专利名称：绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法及在鱼糜制品生产中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法及在鱼糜制品生产中的应用。
背景技术：
绿豆胰蛋白酶抑制剂(Mung Bean Trypsin Inhibitor, MBT I) 是从绿豆 iPhaseolus radiatus L.)成熟种子中分离的属于Bowman-Birk型丝氨酸蛋白酶抑制剂。我国学者戚正武等人深入而系统地研究了 MBTI的物理化学及生物化学性质，测定了它的一级结构。MBTI共含72个氨基酸残基，分子量为8，883彻，含7对二硫键，对热、 酸、碱、酶消化的稳定性很高。它具有两个抑制活力相同的结构域，两个抑制活性位点 (Lys20-Ser21, Arg47-Ser48)都对胰蛋白酶起作用。前者由一条含沈残基的长链与含9 个残基的短链通过两对二硫键连接而成。而后者由含27个残基的单链组成。MBTI与酶作用的机制遵循其它蛋白质型丝氨酸蛋白酶抑制剂的标准抑制机制。最近的研究发现，MBTI 还具有抗肿瘤等医学作用。目前，绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化主要采用硫酸抽提、硫酸铵分级沉淀、膜超滤、离子交换柱层析、亲和色谱或高效液相色谱等方法，分离纯化过程繁琐，操作复杂，耗时长，得率低，成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单，分离效果好的绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法以及其对鱼糜制品弹性增强的改善作用。本发明的工艺流程设计原理是在低浓度硫酸的作用下，绿豆中部分杂蛋白被酸破坏而降解成小分子物质，加热处理进一步去除了杂蛋白。对酸、对热稳定的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)则基本不受影响而在离心后的上清液中。膜处理可有效去除大分子(>30 kDa)蛋白和小分子(<5 kDa)的盐和小肽成分。离子交换层析中，MBTI对阴离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引，而这种吸引力与溶液的PH值及盐浓度有关。溶液中盐浓度的变化直接影响阴离子交换剂对蛋白质的吸附能力。故本发明采用盐浓度线性梯度洗脱方式对MBTI进行纯化。此外，在鱼糜制品生产过程中，肌肉中的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶 (myofibril-bound serine proteinase, MBSP)是导致鱼糜制品弹性下降的主要因素。将以上方法制备的高纯度MBTI或部分纯化的MBTI添加到以海水鱼或淡水鱼为主要原料的鱼糜制品中，使其终浓度达到10-50 mg/kg或以上，搅拌均勻，可使最终制品的凝胶强度增加 10-20%，达到改善鱼糜制品品质的效果。为了达成上述目的，本发明的解决方案是
一种绿豆胰蛋白酶抑制剂(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分离纯化方法，包括如下步骤
1)提取将干燥的绿豆用粉碎机粉碎成粉末；以1:4-6 m/v比例溶于硫酸中，搅拌浸泡后，离心取其上清液为MBTI粗提液；
2)中和向步骤1)所得的MBTI粗提液中加碱至溶液的pH呈中性；
3)热处理将步骤2)所得的MBTI粗提液在水浴中加热，加热后立即冷却，离心收集上
清液；
4)膜处理将步骤3)所得的上清液用30kDa分子量截留的超滤膜超滤后取外液；进一步用5 kDa分子量截留的超滤膜超滤脱盐制得MBTI浓缩液；
5)吸附分离解吸将步骤4)脱盐后的MBTI浓缩液经Q-kpharose(购于安玛西亚公司或DEAE-kpharose阴离子交换树脂(购于安玛西亚公司)吸附分离，MBTI吸附在树脂上，吸附后的树脂经梯度淋洗解吸，得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)。所述的步骤1)中硫酸浓度为0. 05-0. 1 mol/L，搅拌浸泡时间为18_36 h，组织捣碎后，以8000-12000 g离心15-30 min，上清液为MBTI粗提液。所述的步骤2)中碱采用1-2 mol/L的NaOH。所述的步骤3)中加热条件采用60° C，90 min或80° C，30min或90° C，15 min 中的一种；10000-12000 g离心10-15 min，收集上清液为部分纯化的绿豆胰蛋白酶抑制剂。