专利名称：一种提高米根霉产酸能力的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高米根霉(lihizopus oryzae)产酸能力的方法，特别是一种通 过降低无机离子的浓度来调节R. oryzae菌体菌落形态，从而提高产酸的方法，属于发酵工 程领域。
背景技术：
R. oryzae在分类上属于毛霉目，根霉属；广泛运用于有机酸、酶、抗体、低胆固醇 的生产过程中。R. oryzae在深层发酵过程中主要呈现三种菌落形态丝状、团状及颗粒状。 由于R. oryzae菌丝体之间的引力作用，菌丝间相互缠绕，最终菌落形态由丝状变成团状。 而团状的R. oryzae在发酵过程中，影响物质和氧的传递。以颗粒状存在的R. oryzae菌落 形态稳定，可从发酵液中轻松分离得到，并能重复利用进行菌体发酵。此外，颗粒状存在的 R. oryzae有助于发酵过程中营养物质和氧的传递。Zn2\ Mg2+及K+等金属离子，作为菌体生长过程中所需酶的辅基，具有促进菌体生 长的作用，而过度生长的菌丝体相互缠绕，容易形成菌丝团。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高米根霉(lihizopus oryzae)产酸能力 的方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案控制培养基中其它成分的浓度不变，降 低金属离子Zn2+、Mg2+及K+的浓度，使R. oryzae菌落呈现颗粒状。发酵用米根霉(R. oryzae)购买于美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research ServiceCulture Collection, NRRL 3563)。发酵产酸条件将30°C条件下培养7d的孢子斜面用无菌水洗下，以4%的种量接 种种子培养基(50πι ν250πιυ三角瓶，30°C、200r/min培养30h，定时取样观察菌落形态，然 后以10 %的接种量接种发酵培养基，发酵72h，结束发酵，取样测定产酸量。涉及的培养基产孢子培养基(g/L)葡萄糖4.0，乳糖6.0，甘油10.0，玉米浆1.0，尿素0.6，蛋白 胨 1. 6，MgSO4 · 7H20 0. 3，ZnSO4 · 7H20 0. 088，FeSO4 · 7H20 0. 25，硫酸铜 0· 005，KH2PO4O. 4， MnSO4 · 4H20 0. 05，KCl 0. 4，NaCl 40，琼脂 20。种子培养基(g/L)种子培养基(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨6，CaC036。优选种子培养基(g/L)葡萄糖20，大豆蛋白胨6，CaC036, KH2PO4O. 3， MgSO4 · 7Η200· 125，ZnSO4 · /H2O 0. 044。发酵培养基(g/L)葡萄糖100，(NH4) 2S042，KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4， ZnSO4 · 7H20 0. 044，FeSO4 · 7H20 0· 01，CaC0380,甲醇 15。所有的培养基由去离子水配制后，12rC，15min灭菌。菌落形态鉴定将培养到一定时期的R. oryzae菌体倒在培养皿上，Sony相机拍照，观察菌落形态。延胡索酸含量的测定采用高效液相色谱(HPLC)测定。色谱柱=Aminex HPX-87H(Bio-Rad)，流动相0. 005M H2SO4,流速0. 5mL/min,柱温;35°C，进样量5 μ L，检 测器示差折光检测器。发明原理从蛋白质水平讲，Si2+参与了碳酸酐酶、DNA聚合酶、碱性磷酸酶、乳酸 脱氢酶等酶类的合成；Mg2+为磷酸基转移酶、ATP水解酶的辅助因子。从核酸水平讲，Zn2+参 与核酸的合成；Mg2+为核苷酸切除修复所有基本步骤的必需辅助因子。从细胞水平讲，Mg2+ 能与膜磷脂静电性结合改变其局部区域的结构从而稳定和保护生物膜；K+对维持细胞内外 的渗透压平衡及膜电位梯度具有重要的作用，K+通道转运活性降低会严重影响细胞的正常 生命活动。因此，当这三种离子存在时，菌丝体过度生长、相互缠绕，容易形成菌丝团。降低 离子浓度可以改变菌株形态。
图1对照实施例下R. oryzae菌落形态图2实施例1下R. oryzae菌落形态图3实施例2下R. oryzae菌落形态图4不同R. oryzae菌落形态的产酸量a:对照，b:颗粒状形态，c:半颗粒状
