00LUX，每天光照16h的条件下进行培养。在本发明方法条件下，山葡萄愈 伤组织超低温保存后成活率达到90%以上。
[0041] 试验例：
[0042] 实施例1山葡萄愈伤组织玻璃化法超低温保存技术
[0043] 实验材料：来自山葡萄国家种质资源圃，种质编号为'75122'。
[0044] 实验方法具体步骤如下：
[0045]1.材料获得
[0046] 以山葡萄茎段为材料接种在MS培养基中添加BA(6-苄氨基腺嘌呤）2mg?L\ NAA(萘乙酸）0.Img.L\蔗糖30g.L\琼脂7g.L1中，温度25±2°C，光照强度1200Lux~ 1600Lux，每天光照16h的条件下诱导愈伤组织；
[0047] 2.愈伤组织脱水
[0048] 将愈伤组织切成0. 2*0. 2cm小块置于超净工作台中鼓风干燥30min，使愈伤组织 适当脱水，可在超低温保存过程中防止组织内冰晶的形成。
[0049] 3.装载液装载以及超低温冷冻保存
[0050] 将愈伤组织浸入到装有冷冻保护液的冻存管中，迅速投入到液氮中进行超低温保 存；
[0051] 4.愈伤组织化冻
[0052] 将液氮中保存的愈伤组织取出置于40°C水浴锅中化冻；
[0053] 5?洗涤
[0054] 用MS添加3 %蔗糖液体培养基冲洗两次，每次10~12分钟；
[0055] 6.恢复再生培养
[0056] 洗涤后，转移到MS培养基中添加BA(6-苄氨基腺嘌呤）Img?L\NAA(萘乙 酸）0. 5mg?L\蔗糖30g?L\琼脂7g?L1中，在25°C进行暗培养2周，然后移到光照强度 1200Lux~1600Lux，每天光照16h的条件下进行培养。
[0057] 实施例2干燥时间对山葡萄愈伤组织存活率的影响
[0058] 仅改变愈伤组织在超净工作台中鼓风干燥时间，其余步骤同实施例1，研究干燥时 间对山葡萄愈伤组织超低温保存存活率的影响。结果如图1所示。
[0059] 从图1可以看出，新鲜的山葡萄愈伤组织冻存后，存活率为5% ;随着干燥时间延 长，愈伤组织存活率有所增加，在干燥时间为40min，愈伤组织含水量为40. 7%时，存活率 达到最高，为90%。而过长的干燥时间，导致愈伤组织失水严重，愈伤组织存活率下降。
[0060] 实施例3装载液对山葡萄愈伤组织存活率的影响
[0061] 仅改变装载液组成成分，其余步骤同实施例1，研究装载液对山葡萄愈伤组织超低 温保存存活率的影响，其中Sl为超纯水附加10%二甲基亚砜（DMSO)+10%乙二醇+8%葡萄 糖，32为超纯水附加12.5%01^0+0.25%水解酪蛋白，33为超纯水附加10%01^0+10%山 梨醇，S4为PVS2。结果如图2所示，当采用Sl装载液对山葡萄愈伤组织进行装载并且对其 进行快速冷冻时，山葡萄愈伤组织存活率最高，达到90 %，其次为采用S4装载液进行慢速 冷冻，山葡萄愈伤组织存活率为75%，使用S2和S3装载液并进行分步冷冻时，山葡萄愈伤 组织存活率最低，均为20%。
[0062] 实施例4化冻温度对山葡萄愈伤组织存活率的影响
[0063] 仅改变化冻温度，其余步骤同实施例1，研究化冻温度对山葡萄愈伤组织超低温保 存存活率的影响。结果如图3所示，在4°C冰箱内进行化冻时，愈伤组织成活率仅为5%， 25°C室温进行化冻；愈伤组织成活率为55%，40°C水浴化冻时，愈伤组织成活率最高，达到 90%〇
[0064] 实施例5暗培养时间对山葡萄愈伤组织存活率的影响
[0065] 仅改变暗培养时间，其余步骤同实施例1，研究装载液对山葡萄愈伤组织超低温保 存的影响。结果如图4所示。没有进行暗培养的愈伤组织冻后成活率为25%，随着暗培养 时间的延长，再培养成活率逐渐升高，暗培养14d的成活率最高，为90 %，暗培养时间过长 也不利于愈伤组织恢复生长。
[0066] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然 可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替 换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精 神和范围。
【主权项】
1. 一种山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括诱导愈伤组织、风 干、超低温保存、化冻的步骤。2. 根据权利要求1所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述 诱导愈伤组织包括： 步骤1 :以山葡萄茎段为材料接种在下列培养基中： MS培养基；培养条件：温度25±2°C，光照强度1200LuX-l600LuX，每天光照16h诱导愈伤组织。3. 根据权利要求1所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述 风干包括：将愈伤组织切块并进行风干；所述超低温保存包括：将风干后的山葡萄愈伤组 织浸入到含有冷冻保护液的冻存管中，然后将冻存管迅速投入到液氮中进行超低温保存； 所述化冻包括：将液氮中保存的愈伤组织取出置于水浴锅中化冻。4. 根据权利要求1所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，其特征在于，在化 冻之后，还包括以下步骤： 步骤a:用MS培养基添加质量百分比含量为3%的蔗糖液体作为最终培养基冲洗两次， 每次10~12分钟； 步骤b:洗涤后，转移到下列培养基中： MS培养基培养条件：在25°C进行暗培养2周，然后移到光照强度1200LUX~I600LuX，每天光照 16h〇5. 根据权利要求3所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述 冷冻保护液按质量百分比计，包括DMS010%、乙二醇10%、葡萄糖8%，余量：超纯水。6. 根据权利要求3所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述 将愈伤组织切块并进行风干包括：将愈伤组织切成0. 2*0. 2cm小块置于超净工作台中鼓风 干燥30min。7. 根据权利要求3所述的山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤4 中，所述水浴锅的温度为40°C。
【专利摘要】本发明提供一种山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法，包括诱导愈伤组织、风干、超低温保存、化冻的步骤。采用本发明方法保存的山葡萄愈伤组织繁殖率高，避免了田间圃位保存易受自然灾害影响而导致种质丢失或毁灭的危险以及试管苗组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。山葡萄愈伤组织玻璃化超低温保存方法不需经过长期继代保存，降低人工劳动强度。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105028195
【申请号】CN201510357986
【发明人】孙丹, 艾军, 秦红艳, 赵滢, 李昌禹, 杨义明, 范书田
【申请人】中国农业科学院特产研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月25日