一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种分子标记检测物在制备检测肝癌的 试剂盒中的用途。
【背景技术】
[0002] 原发性肝细胞癌（以下简称肝癌）是病死率很高的常见肿瘤。肝癌的发病率在 所有肿瘤中排第六位，然而在全球癌症死亡率中排第三位，其中约55%发生在我国。由于 肝癌发病隐匿，临床症状极不典型，对于不大于5cm的小肝癌约70%左右无症状，故肝癌 常常不易被早期发现，当患者出现明显的临床症状时往往已处于肝癌的晚期，多数患者已 失去最佳的治疗时间。肝癌的发生是很多因素综合作用的结果，涉及到很多基因的失调 或突变。这些异常基因可导致正常肝细胞异常增殖及凋亡受抑制等。近年来发现的微小 RNA(micr 〇RNA，miRNA)便是通过调控基因来发挥作用的，故miRNA在肝癌的诊断治疗中发 挥着至关重要的作用。
[0003] miRNA是一种非编码、内源性的单链小分子RNA，长度为21-25nt。根据数据库 miRBase第21版的记载，人类基因组中编码了 1881个前体miRNA，这些前体miRNA能够形 成2588个成熟miRNA。miRNA的功能主要是负性调节靶基因的表达，可与其靶基因信使 RNA(mRNA)的3'非编码区（3' -UTR)特异性结合，使miRNA在翻译水平上抑制靶基因的表 达，除此之外miRNA还可引起靶基因mRNA的降解。近些年来有研宄结果表明miRNA可在转 录水平上对目的基因进行调控，其主要通过对miRNA目的基因启动子区的CPG岛异常甲基 化来发挥作用。因此，miRNA可通过对靶基因的调控发挥癌基因或抑癌基因的作用。miRNA 的表达量会在生理样本和病理样本中出现差别，例如肿瘤样本中的某些miRNA的表达量会 升高，而有另一些miRNA的表达量会降低。
[0004] 目前，将miRNA作为分子标记，使用能够检测miRNA的分子标记检测物来检测待测 样本中特定miRNA的表达量，能够有助于判断待测样本的疾病种类和程度。但是，现有的 miRNA作为分子标记用于检测肝癌的病理学分期和不良预后时，准确率还比较低。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有的miRNA作为分子标记用于检测肝癌的病理学分期和 不良预后时，准确率还比较低的缺陷，提供一种能够以准确率较高的检测肝癌的病理学分 期和不良预后的方案。
[0006] 为了实现上述目的，本发明提供了一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒 中的用途，其中，所述分子标记检测物包括能够特异性地检测miR-19a的检测物和能够特 异性地检测细胞周期蛋白D1的检测物。
[0007] 优选地，所述能够特异性地检测miR-19a的检测物包括序列为SEQ ID NO. 1的第 一正向引物和序列为SEQ ID NO. 2的第一反向引物，所述能够特异性地检测细胞周期蛋白 D1的检测物包括序列为SEQ ID NO. 3的第二正向引物和序列为SEQ ID NO. 4的第二反向引 物。
[0008] 通过上述技术方案，本发明能够将检测肝癌的病理学分期和不良预后的准确率显 著地提高。
[0009] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0010] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0011] 图1是对130例病例进行随访，结合miR-19a和Cyclin D1的检测结果，进行五年 总体生存分析的结果。
[0012] 图2是对130例病例进行随访，结合miR-19a和Cyclin D1的检测结果，进行五年 无病生存分析的结果。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0014] 本发明提供了一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用途，其中，所 述分子标记检测物包括能够特异性地检测miR-19a的检测物和能够特异性地检测细胞周 期蛋白D1的检测物。
[0015] 其中，所述能够特异性地检测miR-19a的检测物可以为特异性地针对miR-19a进 行加尾法qRT-PCR检测或茎环法qRT-PCR检测的引物；能够特异性地检测细胞周期蛋白D1 的检测物可以为特异性地针对细胞周期蛋白D1进行qRT-PCR检测的引物。
[0016] 优选地，所述能够特异性地检测miR-19a的检测物包括序列为SEQ ID NO. 1的第 一正向引物和序列为SEQ ID NO. 2的第一反向引物，所述能够特异性地检测细胞周期蛋白 D1的检测物包括序列为SEQ ID NO. 3的第二正向引物和序列为SEQ ID NO. 4的第二反向引 物。