所述的步骤4)中的上清液用30 kDa分子量截留的超滤膜超滤，截留大分子量蛋白，而分子量较小的MBTI (约9 kDa)则流出到外液；进一步用5 kDa分子量截留的超滤膜超滤脱盐，同时在超滤液中加入PH 7. 5-8. 0的20 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液或磷酸缓冲液制得MBTI浓缩液。所述的步骤5)中阴离子交换树脂采用二乙基氨乙基(DEAE-)或季氨基(Q-)阴离子交换树脂；吸附后的树脂经0-0. 5 mol/L NaCl线性梯度的盐淋洗解吸，得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)。一种绿豆胰蛋白酶抑制剂在鱼糜制品生产中的应用，将绿豆胰蛋白酶抑制剂添加到以海水鱼或淡水鱼为主要原料的鱼糜制品中，混合均勻，用于增强鱼糜弹性。所述的绿豆胰蛋白酶抑制剂在鱼糜制品中添加的终浓度为10-50 mg/kg以上， 使鱼糜制品的凝胶强度提高10-20%。本发明的有益效果为本发明通过进行低浓度硫酸抽提，加热处理，膜分离，离子交换等手段，获得高度纯化的绿豆胰蛋白酶抑制剂。尤其是利用绿豆胰蛋白酶抑制剂分子量小(9 kDa)的特点，采用30 kDa分子量截留的超滤膜去除大分子量杂蛋白。进一步采用 5 kDa分子量截留的超滤膜去除小分子量小肽及盐。与耗时较长的透析脱盐相比，膜浓缩在实现快速脱盐的同时减少了样品体积，节省了下一步离子交换柱的上样时间；膜处理也去除了分子量大于30 kDa和小于5 kDa的杂蛋白，显著提高了纯化效率。由于本发明利用阴离子交换树脂快速有效分离绿豆胰蛋白酶抑制剂，因而具有工艺简单，分离效果好，可大规模制备的优点，大大简化了原来需要进行多次柱层析的纯化步骤。综上所述，本发明主要采用低浓度硫酸抽提，加热和膜技术处理脱盐除杂蛋白，进一步利用阴离子交换柱层析方法，快速有效地分离绿豆胰蛋白酶抑制剂。本发明采用膜技术加快了脱盐速度并有效去除了高分子量和低分子量杂蛋白。
图1为本发明纯化绿豆胰蛋白酶抑制剂的质谱图，M 蛋白分子量标准，1 纯化的 MBTI ；
图2为本发明纯化绿豆胰蛋白酶抑制剂的Tricine-SDS-PAGE电泳图，电泳胶为银染
色；
图3为本发明纯化绿豆胰蛋白酶抑制剂的热稳定性图；将MBTI在不同温度下分别加热30 min(#), Ih(D)和2h(A)后对胰蛋白酶的抑制活性残留。图4为本发明纯化的绿豆胰蛋白酶抑制剂对鱼糜制品凝胶强度的影响结果。
具体实施例方式实施例1
本实施例的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分离纯化方法，包括如下步骤
1、抽提将400 g绿豆磨碎成粉，加入1600 ml浓度为0.1 mol/L的硫酸，搅拌M h。 用Kinematica (瑞士)组织捣碎机捣碎30 min，12000 g下离心20 min，收集上清液约700 mL，即为MBTI粗提液。2、中禾口 向700 mL粗提液中加入1 mol/L NaOH，至溶液的pH呈中性。3、热处理将中和后的MBTI粗提液在60° C水浴中加热90 min，加热后立即冷却，12000 g离心10 min，收集上清液。4、膜处理将上述经加热处理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超滤膜超滤，收集外液。进一步用5 kDa分子量截留的超滤膜对收集外液超滤脱盐浓缩，同时在超滤液中加入0.02 mol/L Tris-HCl, pH 8. 0，使溶液的最终pH为8. 0。5、吸附分离将步骤4脱盐后的MBTI浓缩液经上样于Q-kpharose Fast Flow阴离子交换树脂(2. 5X9 cm)，流速lmL/min。吸附完毕后，用0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液 CpH 8.0)充分冲洗柱子至观0 nm下的吸光度到基线。6、解吸吸附后的树脂经 200 mL 0. 02 mol/L Tris-HCl ( pH 8. 0)和 200 mL 0.02 mol/L Tris-HCKpH 8.0，含0.5 mol/L NaCl)混合组成的线性梯度洗脱液淋洗解吸， 收集洗脱液(2 mL/管)得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)。7、树脂再生解吸后，树脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。纯化的MBTI 上样于 MALDI-T0F 质谱仪(Shimadzu/Kratos，Kyoto,日本)进行分子量测定，结果如图1所示，峰值所对应MBTI的分子量为8887. 25Da。将纯化的MBTI通过 Tricine-SDS-PAGE分析，结果如图2所示，电泳胶为银染色，电泳结果为单一条带，分子量与质谱分析结果一致，表明本方法可获得高纯度MBTI。实施例2
