专利名称：：两个棉花纤维发育起始优势表达的强启动子及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物基因工程
技术领域：
。具体涉及两个棉纤维发育起始时期胚珠及纤维高效、优势表达启动子，含有该启动子的植物表达载体与转化子，还涉及该启动子在棉花基因工程中的应用包括改良棉花纤维品质，改良种子中棉酚、蛋白质、油分等不同物质的积累等各个方面。
背景技术：
：棉花因为其纤维是重要的纺织工业原材料而成为世界性重要的经济作物之一。此外，棉籽富含蛋白质与油分，是价值极高的饲料与食用油来源。由于成熟棉花纤维是长度可达到6cm单细胞，并且纤维素含量高达80%，因而是细胞快速伸长研究的模式材料，也是细胞壁合成以及纤维素积累方向研究的重要材料。启动子是决定目的基因表达模式重要的顺式作用元件之一。基因转录之前，RNA聚合酶首先该基因的启动子区结合。通过启动子上的顺式作用元件协同反式作用因子的相互作用来共同控制基因的表达，以对细胞内外的信号及时做出反应，决定基因表达的时间、部位和表达丰度。通过基因工程手段对农作物进行遗传改良，就需要外源基因在受体内以高度受控的方式表达，也就是能控制外源基因在目标组织的特定发育时期表达。诱导型或者组织器官特异表达启动子可以满足这个要求，它们能控制外源基因以适当的方式表达并最终产生期望的表型。在改良棉纤维的遗传工程中，让外源基因在棉花纤维细胞特异表达有很多优点首先，外源基因的特异表达是保存受体植株能量的一种有效方式，并且可以达到高水平地表达；其次，可以避免基因在非纤维组织表达可能导致的负面影响。最后通过调控外源基因在纤维细胞的表达时间以及表达水平可以控制外源基因表达对纤维特性的影响。国内外各单位在棉花基因功能研究的同时也报道了一些组织特异性启动子的分离、鉴定与应用的情况。其中最为成功的范例之一当为Similkumar等用分离得到的未成熟禾中子特异表达的alpha-globulin启动子(Cottonalpha-globulinpromoterisolationandfunctionalcharacterizationintransgeniccotton,Arabidopsis,andtobacco.TransgenicResearch,2002,11=347-359)后来，他们用这一启动子构建了RNAi载体以特异降低棉籽中棉酚合成的关键酶并最终减少了棉籽中棉酚的含量而不影响其余组织，这使得棉籽蛋白的安全、充分利用成为可能(Engineeringcottonseedforuseinhumannutritionbytissue-specificreductionoftoxicgossypol.ProcNatlAcadSciUSA,2002,103(48):18054-18059)。此外，还获得了棉花纤维特异或优势表达的E6、GhTUBUGhACTUGhTUA9、GhFSltp4等基因的启动子，但是几乎都是在纤维发育的第二阶段即伸长期优势表达(Geneexpressionincotton(GossypiumhirsutumL.)fiber:cloningofthemRNAs.ProcNatlAcadSciUSA,1992,89(13):5769-5673,MolecularcharacterizationofthecottonGhTUBlgenethatispreferentiallyexpressedinfiber.PlantPhysiol.,2002，130(2):666_674，ThecottonACTINlgeneisfunctionallyexpressedinfibersandparticipatesinfiberelongation.PlantCell，2005，17(3):859_875，MolecularcharacterizationofcottonGhTUA9genespecificallyexpressedinfibreandinvolvedincellelongation.JExpBot，2007，58(12):3227_3238，ThefiberspecificityofthecottonFSltp4genepromoterisregulatedbyanAT—richpromoterregionandtheAT—hooktranscriptionfactorGhAT1.PlantCellPhysiol，2007,48(10):1426-1437)02009年还分离得到了维管组织特异表达且受生长素诱导的GhCesA4基因启动子(FunctionalanalysisofacottoncellulosesynthaseA4genepromoterintransgenictobaccoplants.PlantCellReports，2009，28(10)1539-1548)。