专利名称：具有分泌吲哚乙酸iaa功能的分枝杆菌、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株分枝杆菌，尤其涉及一株具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，该分枝杆菌能促进兰花组培苗生长及种子萌发。本发明还涉及了该株分枝杆菌的制备方法及其在兰花组培苗生长及种子萌发中的应用。
背景技术：
兰科植物{Orchidaceae、俗称兰花(OrcAioO，是单子叶植物，多年生草本，地生、附生或腐生，是被子植物中最大的科之一。兰花的经济价值很高，其中多数种是著名观赏花卉和名贵药用植物。兰花的繁殖主要有分株、扦插、组织培养和种子无菌播种等。在自然条件下，种子不能正常萌发，根也不能满足植物体对水分和营养物质的需求，使兰科植物的人工栽培相当困难。组织快繁技术已应用于兰科植物，实现了兰科植物的工厂化育苗，但组培·苗移栽成活率很低、生长缓慢、开花延迟、甚至不开花。近年来，兰科植物内生菌的发现及其对兰花生长的促进作用为兰科植物人工栽培提供了新思路。最初的研究报道是在20世纪80年代，澳大利亚科学家从地生兰的根基部分离出内生细菌，由此解开了兰花内生细菌研究的序幕。国外科学家在对卷萼兜兰{PaphiopediIum apple-tonianurii)和节莖石仙桃 ipholidota articulata)的相关细菌进行研究时发现，部分兰科植物的相关细菌具有不同程度的分泌IAA的能力，并能促进植物种子萌发。这一发现提醒我们，兰科植物与其微生态系统中的细菌之间存在着密切关系。国内对于兰花内生细菌的研究正处于起步阶段，2009 2010年分别有研究报道了从春兰根部分离得到可分泌IAA的内生细菌，这些内生细菌种类具有丰富的多样性。分枝杆菌主要包括结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌等。据报道分枝杆菌属中的某种菌TZh51对降解土壤中的多环芳烃(如菲、荧葸和芘)，对受污染的土壤有一定修复作用。另有分枝杆菌对废水和污泥中的苯系化合物、对汽车燃油中的噻吩硫有降解能力，由此揭示了某些分枝杆菌具有对人类有益的一面。该菌在植物生长方面的作用尚未见详细报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能促进兰花组培苗生长及种子萌发的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌。本发明还提供了上述分枝杆菌的制备方法以及该菌种在兰花种子萌发及组培苗生长中的应用。本发明具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌所采用的技术方案是一种具有分泌口引哚乙酸IAA功能的分枝杆菌,其分类命名为分枝杆菌應avium Mya-zhOl,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年3月28日，保藏编号为CCTCC NO M2012092。
该菌株具有以下特性该菌株在固体培养基中呈橙黄色颗粒状，生长缓慢，在罗-琴培养基中需2 3周形成菌落，菌体形态呈棒杆状，无芽孢，好氧，革兰氏染色阳性，有荚膜。所述分枝杆菌为鸟-胞内分枝杆菌。所述分枝杆菌的16S rDNA序列如下，其序列编号为SEQ ID NO :3，
5’ -GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCCTTCGGGGGTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTTTAGACGCATGTCTTTTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTCCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTTCGGGTTTTCTCGGATTGACGGTAGGTGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAATCTCACGGCTTAACTGTGAGCGTGCGGGCGA TACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGCGTCTAGAGATAGGCGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCGGGTAATGCCGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGCAAGGTTAAGCGAATCCTTTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCAGTGGCCTAACCCTTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACG-3，。本发明具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌的制备方法所采用的技术方案是所述分枝杆菌来源于蝴蝶兰花梗，经分离、纯化获得。该方法包括以下步骤
(O分枝杆菌Mya-ZhOl的分离，剪取蝴蝶兰新鲜的花梗，用自来水冲洗掉花梗上的灰尘等杂物，在超净工作台上进行表面消毒，用无菌吸水纸吸干花梗表面的水分，用无菌的剪刀或手术刀剪切长为4cm的花梗小段，将花梗放置于MS培养基上，25°C条件下培养；1-2个月后，将花梗上长出的小芽切下，接种培养在罗-琴培养基上，I个月之后即可看到丛生芽或小苗周围出现橙黄色的菌株，即为Mya-zhOl菌株；
(2)分枝杆菌Mya-zhOl的纯化培养,将从蝴蝶兰外植体上分离出的Mya-zhOl菌按照纯化菌株的常规方法，在罗-琴固体培养基上进行划线，置于30°C恒温培养箱培养I个月，挑取培养基上长出的单菌落，即可得到多株纯菌株。本发明还给出了上述具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌在兰花种子萌发及组培苗生长中的应用。在该应用中，所述分枝杆菌Mya-zhOl利用外源色氨酸，分泌植物生长素IAA。在兰花组培苗生长的应用如下将分枝杆菌Mya-zhOl接种于兰花组培苗基部，其预培养在MS培养基上，24-25°C条件下培养，兰花组培苗的生长良好，其中，兰花品种为蝴蝶兰或石斛兰；在兰花种子萌发中的应用如下将兰花种子浸泡于分枝杆菌Mya-zhOl菌液中一段时间，再播种于通用的兰花组织培养基上，24-25°C条件下培养，兰花种子萌发并出根长叶，所述兰花品种为蝴蝶兰或石斛兰。本发明的有益效果是本发明用于促进兰花组培苗生长时，将一定浓度的分枝杆菌Mya-zhOl接种于组培苗基部，按兰花组织培养条件培养；用于促进兰花种子萌发时，将兰花种子经本领域常规方法消毒后，浸泡于适宜浓度的分枝杆菌Mya-zhOl菌液一段时间，再播种于兰花种子萌发培养基(MS培养基)中，按照兰花组织培养适宜条件进行培养，本发明菌株可有效的促进兰花组培苗生长及种子萌发，这对于生长较为缓慢的兰花组织培养及工厂化生产组培苗具有重要意义。
图I是分枝杆菌Mya-zhOl革兰氏染色的显微镜照片；
图2是分枝杆菌Mya-zhOl在罗-琴培养基上的生长情况；
