专利名称：一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法
技术领域：
本发明涉及植物病原菌分离技术领域，具体涉及老化病组织中辣椒疫霉菌的高 效分离方法。
背景技术：
辣椒是我国的传统产业，改革开放以来，随着市场经济的推进，我国辣椒产业每 年以7%的速度发展，我国辣椒出口也在不断增长，韩国、日本、澳大利亚、美国和东南亚等 已成为我国辣椒的常年进口国。由于辣椒的适应性强，栽培区域广泛，种植辣椒的经济效益 和社会效益都很高，对于中国蔬菜市场的周年供应有重要意义，辣椒已成为我国部分贫困 山区脱贫致富的好帮手、城市菜篮子的当家菜。辣椒疫霉菌QPhytophthora capsici Leon) 是植物的一种重要病原菌，其可侵染辣椒引起根、茎和果实腐烂，在适宜发病条件下，辣椒 疫霉菌侵染辣椒可引起毁灭性病害，造成寄主作物绝收。近年来，辣椒疫病在我国不少省份 发生为害日益严重，重病田死秧率达30-100%，成为影响我国辣椒生产的重要障碍。除了辣 椒疫霉菌外，镰刀菌、青枯菌亦可引起辣椒枯萎和青枯病造成根腐烂，炭疽菌、灰霉菌也能 引起辣椒炭疽和灰霉病造成茎和果实腐烂，而且这些病害的症状在作物生长后期或发病后 期与辣椒疫霉菌引起的疫病非常接近。目前，分离辣椒疫霉菌的方法主要有病组织直接分 离法、带菌土壤或水样诱捕分离法等，其中病组织直接分离法对采集的病样要求比较高，只 能从发病症状明显、新鲜的病样上分离到辣椒疫霉菌；带菌土壤或水样诱捕分离法则易受 至土壤和水样中其它杂菌的影响，分离效率较低。老化、腐烂的病组织严重复合感染其它杂 菌，分离纯化其中的辣椒疫霉菌十分困难，而有关这方面研究还很少。因此，很有必要建立 从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，旨在为开展辣椒疫霉菌的群体遗传研究及揭 示病害的传播和发生规律奠定基础，为建立有效的病害防治方法提供理论依据和基础。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提出一种通过借助健康黄瓜果实从老化病 组织中分离辣椒疫霉菌的方法，该方法减轻了辣椒疫病研究人员的工作量，降低了辣椒疫 病标本采集的难度，从而实现辣椒疫霉菌的大批量高效分离。为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案得以实现。一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征是步聚如下
(1)辣椒疫病老化病组织的准备采集辣椒疫病根、茎、果实等老化病组织；
(2)老化病组织表面消毒处理步骤(1)各部分组织用自来水将表面的土壤及杂物冲 洗干净，在无菌超净台内，将各部分组织用无菌水冲洗3次，采用70-80%乙醇进行表面消 毒，再无菌水冲洗3次后，放置于灭菌好的培养皿中，于超净工作台内将表面水分吹干；
(3)黄瓜果的准备准备健康无病斑的黄瓜果；
(4)黄瓜果表面消毒将步骤(3)中准备的黄瓜果在自来水下将表面杂物冲洗干净， 70-80%乙醇中浸泡0. Ι-lmin，取出后于酒清灯火焰上将表面残留的乙醇烧干即可；(5)老化病组织与黄瓜果共培养将步骤(4)准备好的黄瓜果用无菌美工刀片在果蒂 部位切开一适当大小的开口，将步骤(2)老化病组织夹于步聚(4)黄瓜果开口中，无菌条件 下20-30°C保湿培养4-6d ；