目前较为缺乏的是在纤维发育起始阶段即开花前3天到开花后2天(-3DPA2DPA)高效表达的启动子，用这样的启动子驱动纤维发育后期表达基因的异位表达也是基因工程改良途径之一。本发明所述启动子PGbPDF1-1及PGbPDF1_2是根据GbPDF1基因的cDNA序列(来源于本室所构建的海岛棉-225DPA纤维cDNA平衡化文库，Genesexpressionanalysesofsea-islandcotton(GossypiumbarbadenseL.)fiberdevelopment.PlantCellR印orts，2007，26=1309-1320)向5，方向扩增得到的。这两个启动子驱动目的基因在胚珠及纤维中优势表达，开花前的胚珠中即可检测得到，且开花当天在胚珠中的表达量就高于组成型启动子CaMV35S，是纤维及棉籽内含物改良的有用生物学元件。
发明内容本发明的目的在于克服现有棉纤维发育起始阶段启动子的不足，在海岛棉3-79开花前2天到开花后25天(-225DPA)纤维cDNA平衡化文库的基础上鉴定出具有棉纤维起始期优势高效表达的启动子PGbPDFl-I及PGbPDFl-2，并将这些启动子应用到棉花的基因工程改良，以最终改良棉花纤维品质或者改良种子中棉酚、蛋白质、油分等不同物质的积累等。本发明通过下列技术方案实现申请人:通过基因克隆方法，从海岛棉中克隆得到两个棉花纤维发育起始优势表达的强启动子PGbPDFl-I和PGbPDFl-2，其核苷酸序列分别如序列表SEQIDNO:1和SEQIDNO2所示。上述启动子PGbPDFl-I和PGbPDFl-2的核苷酸序列包括上述启动子序列的全部或部分序列。所述的部分序列是指大于或等于所述启动子起始密码子上游236bp的序列，其中启动子PGbPDFl-I的236bp序列位于序列表SEQIDNO1所示序列的1444_1679bp处；启动子PGbPDF1-2的236bp序列位于序列表SEQIDNO2所示序列的1116_1351bp处。与此同时，申请人获得两种棉花纤维发育起始优势表达的强启动子PGbPDFl-1、PGbPDF1-2的表达载体pGWB407-PGbPDFl-l和pGWB407_PGbPDFl_2，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO1和SEQIDNO2所示。含有本发明启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系和重组菌的制备方法也属于本发明的保护范围。4所述表达盒从上游至下游依次为本发明的启动子、目的基因和转录终止子，如图7所示。所述植物表达载体具体为包含有如图7所示表达盒的表达载体或将其它元件替换但包含PGbPDFl-I或PGbPDFl-2的全长或部分启动子的表达载体。序列表SEQIDNO1是本发明克隆的启动子PGbPDFl-I的核苷酸序列。序列表SEQIDNO2是本发明克隆的启动子PGbPDFl_2的核苷酸序列。图1是PGbPDFl-I或PGbPDFl_2启动子克隆和验证的技术路线。图2是GbPDFl实时定量PCR的表达分析。分析表明该基因在纤维起始和伸长早期表达，5DPA(开花后5天)是其表达高峰。_1、0、3、5、10、15、20、25、根、叶表示开花前1天的胚珠、开花当天胚珠、开花后3天胚珠、开花后5天胚珠及纤维、开花后10天纤维、开花后15天纤维、开花后20天纤维、开花后25天纤维、根和叶的RNA为模板。图3是PGbPDFl-I启动子驱动⑶S基因在棉花中的表达情况，PGbPDFl-I启动子驱动GUS在棉花起始期的胚珠纤维中优势表达，在花药花丝及刚萌发的胚中也检测到表达。第一、二排分别为⑶S在-1、0、1、2、5、10、15、20、2OTPA胚珠及纤维中的表达情况，第三、四排是其在其他组织中的表达情况。图4是PGbPDFl-I启动子在纤维发育不同时期⑶S定量结果，表明⑶S在ODPA的胚珠蛋白量最高。X轴表示纤维发育的不同时期，分别为ODPA、3DPA的胚珠，5、10、15、20DPA的纤维。图5是PGbPDFl-2启动子驱动⑶S基因在棉花表达情况，表达模式与PGbPDFl-I一致。第一排分别为⑶S在0、、5、30DPA胚珠及纤维中的表达情况，第二排是其在其他组织中的表达情况。图6是PGbPDFl-2不同截短区段的启动子驱动能力分析。结果表明起始密码子上游236bp就具备了驱动GUS在纤维/胚珠优势表达的能力，但驱动能力较弱。起始密码子上游390bp的区段具备了较强的驱动能力，但在纤维伸长中后期的驱动能力高于PGbPDFl-I和PGbPDFl-2这两个区段的驱动能力。表明起始密码子上游236bp为该启动子的核心序列。A为启动子PGbPDFl-2的截短策略；B为不同截短区段转基因棉花GUS染色结果；C为不同截短区段的⑶S定量结果，0、3、5DPA为带纤维的胚珠，10U5DPA为纤维。图7是用启动子PGbPDFl-1/2构建的驱动下游基因超表达载体示意图。