图3是实施例三中分枝杆菌Mya-zhOl在不同培养基中分泌IAA能力情况对比表；
图4是分枝杆菌Mya-zhOl对蝴蝶兰组培苗生长的影响对比图，其中a图为未接种分枝杆菌Mya-zhOl的对照苗生长图；b图为接种了分枝杆菌Mya-zhOl(细菌浓度IO8 cfu / mL)的组培苗生长图；c图为接种了 10倍稀释液(细菌浓度IO7 cfu / mL)的分枝杆菌Mya-zhOl菌液的组培苗的生长图；d图为接种了 IO2倍稀释液(细菌浓度IO6 cfu / mL)的分枝杆菌Mya-zhOl菌液的组培苗的生长图；e图为接种了 IO4倍稀释液(细菌浓度IO4 cfu / mL)的分枝杆菌Mya-zhOl菌液的组培苗的生长图。
具体实施例方式本发明具体公开了一种具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，该菌株在固体培养基中呈橙黄色颗粒状，生长缓慢，在罗-琴培养基中需2-3周形成菌落。菌体形态呈棒杆状，无芽孢，好氧，革兰氏染色阳性(染色显微镜照片见图1)，有荚膜。其生理生化特征如表I所示。表I :分枝杆菌Mya-zhOl的生理生化特征
权利要求
1.一种具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，其分类命名为分枝杆菌{Mycobacterium avium') Mya-zhOl,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCM 2012092。
2.根据权利要求I所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，其特征在于，该菌株具有以下特性该菌株在固体培养基中呈橙黄色颗粒状，生长缓慢，在罗-琴培养基中需2 3周形成菌落，菌体形态呈棒杆状，无芽孢，好氧，革兰氏染色阳性，有荚膜。
3.根据权利要求I所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，其特征在于所述分枝杆菌为鸟_胞内分枝杆菌。
4.根据权利要求I所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，其特征在于，所述分枝杆菌的 16S rDNA 序列如下5’-GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCCTTCGGGGGTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTTTAGACGCATGTCTTTTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTCCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTTCGGGTTTTCTCGGATTGACGGTAGGTGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAATCTCACGGCTTAACTGTGAGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGCGTCTAGAGATAGGCGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCGGGTAATGCCGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGCAAGGTTAAGCGAATCCTTTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCAGTGGCCTAACCCTTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACG-3，。
5.一种如权利要求I所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌的制备方法，其特征在于所述分枝杆菌来源于蝴蝶兰花梗，经分离、纯化获得。
6.根据权利要求5所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (O分枝杆菌Mya-zhOl的分离，剪取蝴蝶兰新鲜的花梗，用自来水冲洗掉花梗上的灰尘等杂物，在超净工作台上进行表面消毒，用无菌吸水纸吸干花梗表面的水分，用无菌的剪刀或手术刀剪切长为4cm的花梗小段，将花梗放置于MS培养基上，25°C条件下培养；1_2个月后，将花梗上长出的小芽切下，接种培养在罗-琴培养基上，I个月之后即可看到丛生芽或小苗周围出现橙黄色的菌株，即为Mya-zhOl菌株； (2)分枝杆菌Mya-zhOl的纯化培养,将从蝴蝶兰外植体上分离出的Mya-zhOl菌按照纯化菌株的常规方法，在罗-琴固体培养基上进行划线，置于30°C恒温培养箱培养I个月，挑取培养基上长出的单菌落，即可得到多株纯菌株。
7.—种如权利要求I所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌在兰花种子萌发及组培苗生长中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述分枝杆菌Mya-zhOl利用外源色氨酸，分泌植物生长素IAA。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用如下将分枝杆菌Mya-zhOl接种于兰花组培苗基部，其预培养在MS培养基上，24-25°C条件下培养，兰花组培苗的生长良好，其中，兰花品种为蝴蝶兰或石斛兰。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用如下将兰花种子浸泡于分枝杆菌Mya-zhOl菌液中一段时间，再播种于通用的兰花组织培养基上，24-25°C条件下培养，兰花种子萌发并出根长叶，其中，兰花品种为蝴蝶兰或石斛兰。
全文摘要
本发明提供了一株能促进兰花组培苗生长及种子萌发的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，该分枝杆菌的制备方法以及该菌种在兰花种子萌发及组培苗生长中的应用。该株具有分泌IAA功能的分枝杆菌Mycobacteriumavium Mya-zh01保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国·武汉·武汉大学，邮编430074，保藏日期2012-3-28，保藏编号CCTCCNOM2012092；所述分枝杆菌Mycobacteriumavium Mya-zh01来源于蝴蝶兰花梗，经分离、纯化获得；本发明菌株可分泌吲哚乙酸(Indole-3-aceticacid，IAA)，具有促进兰花组培苗生长及种子萌发的能力，这对于生长较为缓慢的兰花组织培养及工厂化生产组培苗具有重要意义。本发明可应用于兰花栽培技术领域。
文档编号A01N63/02GK102888375SQ201210368480
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者潘丽晶, 张妙彬, 陈继敏, 任淑梅, 王燕鹂, 吴熙文 申请人:珠海市农业科学研究中心