表达。结果如图3所示。如图3所示,在Muse细胞和非Muse细胞中均可见HLA I类的表达。
[0121]通过使用抗人HLA-DR抗体(eBioscience)的免疫细胞化学染色(第二抗体使用抗小鼠IgG抗体(使用Alexa568标记)，研究Muse细胞(SSEA-3阳性)和非Muse细胞(SSEA-3阴性)中的HLA II类的表达。结果如图4所示。如图4所示，在Muse细胞和非Muse细胞中均未见HLA II类的表达。
[0122]图5是表示上述试验中的非特异性反应的图。如图5所示，未见第二抗体-Alexa568产生的荧光。这显示没有非特异性反应。
[0123]实施例3通过淋巴细胞刺激试验研究Muse细胞的免疫抑制效果
Muse细胞是否具有免疫抑制效果,可通过树突细胞的诱导试验确认。即，由人外周血分离单核细胞，与Muse细胞共培养，研究是否由单核细胞诱导了树突细胞。
[0124]使用以SSEA-3阳性为指标从人成纤维细胞分离的Muse细胞(以下称为Muse细胞)、人成纤维细胞中的SSEA-3阴性细胞(以下称为非Muse细胞)、以及采集自外周血的人单核细胞。
[0125]对于培养基，将a - MEM(+10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、卡那霉素)用于从人成纤维细胞分离的Muse细胞和非Muse细胞，将RPM1-1640 (+10%FBS)用于人单核细胞，将RPM1-1640 (+10%FBS,2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、40ng/mL GM_CSF、20ng/mL IL-4、卡那霉素)用于树突细胞诱导。
[0126]详细的方法如下所示。
[0127](I)单核细胞的 采集
采集健康人的外周血，使用Lymphoprep Tubes (Axis-Shield PoC AS),只分离单核细胞成分，接着悬浮于RPMI培养基(+10%FBS)中，接种于IOcm培养皿中。第2天，将培养皿洗涤2次，除去未贴壁的细胞。
[0128]使用0.25%胰蛋白酶/2mM EDTA，从培养皿中剥离贴壁的细胞。用抗人⑶14(人单核细胞的标志)抗体染色，用FACS分析。结果如图6所示。可确认约90%为⑶14阳性。
[0129](2)由单核细胞向单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞的分化诱导
在GM-CSF和IL-4的存在下，将单核细胞培养数天，单核细胞分化为MoDC前体细胞，然后通过TNF-α形成成熟树突细胞。
[0130]培养(I)中采集的单核细胞。用于培养单核细胞、诱导单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞的培养基是RPM1-1640(+10% FBS、2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、40 ng/mL GM-CSF、20 ng/mL IL-4、卡那霉素)。此时，改变细胞因子的有无、有否与Muse细胞或非Muse细胞的共培养等条件，在以下四种条件下进行培养:(A)只有单核细胞，没有细胞因子的诱导，阴性对照(只有单核细胞(无细胞因子));(B)只有单核细胞，有细胞因子的诱导，阳性对照(只有单核细胞(有细胞因子))；(C)单核细胞+Muse细胞，有细胞因子的诱导(单核细胞+SSEA-3 (+)细胞)；(D)单核细胞+非Muse细胞、有细胞因子的诱导(单核细胞+SSEA-3(_)细胞)(“单核细胞+Muse细胞”表示单核细胞与Muse细胞共培养)。5天后，使用0.25%胰蛋白酶/2mM EDTA剥离细胞，用抗CDla(人单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞的标志)抗体或抗CD14(人单核细胞标志)抗体染色，然后用FACS分析。结果如图7所示。图7A、B、C、D分别表示上述条件(A)、(B)、(C)和(D)的FACS分析结果。各图中，左上(Ql)表示单核细胞的存在，右上(Q2)表示中分化细胞的存在，左下(Q3)表示其它细胞的存在，右下(Q4)表示MoDC前体细胞的存在(参照图7E)。图8表示在各条件下培养后的CDla阳性细胞(MoDC前体细胞)相对于CD14阳性细胞(单核细胞)的比例。如图所示，在细胞因子不存在下培养单核细胞时(A)，几乎不出现MoDC前体细胞，但在单核细胞和细胞因子存在下培养时(条件(B))，MoDC前体细胞出现。在单核细胞与非Muse细胞共培养时(条件(D))，MoDC前体细胞与条件(B)相比略少。而单核细胞与Muse细胞共培养时(条件(C))，MoDC前体细胞的出现与条件(B)相比显著受到抑制。该结果显示，Muse细胞抑制了由单核细胞向单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞的分化诱导。Muse细胞和非Muse细胞均可见抑制效果,但Muse细胞的抑制效果更大。
[0131](3)由单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞向树突细胞的分化诱导 通过使用上述⑴的RPM1-1640 (+10% FBS、2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、40 ng/