图中PGbPDFl-1/2表示本发明所述的启动子；ORF为目的基因；Terminator表示转录终止子。图8是本发明克隆的启动子PGbPDFl-I的核苷酸的全序列，其中下划线部分是启动子的核心序列，片段长度为236bp。图9是本发明克隆的启动子PGbPDFl-2的核苷酸的全序列，其中下划线部分是启动子的核心序列，片段长度为236bp。具体实施例方式实施例1启动子PGbPDFl-I及PGbPDF1_2的克隆本发明的启动子PGbPDFl-I及PGbPDFl-2的克隆是基于基因GbPDFl(登录号为DQ912946)，该基因是海岛棉纤维起始和伸长早期特异/优势表达基因(图2)。在这个基因序列基础上申请人采用GenomeWalking方法克隆了本发明的两个启动子。所述启动子的制备方法参照GenomeWalkerUniversalKit(ProtocolNo.PT3042-2，购自Clontech公司，美国)操作手册，根据GbPDFl基因的cDNA序列设计了两条反向的基因特异巢式PCR引物PDF1-GSP1、PDF1-GSP2(序列见下所述)分别与所用试剂盒中的的接头引物API、AP2组合进行PCR扩增。将PCR扩增片段通过凝胶回收试剂盒(QIAquickGelExtractionKit，购自Qiagen公司，德国)及说明书介绍的的方法纯化以后连接到PMD-18T载体(购自宝生物工程大连有限公司)上并进行测序。将所有片段的测序结果去载体以后通过BLAST等在线工具的拼接及比对以后得到两条长度分别为1679bp和1351bp的启动子PGbPDFl-I及PGbPDFl_2。Clustal_X比对发现PGbPDFl-I及PGbPDFl-2在距GbPDFl基因翻译起始位点ATG上游约390bp的序列几乎完全一致。详细序列见序列表1和序列表2。通过NNPP及TSSP预测发现所述序列具备植物启动子的结构，而PLACE分析发现了譬如L1B0X，HDZIP2ATATHB2，BIHD10SBOX等在发育过程中可能起重要作用的顺式元件及对激素和光照等环境起响应的元件。以上所述所用引物为PDFI-GSPlCAAAACCCACATCAACAAACAAACCTGPDF1-GSP2CTTCTTTGCCTCTCCATCTCTGTATGCTAT以上所述在线工具详细网站及文献如下BLAST:http//blast,ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi,Clustal_X:http://www.clustal.org/,ThompsonJD,GibsonTJ,PlewniakF,JeanmouginF,HigginsDG(1997),TheCLUSTALXwindowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencealignmentaidedbyqualityanalysistools,NucleicAcidsResearch.25(24)4876-82NNPP:http://www.fruitfiy.org/seq_tools/promoter.htmLReeseMG(2001),Applicationofatime-delayneuralnetworktopromoterannotationintheDrosophilamelanogastergenome,Computers&Chemistry.26(1)51-56；TSSP:http://www.softberry.com/berry.phtmL？topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter&advanced=on；ShahmuradovΙΑ,SolovyevW,GammolermanAJ(2005),Plantpromoterpredictionwithconfidenceestimation.NucleicAcidsResearch.33(3):1069-1076;PLACE:http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.htmL,K.Higo,Y.Ugawa,M.IwamotoandT.Korenaga(1999).Plantcis-actingregulatoryDNAelements(PLACE)database1999.NucleicAcidsResearch.27(1)297-300.实施例2启动子PGbPDFl-I及PGbPDFl_2驱动报告基因的表达载体构建用高保真DNA聚合酶分别以引物对PGbPDFl-I-F与pBI121_R及PGbPDFl_2_F与PBI121-R扩增得到两端分别带有HindIII和XbaI(购自NewEnglandBiolabs公司，美国)酶切位点启动子片段，经双酶切消化、回收纯化以后通过DNA连接酶(购自Promega公司，美国)连接到经过相同双酶切消化回收的载体pBI121(购自Clontech公司，美国)骨架上以替代原有CaMV35S启动子从而得到驱动报告基因⑶S的表达载体PGbPDFl-I⑶S和PGbPDF1-2::GUS。