本实施例的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分离纯化方法，包括如下步骤
1、提取取IOOg绿豆粉，加入500 mL 0. 1 mol/L H2SO4搅拌放置20小时，充分组织捣碎，10000 g离心20 min,收集上清液约170 mL,即为MBTI粗提液。2、中和用2 mol/L NaOH调整粗提液pH，使得溶液pH稳定在7左右。3、热处理将中和后的MBTI粗提液在水浴中加热80° C，30 min，加热后立即冷却，IOOOOg离心15 min,收集上清液。4、膜处理将上述经加热处理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超滤膜超滤，截留大分子量蛋白，而分子量较小的目的蛋白MBTI (约9 kDa)则流出到外液。进一步用5 kDa分子量截留的超滤膜对外液超滤脱盐浓缩，同时在超滤液中适量加入0.02 mol/ L Tris-HCl CpH 8.0)确保脱盐完全。5、吸附分离用 0. 02 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH=8. 0)平衡 Q-S印harose 阴离子交换树脂(1.5X8 cm)，将脱盐后的MBTI蛋白母液泵入柱中，控制流速为1 mL/min。6、解吸吸附完毕后的树脂用0. 02 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8. 0)充分冲洗柱子至观0 nm下的吸光度到基线。吸附后的树脂用100 mL 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8. 0)禾口 100 mL 0. 02 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 8. 0 含 0. 2 mol/L NaCl)混合组成的梯度洗脱液淋洗解吸，收集洗脱液(2 mL/管)，得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)。7、树脂再生解吸后，树脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。将以上方法制备的高纯度MBTI在不同温度下进行热稳定性分析，所得结果如图3 所示。纯化的MBTI在100°C加热1小时后仍有85 %活性，2小时后仍有55 %的活性，表明其对热稳定。将以上方法制备的高纯度MBTI或部分纯化的MBTI添加到以淡水鲢鱼为主要原料的鱼糜制品中，使其终浓度达到40 mg/kg或以上，搅拌均勻，可有效抑制肌肉中的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase, MBSP)活性，使制品的凝胶强度增加10%。实施例3
本实施例的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分离纯化方法，包括如下步骤
1、抽提将500 g干燥的绿豆磨碎成粉，加入3000 ml浓度为0.075 mol/L的硫酸，搅拌36 h，组织捣碎30 min后在12000 g下离心20 min,收集上清液约1250 mL,即为MBTI 粗提液。2、中禾口 向1250 mL粗提液中加入1. 2 mol/L NaOH，至溶液的pH呈中性。3、热处理将中和后的MBTI粗提液在80°C水浴中加热30 min，加热后立即冷却， 在12000 g离心15 min，收集上清液。4、膜处理将上述经加热处理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超滤膜超滤，收集外液。进一步用5 kDa分子量截留的超滤膜对外液超滤脱盐浓缩，同时在超滤液中加入20 mmol/L Tris-HCl，调溶液的pH至7. 5。5、吸附分离将步骤4脱盐后的MBTI浓缩液泵入DEAE-kpharose Fast Flow阴离子交换树脂的吸附柱(2. 5X12 cm)中，流速1.5 mL/min，吸附完毕后的树脂用0. 02 mol/ L Tris-HCl缓冲液(pH 8. 0)充分冲洗柱子至观0 nm下的吸光度到基线。