具体实施例方式对照实施例本发明所用的菌种为米根霉(R. oryzae)。先将产孢子培养基上30°C培养7d的米 根霉(R. oryzae)孢子用无菌水洗下，以10%的接种量接种种子培养基，30°C、200r/min下 培养30h，将菌体倒在9cm的培养皿上，Sony相机拍照，记录米根霉的菌落形态，呈团状(图 1)。以10 %的接种量接种发酵培养基，发酵72h，结束发酵，富马酸产量为39. 93g/L (图4)。种子培养基(g/L)葡萄糖20，大豆蛋白胨 6，KH2PO4O. 6，MgSO4 · 7H20 0. 25， ZnSO4 · 7H20 0. 088，CaC036。发酵培养基(g/L)葡萄糖100，(NH4) 2S042, KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4， ZnSO4 · 7Η200· 044，FeSO4 · 7Η20 0· 01，CaC0380,甲醇 15。实施例1先将产孢子培养基上30°C培养7d的米根霉(R. oryzae)孢子用无菌水洗下，以 10%的接种量接种种子培养基，30°C、200r/min下培养30h，将菌体倒在9cm的培养皿上， Sony相机拍照，记录米根霉的菌落形态，呈颗粒状(图幻。以10%的接种量接种发酵培养 基，发酵72h，结束发酵，富马酸产量为46. 87g/L (图4)。种子培养基(g/L)葡萄糖20，大豆蛋白胨6，CaC036。发酵培养基(g/L)葡萄糖100，(NH4) 2S042, KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4， ZnSO4 · 7Η200· 044，FeSO4 · 7Η20 0· 01，CaC0380,甲醇 15。实施例2先将产孢子培养基上30°C培养7d的孢子用无菌水洗下，以10%的接种量接种种子培养基，30°C,200r/min下培养30h，将菌体倒在9cm的培养皿上，Sony相机拍照，记录米 根霉的菌落形态，呈半颗粒状(图幻。以10 %的接种量接种发酵培养基，发酵72h，结束发 酵，富马酸产量为41.86g/L (图4)。种子培养基(g/L)葡萄糖20，大豆蛋白胨 6，CaC036，KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 125，ZnSO4 · 7H20 0. 044。发酵培养基(g/L)葡萄糖100，(NH4) 2S042, KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4， ZnSO4 · 7Η200· 044，FeSO4 · 7Η20 0· 01，CaC0380,甲醇 15。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种提高米根霉(Miizopus oryzae)产酸能力的方法，其特征在于先将米根霉接种 于产孢子培养基上产孢子，然后用流体洗下米根霉孢子，以10%的接种量接种种子于低无 机离子种子培养基，最后将培养好的种子以10%的接种量接种与发酵培养基。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述低无机离子种子培养基为(g/L)葡萄糖 20，大豆蛋白胨6，CaC036。
3.权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于所述低无机离子种子培养基为(g/L) 葡萄糖 20，大豆蛋白胨 6，CaC036, KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 125，ZnSO4 · 7H20 0. 044。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基(g/L)葡萄糖100，(NH4)2S042, KH2PO4O. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4，ZnSO4 · 7H20 0. 044，FeSO4 · 7H20 0· 01，CaC0380,甲醇 15。
5.权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于所述产孢子的条件为30°C培养7天。
6.权利要求1或4任一所述的方法，其特征在于所述种子培养的条件为30°C、200r/ min 培养 30ho
7.权利要求1所述的方法，其特征在于所述10%接种量中IO5个/mL的孢子。
8.权利要求1所述的方法，其特征在于所述流体为无菌水或种子培养基。
全文摘要
本发明公开了一种提高米根霉(Rhizopus oryzae)产酸能力的方法，属于发酵工程领域。本发明通过降低R.oryzae深层发酵时微生物生长环境中的微量金属离子浓度，改变R.oryzae的菌落形态，进而提高菌体产酸能力。正常生长条件下(Zn2+、Mg2+及K+的浓度不为0)时，菌落形态成丝状或团状，发酵结束后，富马酸产量达到39.93g/L。当种子培养基中Zn2+、Mg2+及K+的浓度均为0时，R.oryzae的菌落形态成颗粒状，发酵结束后，富马酸产量达到46.87g/L，产酸率提高了17.4％，具有很好的应用前景。
文档编号C12N1/14GK102120961SQ20101058205
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者周景文, 周正雄, 堵国成, 陈坚 申请人:江南大学