所用引物序列如下，下划线所示为酶切位点识别序列PGbPDFl-I-F:AGAGAAGCTTCATATAAAAGTTTAGGGGATTGGAGPGbPDF1-2-FTACGAAGCTTTGTACAGTCGTAApBI121-R:ACATCTAGACTCTGTATGCTATAGATATTACTACTTCAA实施例3启动子表达载体PGbPDFl-I⑶S及PGbPDFl_2::GUS转化棉花将验证无误的实施例2中所构建的2个载体的质粒DNA通过电击转化法转入至丨J农杆菌菌株LBA4404(OctopineTi-plasmiddeletionmutantsofAgrobacteriumtumefacienswithemphasisontherightsideoftheT—region,Plasmid,1982,715-29)中。本发明中所涉及的棉花转基因采用的方法为农杆菌介导的遗传转化法，所采用的农杆菌菌株为LBA4404，转化受体材料为YZ-I(Jin(金双侠)等的文献(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,2006,50=519-524)转化方法和程序参照Jin等建立的高效转化体系(Identicationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,2006,50:519_524;Anefficientgraftingsystemfortransgenicplantrecoveryincotton(GossypiumhirsutumL.).PlantCell,TissueandOrganCulture,2006,85181-185；FactorsaffectingstabletransformationandplantregenerationduringtransformingembryogeniccallusofUplandcotton(GossypiumhirsutumL.)viaAgrobacteriumtumefaciens,PlantCell,TissueandOrganCulture，2005，81:229_237)，并作了相应的调整和修改，具体方法和流程如下1、无菌苗的培养将棉籽壳去掉，用0.1/100的升汞灭菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中配方如下1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L+phytagel(购自Sigma公司，美国)2.5g/L，三至六天暗培养。2.农杆菌的活化和保存2.1准备农杆菌LBA4404，含卡那霉素50mg/L的MGL液体培养基(胰化蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，MgSO4.7H200.lg/L，KH2PO4O.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.Og/L,pH值7.0)，无菌三角瓶，LB(固、液)培养基(含卡那霉素50mg/L)，灭菌甘油，无菌枪头，无菌1.5mL离心管。2.2操作2.2.1活化，悬浮:超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，26.5°C暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，26.5°C暗培养36-48h，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，27°C、200rpm摇2h，OD值在0.5-1.5之间即可用于浸染。72.2.2菌株的保存从培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中150rpm、26°C摇48h，按菌液和甘油11加入1.5mL离心管混勻，-70°c保存。3.浸染，共培养3.1准备暗培养5天左右幼嫩健壮的YZ-I幼苗，经活化农杆菌，无菌培养皿，无菌滤纸。3.2操作无菌条件下将YZ-I幼苗下胚轴用锋利的刀片切成0.5-lcm长的切段，转入到经活化的菌液中，搅勻，静置5-10分钟，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21°C暗培养38-42h。4.