[0017] 其中，本发明的试剂盒可以按照包含如下步骤的方法使用：（1)从待测肝脏组织 样本中提取RNA，得到RNA样本；（2)使用所述能够特异性地检测miR-19a的检测物，对所述 RNA样本中的miRNA进行加尾法qRT-PCR检测或进行茎环法qRT-PCR检测；（3)使用能够特 异性地检测细胞周期蛋白D1的检测物，对所述RNA样本中的细胞周期蛋白D1的mRNA进行 qRT-PCR检测；如果待测肝脏组织样本中miR_19a的表达量下降且细胞周期蛋白D1的表达 量上升，则指示待测肝脏组织来自肝癌患者。
[0018] 其中，所述肝脏组织样本可以来自于肝穿刺样本，也可以来源于手术样本。其中， 提取RNA样本的试剂和步骤可以使用英杰（Invitrogen)公司的商业化试剂盒并参照其说 明书进行操作。其中，对miRNA的加尾法qRT-PCR检测以及茎环法qRT-PCR检测所用的 试剂和方法可以使用凯杰（Qiagen)公司或普洛麦格（Promega)公司的商业化试剂盒并 参照其说明书进行操作。其中，进行qRT-PCR的方法可以参照罗氏（Roche)公司的商业 化试剂盒并参照其说明书进行操作。其中，待测肝脏组织样本中miR-19a的表达量下降 是指待测肝脏组织样本中miR-19a的表达量与正常肝脏组织样本中miR-19a的表达量相 比，待测肝脏组织样本中miR-19a的表达量为正常肝脏组织样本中miR-19a的表达量的二 分之一以下。其中，待测肝脏组织样本中细胞周期蛋白D1的表达量上升是指待测肝脏组 织样本中细胞周期蛋白D1的表达量与正常肝脏组织样本中细胞周期蛋白D1的表达量相 比，待测肝脏组织样本中细胞周期蛋白D1的表达量为正常肝脏组织样本中细胞周期蛋白 D1的表达量的二倍以上。其中，正常肝脏组织样本是指按照世界卫生组织（World Health Organization (WHO))标准以及国际抗癌学会（International Union against Cancer)标 准进行诊断后确认的不表现有肝癌病理特征的肝脏组织样本，例如实体瘤癌旁样本。
[0019] 其中，为了进一步增强qRT-PCR的准确性，可以使用内参引物，所述内参引物可以 包括能够特异性地检测RNU6的引物和/或能够特异性地检测GAPDH的引物，其中，RNU6是 指U6RNA，GAPDH是指甘油醛-3-磷酸脱氢酶。其中，特异性地检测RNU6的引物可以包括序 列为SEQ ID NO. 5的第三正向引物和序列为SEQ ID NO. 6的第三反向引物，所述能够特异 性地检测细胞周期蛋白D1的检测物包括序列为SEQ ID NO. 7的第四正向引物和序列为SEQ ID NO. 8的第四反向引物。
[0020] 以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
[0021] 制备实施例1
[0022] 在符合伦理和法律的规定标准下，采集130例自体配对的肝癌肝脏组织样本和癌 旁正常组织样本，将这些样本用液氮保存待用。这些样本的临床基本情况如表1所示。
[0023] 表 1
[0024]
【主权项】
1. 一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述分子标记检测 物包括能够特异性地检测miR-19a的检测物和能够特异性地检测细胞周期蛋白D1的检测 物。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述能够特异性地检测miR-19a的检测物为特 异性地针对miR_19a进行加尾法qRT-PCR检测或茎环法qRT-PCR检测的引物；能够特异性 地检测细胞周期蛋白D1的检测物为特异性地针对细胞周期蛋白D1进行qRT-PCR检测的引 物。
3. 根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述能够特异性地检测miR-19a的检测物包 括序列为SEQ ID NO. 1的第一正向引物和序列为SEQ ID NO. 2的第一反向引物，所述能够 特异性地检测细胞周期蛋白D1的检测物包括序列为SEQ ID NO. 3的第二正向引物和序列 为SEQ ID NO. 4的第二反向引物。
【专利摘要】本发明提供了一种分子标记检测物在制备检测肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述分子标记检测物包括能够特异性地检测miR-19a的检测物和能够特异性地检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的检测物。本发明能够提高检测肝癌的病理学分期和不良预后的准确率。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104673894
【申请号】CN201510024578
【发明人】张彦琼, 郭晓冬, 赵景民, 林娜, 杨美
【申请人】中国中医科学院中药研究所, 中国人民解放军第三〇二医院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年1月16日