(6)选择性培养基的制备取50g黑麦种子在200ml去离子水中浸泡36小时，捣碎机 捣碎，60°C水浴2小时，经2层纱布过滤去渣，过滤液补水至1L，加入琼脂粉15g，121°C高压 蒸汽灭菌15min，即为黑麦培养基。待黑麦培养基冷却至50°C，加入利福平母液至终浓度 为100-300mg/L、氨卞青霉素母液至终浓度为100-300mg/L和五氯硝基苯母液至终浓度为 100-300mg/L,混勻，倒平板即为选择性培养基。(7)辣椒疫霉菌的分离纯化待步骤(5)黄瓜表面长出白霉层后，直接挑取霉层于 步骤(6)选择性培养基上，于20-30°C黑暗条件下培养2-4d，待菌落形成后，挑取少量菌丝 在低倍显微镜下观察菌丝形态，确定所分离的菌落为辣椒疫霉菌后，挑取分离出的辣椒疫 霉菌少量菌丝，接种在步骤(6)选择性培养基上，15-25°C黑暗条件下培养l-3d，使用无菌 手术刀片切割菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端，连同培养基一起切下，置于黑麦斜面培养 基平板中，生长出来的菌落即为辣椒疫霉菌。(8)辣椒疫霉菌的保存将步骤(7)生长出来的辣椒疫霉菌转入黑麦培养基斜面 15 X 150mm的试管中(试管斜面不应过长，试管长度的1/3为宜)，20-30°C黑暗条件下培养 4-6d至长满斜面，灌注高于试管斜面1. 5cm的灭菌石蜡油，13°C黑暗条件下保存，一年活化
转管一次。本发明步骤(2)所述的老化病组织在用自来水冲洗之前应作一些必要的处理 根部和茎部应先用美工刀片将表皮刮除干净；老化病组织在消毒中所采用的部分不应过 大，老化病组织各部分的大小如下根、茎部直径超过0. 5cm的要先剖成两半，长度不长于 2cm，果实部分切取果肉面积不大于2X2cm;对老化病组织各部分消毒时间如下根、茎为 70-80%乙醇中浸泡l_2min，无菌水冲洗3次，果实为70-80%乙醇中浸泡0. 5-1. 5min，无菌 水冲洗3次。本发明步骤(3)所述的黄瓜果可以是绿皮的黄瓜果也可以是白皮的黄瓜果，和所 种植的黄瓜品种无相关性，只要所使用的黄瓜果是健康无病斑的即可。本发明步骤(5 )所述的无菌条件下保湿培养是指将夹好老化组织的黄瓜果置于灭 好菌的保鲜盒中，保鲜盒底部铺一层厚度不超过Icm的灭好菌脱脂棉，用无菌水将脱脂棉 充分加湿，保鲜盒盖紧后放于25°C生化培养箱中，12h光暗交替培养。本发明步骤(5)所述的利福平、氨卞青霉素和五氯硝基苯母液的配制方法如下 分别称取含有效成分0. 5000g的氨卞青霉素原粉(准确至0. 0002g)、含有效成分0. 5000g的 利福平原粉(准确至0. 0002g)、含有效成分0. 5000g的五氯硝基苯原粉(准确至0. 0002g), 分别置于带有标签的50ml灭菌容量瓶中，氨卞青霉素原粉用蒸馏水溶解并稀释至刻度，五 氯硝基苯用适量的甲苯溶解后，用0. 1%吐温80水溶液稀释至刻度，利福平原粉用无水已醇 溶解并稀释到刻度，配成的药剂母液浓度均为2X 104mg/L。本发明的显著优点
植物病害病原菌的分离和纯化是认识病植物原菌群体遗传特征、制定植物病害适 时有效防治措施的基础。植物老化发病组织中存在着许多复合侵染的杂菌，使得目的菌株 的分离纯化十分困难，分离效率低下。本发明采用的黄瓜果实与辣椒疫病老化病组织共培养体系，使老化病组织中的辣椒疫霉菌侵染黄瓜果，从被侵染的黄瓜果上分离辣椒疫霉菌 目标菌株，从而排除了非目标杂菌的污染。本发明具有取材容易、成本低、操作步骤简单、分 离效率高等优点。本发明为植物病害辣椒疫病的研究提供了技术保证。
图1辣椒疫病老化茎杆组织与黄瓜果实共培养体； 图2辣椒疫霉菌在黑麦培养基上的菌落形态；
图3、4辣椒疫霉菌孢子囊形态特征。
具体实施例方式下面结合实例对本发明一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌方法进一步描 述。实施例1
选用采自福建省福州市新店镇蔬菜基地辣椒疫病发病后期根部样品，按以下程序进行 辣椒疫霉菌分离
(1)将辣椒疫病老化根部带回实验室，用自来水将表面的土壤及杂物冲洗干净，用美工 刀将根部表皮刮除干净，切成长度为2cm的组织，若根部直径超过0. 5cm,则需沿木质部纵 向平均剖开两半，在无菌超净台内，切好的组织用无菌水冲洗3次，75%乙醇中浸泡1. 5min, 无菌水冲洗3次后，放置于灭菌好的培养皿中，于超净工作台内将表面水分吹干；