愈伤组织的诱导将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上配方如下MS无机盐+B5有机物+2,4-D0.lmg/L+KTO.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,ρΗ5·8。5、非胚性愈伤组织的增殖MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+2，4-D0.05mg/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,ρΗ5·8。6、愈伤组织的分化愈伤组织经继代(一个月继代一次)几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基(MS+B5有机物+ΚΤ0.15mg/L+IBA0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，pH5.8)中，进一步分化成胚状体。7、胚性愈伤组织的继代MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+ΚΤ0.15mg/L+IBA0.5mg/L+Gln(谷胺酰胺)1.Omg/L+Asn(天冬酰胺)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel(购自Sigma-Aldrich公司，美国)2.5g/L,ρΗ5·8。8、成苗生根培养将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长(1/2MS无机盐+B5有机物+葡萄糖15g/L+phytagel2.5g/L,pH5.8)。9、炼苗移栽将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大田。附MS培养基母液配制1.配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解，逐一加到容量瓶中，一定要最后加入CaCl2否则容易产生沉淀，定容到一升。2.配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温下IOh以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。3.配制铁盐时，两种盐用热水分别溶解，然后混合，放置于室温下IOh以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。4.各种生长激素一般可以用lmol/L的NaOH或HCl溶解后，再定容。5.配制も有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染6.各种母液配制好后应存放在4°C冰箱中，发现有沉淀后，不得使用。大量元素QO倍)母液(g/L)KNO338NH3NO333MgSO47H20(无水MgSO4)7.4(3.8)KH2P043.4CaCl22H20(无水CaCl2)8.8(6.6)微量元素(100倍)母液(g/L)CoCl26H200.0025CuSO45H200.0025H3BO30.62KI0.083MnSO44H202.23NaMO42H200.025ZnSO47H200.86铁盐(100倍)母液(g/L)FeSO47H202.78Na2EDTA3.73も有机物VB1(硫胺素)10mg/LVB5(盐酸吡哆醇)lmg/LVB6(畑酸)lmg/L肌醇100mg/L甘氨酸ang/L转化植株通过PCR检测，阳性植株通过自交保存收种，取不同组织用于GUS染色与足里分析。实施例4启动子P(ibPDFl-l及P(ibPDFl-2表达特性将转基因植株的不同组织材料取下以后，迅速用预冷的80%丙酮进行固定30min，在移除丙酮后用预冷的ddH20冲洗后转移到含有反应底物X-Gluc的染色液中于37°C培养箱中放置8-1至完全显色，随后在42°C条件下加入75%酒精使样品充分脱色，最后用FAA组织固定液(IOOmL配方为90mL70%乙醇、5mL冰醋酸、5mL甲醛)材料固定。体式显微镜(LeikaMZFLI11)观察并照相。染色液的配方如下0.9g/LX-gluc,50mmolpH为7.0的磷酸钾缓冲液，20%(v/v)甲醇禾ロ100mg/L氯系。组织总蛋白提取及定量分析參见JeffersonR.A.所述方法(Assayingchimericgenesinplant:theGUSgenefusionsystem.PlantMoiecularBiologyReporter.1987,5:387-405)。定量分析用TecanInfiniteM200型多功能酶标仪(购自Tecan公司，奥地利)进行测量。定量分析毎次至少3次重复，数据处理及分析用MicrosoftExcel程序。