mL GM-CSF、20 ng/mL IL-4、卡那霉素)培养，对单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞进行诱导，单核细胞培养开始5天后，向培养基中添加10ng/ml人TNF- α。此时，改变细胞因子的有无、有否与Muse细胞或非Muse细胞的共培养的条件，并且，由于环孢菌素A抑制树突细胞的成熟，因此使用加入了 I μ g/ml环孢菌素A的培养基作为对照。7天后(TNF-a处理开始2天后)，进一步用抗人CD86(树突细胞中强表达)抗体进行染色，用FACS分析。结果如图9所示。图9(i)_图9(vii)分别表示以下条件的结果:(i)只有MoDC前体细胞(未添加细胞因子诱导)(只有MoDC祖细胞(无细胞因子))；(ii)只有MoDC前体细胞(有细胞因子添加)(只有MoDC祖细胞(有细胞因子))；(iii)只有MoDC前体细胞(有细胞因子和环孢菌素添加)(只有MoDC祖细胞(有细胞因子+环孢菌素A)) ;(iv)MoDC前体细胞+Muse细胞(MoDC祖细胞+SSEA-3 (+)细胞)；(v) MoDC前体细胞+Muse细胞，有环孢菌素A添加(MoDC祖细胞+SSEA-3(+)细胞+环孢菌素A) ; (vi)MoDC前体细胞+非Muse细胞(MoDC祖细胞+SSEA-3 (-)细胞)；(vii) MoDC前体细胞+非Muse细胞，有环孢菌素A添加(MoDC祖细胞+SSEA-3 (-)细胞+环孢菌素A)。图10中示出在上述条件(ii)-(vii)下培养后的⑶86的表达。即，自左起表示以下(ii)-(vii)的结果:(ii)只有MoDC前体细胞(阳性对照)；(iii)加入抑制剂环孢菌素A (阴性对照)；(iv) MoDC前体细胞+Muse细胞；(V)向其中加入抑制剂环 孢菌素A ; (vi) MoDC前体细胞+非Muse细胞；(vii)向其中加入抑制剂环孢菌素A。
[0132]如图所示，在将Muse细胞与MoDC前体细胞共培养时，⑶86的表达降低。该结果显示=Muse细胞抑制了由单核细胞来源的树突细胞(MoDC)前体细胞向树突细胞的分化诱导。Muse细胞和非Muse细胞均可见抑制效果,但Muse细胞的抑制效果更大。
[0133]产业实用性
作为由机体组织得到的、SSEA-3阳性、具有以往的干细胞中未见的抗原表达概况的多能干细胞，Muse细胞不表达HLA II类抗原。因此，即使将细胞进行同种异体移植，也不会被排斥。因此，含有Muse细胞的同种异体移植用细胞治疗用组合物可在用于再生医疗的细胞治疗中使用。
[0134]本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考结合到本说明书中。
【权利要求】
1.同种异体移植用细胞治疗用组合物，该组合物含有可从机体组织分离、具有以下(i)-(iv)的所有性质、SSEA-3阳性、不表达HLA II类抗原的多能干细胞: (i)端粒酶活性低或没有； (?)具有分化为三胚层中任意胚层的细胞的能力； (iii)不显示肿瘤性增殖；以及 (iv)具有自我更新能力。
2.权利要求1的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞可抑制由单核细胞向树突细胞的诱导。
3.权利要求1或2的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞为CD105阳性。
4.权利要求1-3中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞为CDl 17阴性和CD 146阴性。
5.权利要求1-3中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞为⑶117阴性、⑶146阴性、NG2阴性、⑶34阴性、vWF阴性和⑶271阴性。
6.权利要求1-3中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、SoxlO阴性、Snail阴性、Slug阴性、Tyrpl阴性和Dct阴性。
7.权利要求1-6中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞为应激耐性。
8.权利要求1-6中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞的吞曬能力闻。
9.权利要求1-8中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞来源于间充质组织。
10.权利要求1-8中任一项的同种异体移植用细胞治疗用组合物，其中，多能干细胞来源于脐带或脂肪组织。
【文档编号】A61K35/28GK103442724SQ201280016538
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年3月30日 优先权日:2011年3月30日
【发明者】出泽真理, 吉田正顺, 黑田康胜 申请人:株式会社克里奥