(2)将准备好的黄瓜果在自来水下将表面杂物冲洗干净，75%乙醇中浸泡0.5min，取出 后于酒清灯火焰上将表面残留的乙醇烧干，用无菌美工刀片在黄瓜果蒂部位切开一适当大 小的开口，将步骤(1)准备好的组织块夹于黄瓜果开口中，制作成黄瓜果与老化病组织共培 养体；
(3)将步骤(2)准备好的共培养体置于灭好菌的保鲜盒中，保鲜盒底部铺一层厚度不超 过Icm的灭好菌脱脂棉，用无菌水将脱脂棉充分加湿，保鲜盒盖紧后放于25°C生化培养箱 中，12h光暗交替培养5d;
(4)选择性培养基的制备取50g黑麦种子在200ml去离子水中浸泡36小时，捣碎机 捣碎，60°C水浴2小时，经2层纱布过滤去渣，过滤液补水至1L，加入琼脂粉15g，121°C高 压蒸汽灭菌15min，即为黑麦培养基；待黑麦培养基冷却至50°C，加入利福平母液至浓度为 200mg/L、氨卞青霉素母液至浓度为200mg/L和五氯硝基苯母液至浓度为200mg/L，混勻，倒 平板即为选择性培养基；
(5)待步骤(3)黄瓜表面长出白色霉层后，直接挑取霉层于选择性黑麦培养基上，于 25°C黑暗条件下培养3d，待菌落形成后，挑取少量菌丝在低倍显微镜下观察菌丝及孢子囊 形态(如图3、4所示)，确定所分离的菌落为辣椒疫霉菌后，挑取分离出的辣椒疫霉菌少量菌 丝，接种于选择性黑麦培养基上，20°C黑暗条件下培养2d，使用无菌手术刀片切割菌落边缘 呈放射状单菌丝的尖端，连同培养基一起切下，置于黑麦斜面培养基平板中，生长出来的菌 落即为辣椒疫霉菌。(6)结果显示采用黄瓜与辣椒疫病老化根部组织共培养，再使用选择性培养基从 黄瓜果组织中分离辣椒疫霉菌，具有很高的分离率，分离成功率为83. 6%，有效地排除了其它杂菌对发病老化根部组织中辣椒疫霉菌分离纯化的影响。实施例2:
选用采自福建省福州市新店镇蔬菜基地辣椒疫病发病后期茎杆部样品，按以下程序进 行辣椒疫霉菌分离
(1)将辣椒疫病老化茎杆部样品带回实验室，用自来水将表面杂物冲洗干净，用美工刀 将表皮刮除干净，切成长度为2cm的茎杆组织，若茎杆部直径超过0. 5cm，则需沿木质部纵 向平均剖开两半，在无菌超净台内，茎杆用无菌水冲洗3次，70%乙醇中浸泡1. 5min,无菌水 冲洗3次后，放置于灭菌好的培养皿中，于超净工作台内将表面水分吹干；
(2)将准备好的黄瓜果在自来水下将表面杂物冲洗干净，70%乙醇中浸泡1.Omin，取出 后于酒清灯火焰上将表面残留的乙醇烧干，用无菌美工刀片在黄瓜果蒂部位切开一适当大 小的开口，将步骤(1)准备好的茎杆组织夹于黄瓜果开口中，制作成黄瓜果与茎杆组织共培 养体(如图1所示)；
(3)将步骤(2)准备好的共培养体置于灭好菌的保鲜盒中，保鲜盒底部铺一层厚度不超 过Icm的灭好菌脱脂棉，用无菌水将脱脂棉充分加湿，保鲜盒盖紧后放于25°C生化培养箱 中，12h光暗交替培养5d;
(4)选择性培养基的制备取50g黑麦种子在200ml去离子水中浸泡36小时，捣碎机 捣碎，60°C水浴2小时，经2层纱布过滤去渣，过滤液补水至1L，加入琼脂粉15g，121°C高 压蒸汽灭菌15min，即为黑麦培养基；待黑麦培养基冷却至50°C，加入利福平母液至浓度为 100mg/L、氨卞青霉素母液至浓度为300mg/L和五氯硝基苯母液至浓度为100mg/L，混勻，倒 平板即为选择性培养基；
(5)待步骤(3)黄瓜表面长出白色霉层后，直接挑取霉层于选择性黑麦培养基上，于 20°C黑暗条件下培养4d，待菌落形成后，挑取少量菌丝在低倍显微镜下观察菌丝及孢子囊 形态(如图3、4所示)，确定所分离的菌落为辣椒疫霉菌后，挑取分离出的辣椒疫霉菌少量菌 丝，接种于选择性黑麦培养基上，15°C黑暗条件下培养3d，使用无菌手术刀片切割菌落边缘 呈放射状单菌丝的尖端，连同培养基一起切下，置于黑麦斜面培养基平板中，生长出来的菌 落即为辣椒疫霉菌。(6)结果显示采用黄瓜与辣椒疫病老化茎杆部组织共培养，再使用选择性培养基 从黄瓜是果组织中分离辣椒疫霉菌，具有很高的分离率，分离成功率为91. 2%，有效地排除 了其它杂菌对发病老化茎杆部组织中辣椒疫霉菌分离纯化的影响。实施例3:
选用采自福建省沙县南口镇蔬菜基地辣椒疫病发病后期辣椒果实，按以下程序进行辣 椒疫霉菌分离
(1)将辣椒疫病老化病果样品带回实验室，用自来水将表面杂物冲洗干净，切成面积 不大于2X2cm果肉组织，在无菌超净台内，果肉组织用无菌水冲洗3次，80%乙醇中浸泡 lmin，无菌水冲洗3次后，放置于灭菌好的培养皿中，于超净工作台内将表面水分吹干；
(2)将准备好的黄瓜果在自来水下将表面杂物冲洗干净，75%乙醇中浸泡0.5min，取出 后于酒清灯火焰上将表面残留的乙醇烧干，用无菌美工刀片在黄瓜果蒂部位切开一适当大 小的开口，将步骤(1)准备好的果实组织夹于黄瓜果开口中，制作成黄瓜果与辣椒疫病老化 果肉组织共培养体；(3)将步骤(2)准备好的共培养体置于灭好菌的保鲜盒中，保鲜盒底部铺一层厚度不超 过Icm的灭好菌脱脂棉，用无菌水将脱脂棉充分加湿，保鲜盒盖紧后放于30°C生化培养箱 中，12h光暗交替培养4d;
(4)选择性培养基的制备取50g黑麦种子在200ml去离子水中浸泡36小时，捣碎机 捣碎，60°C水浴2小时，经2层纱布过滤去渣，过滤液补水至1L，加入琼脂粉15g，121°C高 压蒸汽灭菌15min，即为黑麦培养基；待黑麦培养基冷却至50°C，加入利福平母液至浓度为 300mg/L、氨卞青霉素母液至浓度为100mg/L和五氯硝基苯母液至浓度为300mg/L，混勻，倒 平板即为选择性培养基；
(5)待步骤(3)黄瓜表面长出白霉层后，直接挑取霉层于选择性黑麦培养基上，于30°C 黑暗条件下培养2d，待菌落形成后，挑取少量菌丝在低倍显微镜下观察菌丝及孢子囊形态 (如图3、4所示)，确定所分离的菌落为辣椒疫霉菌后，挑取分离出的辣椒疫霉菌少量菌丝， 接种于选择性黑麦培养基上，25°C黑暗条件下培养ld，使用无菌手术刀片切割菌落边缘呈 放射状单菌丝的尖端，连同培养基一起切下，置于黑麦斜面培养基平板中，生长出来的菌落 即为辣椒疫霉菌(如图2所示)。(6)结果显示采用黄瓜果与辣椒疫病老化果实组织制成的共培养体，再使用选择 性培养基从黄瓜组织中分离辣椒疫霉菌，具有很高的分离率，分离成功率为95. 8%，有效地 排除了其它杂菌对辣椒疫病发病老化果实组织中辣椒疫霉菌分离纯化的影响。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征在于所述方法的具体步聚如下(1)辣椒疫病老化病组织的准备采集辣椒疫病根、茎、果实的老化病组织；(2)老化病组织表面消毒处理步骤(1)各部分组织用自来水将表面的土壤及杂物冲洗干净，在无菌超净台内，将各部分组织用无菌水冲洗3次，采用70 80%乙醇进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次后，放置于灭菌好的培养皿中，于超净工作台内将表面水分吹干；(3)黄瓜果的准备准备健康无病斑的黄瓜果；(4)黄瓜果表面消毒将步骤(3)中准备的黄瓜果在自来水下将表面杂物冲洗干净，70 80%乙醇中浸泡0.1 1min，取出后于酒清灯火焰上将表面残留的酒精烧干即可；(5)老化病组织与黄瓜果共培养将步骤(4)准备好的黄瓜果用无菌美工刀片在果蒂部位切开一适当大小的开口，将步骤(2)老化病组织夹于步聚(4)黄瓜果开口中，无菌条件下20 30℃保湿培养4 6d；(6)选择性培养基的制备取50g黑麦种子在200ml去离子水中浸泡36小时，捣碎机捣碎，60℃水浴2小时，经2层纱布过滤去渣，过滤液补水至1L，加入琼脂粉15g，121℃高压蒸汽灭菌15min，即为黑麦培养基；待黑麦培养基冷却至50℃，加入利福平母液至浓度为100 