通过对⑶S蛋白的定性及定量分析，得出如下结论PGbPDFl-I及PGbPDFl_2这两个启动子主要在棉花的胚珠及纤维发育过程中优势表达从-IDPA30DPA的胚珠及纤维中都能检测得到，在花药及胚中也有表达，且PGbPDFl-I及PGbPDFl-2(图5)这两个启动子在表达模式上几乎没有差别。在表达丰度上PGbPDFl-I及PGbPDFl-2这两个启动子存在一定的差异。以开花当天样本为例，在胚珠中启动子PGbPDFl-2表达能力更强(图6C)。实施例5启动子PGbPDFl-I及PGbPDFl-2核心启动子序列确定根据顺式作用元件预测结果将PGbPDFl-I从5’端截短(图6A)，将不同截短区段的启动子序列与GUS融合构建植物表达载体(载体构建程序同于PGbPDFl-I及PGbPDFl-2)，转化转基因棉花，取样进行GUS染色组织化学定位及GUS定量分析(程序同实施例4)。结果表明起始密码子上游236bp就具备了驱动GUS在纤维/胚珠优势表达的能力，但驱动能力较弱。起始密码子上游390bp的区段具备了较强的驱动能力，但在纤维伸长中后期的驱动能力高于PGbPDFl-I及PGbPDFl-2这两个启动子的驱动能力。表明起始密码子上游236bp为该启动子的核心序列(图6BC)。实施例6启动子PGbPDFl-I及PGbPDFl-2构建到植物载体上设计含有Hindi11和XbaI酶切位点的引物扩增了PGbPDFl-I及PGbPDFl-2序列，其引物序列如下，下划线所示为酶切位点识别序列PGbPDFl-I-F:AGAGAAGCTTCATATAAAAGTTTAGGGGATTGGAGPGbPDF1-2-FTACGAAGCTTTGTACAGTCGTAApGWB407-R:ACATCTAGACTCTGTATGCTATAGATATTACTACTTCAAPCR产物禾口载体pGWB407(Improvedgatewaybinaryvectorshigh-performancevectorsforcreationoffusionconstructsintransgenicanalysisofplants,Bioscience,biotechnology,andbiochemistry,2007,712095-100)分别用HindIII和XbaI酶双酶切。带有启动子的PCR产物酶切后用PCR产物回收试剂盒(QIAquickGelExtractionKit，购自Qiagen公司，德国)回收。pGWB407酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收载体骨架。用T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，挑取具有壮观霉素抗性单克隆，PCR鉴定阳性克隆提取质粒进行酶切和测序鉴定。将获得的两个植物表达载体分别命名为pGWB407-PGbPDFl-l和pGWB407-PGbPDFl-2，其物理图谱如图7所示。权利要求1.两个棉花纤维发育起始优势表达的强启动子PGbPDFl-I和PGbPDFl-2，其核苷酸序列分别如序列表SEQIDNO1和SEQIDNO2所示。2.权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子PGbPDFl-I和PGbPDFl-2的核苷酸序列包括所述启动子序列的全部或部分序列，所述的部分序列是指大于或等于所述启动子起始密码子上游236bp的序列，其中启动子PGbPDFl-I的236bp序列位于序列表SEQIDNO1所示序列的1444-1679bp处；启动子PGbPDF1-2的236bp序列位于序列表SEQIDNO2所示序列的1116-1351bp处。3.两种棉花纤维发育起始优势表达的强启动子PGbPDFl-1、PGbPDFl-2的表达载体pGWB407-PGbPDFl-l和pGWB407-PGbPDFl-2，其核苷酸序列如序列表SEQIDN0:liPSEQIDNO2所示。4.权利要求1或2所述的启动子在棉花遗传改良中的应用。5.权利要求3所述的表达载体在棉花遗传改良中的应用。全文摘要本发明属于植物基因工程
技术领域：
。公开了两个在棉花纤维起始期优势、高效表达的启动子PGbPDF1-1和PGbPDF1-2及其应用。这两个启动子的核酸序列如序列表SEQIDNO1和SEQIDNO2所示。所述启动子在棉花纤维发育起始阶段为表达高峰。通过一系列截短启动子序列与GUS融合，转基因棉花验证结果表明翻译起始密码子到其上游236bp的序列是这两个启动子的核心序列。本发明还公开了利用所述启动子所构建的表达盒的结构以及其在培育改良棉花中的应用。文档编号C12N15/113GK102485893SQ20101058233公开日2012年6月6日申请日期2010年12月6日优先权日2010年12月6日发明者张献龙,朱龙付,涂礼莉,谭家福,邓锋林申请人:华中农业大学