300mg/L、氨卞青霉素母液至浓度为100 300mg/L和五氯硝基苯母液至浓度为100 300mg/L,混匀，倒平板即为选择性培养基；(7)辣椒疫霉菌的分离纯化待步骤(5)黄瓜表面长出白霉层后，直接挑取霉层于步骤(6)选择性培养基上，于20 30℃黑暗条件下培养2 4d，待菌落形成后，挑取少量菌丝在低倍显微镜下观察菌丝形态，确定所分离的菌落为辣椒疫霉菌后，挑取分离出的辣椒疫霉菌少量菌丝，接种在步骤(6)选择性培养基上，15 25℃黑暗条件下培养1 3d，使用无菌手术刀片切割菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端，连同培养基一起切下，置于黑麦斜面培养基平板中，生长出来的菌落即为辣椒疫霉菌；(8)辣椒疫霉菌的保存将步骤(7)生长出来的辣椒疫霉菌转入黑麦培养基斜面试管中，20 30℃黑暗条件下培养4 6d至长满斜面，灌注灭菌石蜡油，13℃黑暗条件下保存，一年活化转管一次。
2.根据权利要求1所述的一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征 是步骤(2)所述的老化病组织在用自来水冲洗之前应作一些必要的处理根部和茎部应先 用美工刀片将表皮刮除干净；老化病组织在消毒中所采取用的部分不应过大，采用老化病 组织各部分的大小如下根、茎部直径超过0. 5cm的要先剖成两半，长度不长于2cm，果实部 分切取果肉面积不大于2X2cm ；对老化病组织各部分消毒时间如下根、茎为70-80%乙醇 浸泡l-2min，无菌水冲洗3次，果实为70-80%乙醇浸泡0. 5-1. 5min，无菌水冲洗3次。
3.根据权利要求1所述的一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征 是步骤(3)所述的黄瓜果可以是绿皮的黄瓜果也可以是白皮的黄瓜果，和所种植的黄瓜品 种无相关性，只要所使用的黄瓜果是健康无病斑的即可。
4.根据权利要求1所述的一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特征 是步骤(5 )所述的无菌条件下保湿培养是指将夹好老化组织的黄瓜果置于灭好菌的保鲜盒 中，保鲜盒底部铺一层厚度不超过Icm的灭好菌脱脂棉，用无菌水将脱脂棉充分加湿，保鲜 盒盖紧后放于25°C生化培养箱中，12h光暗交替培养。
5.根据权利要求1所述的一种从老化病组织中高效分离辣椒疫霉菌的方法，其特 征是步骤(5)所述的利福平、氨卞青霉素和五氯硝基苯母液的配制方法如下分别称取含 有效成分0. 5000g的氨卞青霉素原粉、含有效成分0. 5000g的利福平原粉、含有效成分 0. 5000g的五氯硝基苯原粉，分别置于带有标签的50ml灭菌试剂瓶中，氨卞青霉素原粉用 蒸馏水溶解并稀释至刻度，五氯硝基苯用适量的甲苯溶解后，用0. 1%吐温80水溶液稀释至 刻度，利福平原粉用无水已醇溶解并稀释到刻度，配成的药剂母液浓度均为2X104mg/L。
全文摘要
本发明涉及从老化辣椒疫病发病组织中分离纯化获得辣椒疫霉菌菌株的方法。该方法包括辣椒疫病老化病组织的采集、表面消毒、黄瓜果的准备、黄瓜果表面消毒、老化病组织与黄瓜果共培养、选择性培养基的制作、辣椒疫霉菌分离和纯化保存步聚。本发明为实现从辣椒疫病老化病组织中分离纯化辣椒疫霉菌提供了保证，本发明具有简易、高效、无杂菌污染和适合于大批量菌株分离的优点。
文档编号C12R1/645GK101985604SQ20101058254
公开日2011年3月16日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者兰成忠, 吴敏亮, 李本金, 李炜, 翁启勇, 陈庆河 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所