6、解吸吸附后的树脂分别经0. 02 mol/L Tris-HCl (pH 8. 0)和含不同浓度NaCl 的0. 02 mol/L Tris-HCl (pH 8. 0)洗脱液淋洗解吸。NaCl浓度分别依次为0. 1,0. 2,0. 3、 0.4和0.5 mol/L，每个浓度分别淋洗80 mL。收集洗脱液(2 mL/管)得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)。7、树脂再生解吸后，树脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。将以上方法制备的高纯度MBTI或部分纯化的MBTI添加到以海水鱼蓝圆鰺为主要原料的鱼糜制品中，使其终浓度达到50 μ g/kg，搅拌均勻，可有效抑制肌肉中的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase, MBSP)活性，使制品的凝胶强度增加21%，结果如图4所示。实施例4
本实施例的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分离纯化方法，包括如下步骤
1、抽提将500 g绿豆磨碎成粉，加入2000 ml浓度为0. 1 mol/L的硫酸，搅拌抽提22 h,充分组织捣碎，在10000 g下离心15 min,收集上清液约870 mL,即为MBTI粗提液。2、中和向870 mL粗提液中加入2 mol/L NaOH，至溶液的pH呈中性。3、热处理将中和后的MBTI粗提液在水浴锅中90° C处理15分钟，放在冰水中立即冷却，10000 g下离心15 min,收集上清液。4、膜处理将上述经加热处理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超滤膜超滤，截留大分子量蛋白，而分子量较小的目的蛋白MBTI (约9 kDa)则流出到外液。进一步用5 kDa分子量截留的超滤膜对外液超滤脱盐浓缩，同时在超滤液中适量加入20 mmol/ L磷酸缓冲液(pH 8.0)确保脱盐完全。5、吸附分离将脱盐后的MBTI蛋白母液泵入用0. 02 mol/L磷酸缓冲液(pH 8. 0) 平衡的Q-kpharose阴离子交换柱(1.5X10 cm)中，控制流速为1 mL/min。6、解吸吸附完毕后的树脂用0. 02 mol/L磷酸缓冲液(pH 8. 0)充分淋洗柱子至 280 nm下的吸光度到基线。吸附后的树脂用200 mL 0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH=8. 0)和 200 mL 0. 02 mol/L磷酸缓冲液(pH 8.0含0.4 mol/L NaCl)混合组成的梯度洗脱液解吸， 收集洗脱液(3 mL/管)，得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)。7、树脂再生解吸后，树脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。将以上方法制备的高纯度MBTI或部分纯化的MBTI添加到以海水鱼蓝圆鰺为主要原料的鱼糜制品中，使其终浓度达到15 μ g/kg，搅拌均勻，可有效抑制肌肉中的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase, MBSP)活性，使制品的凝胶强度增加21%。实施例5
本实施例的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分离纯化方法，包括如下步骤1、抽提将500 g干燥的绿豆磨碎成粉，加入2000 ml浓度为0.1 mol/L的硫酸，搅拌 24 h，组织捣碎30 min ；继续搅拌10小时，再组织捣碎10分钟后在12000 g下离心15 min, 收集上清液约900 mL,即为MBTI粗提液。2、中和向900 mL粗提液中加入1 mol/L NaOH，至溶液的pH呈中性。3、热处理将中和后的MBTI粗提液在60°C水浴中加热90 min，加热后立即冷却， 在12000 g离心12 min，收集上清液。4、膜处理将上述经加热处理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超滤膜超滤，收集外液。进一步用5 kDa分子量截留的超滤膜对外液超滤脱盐浓缩，同时在超滤液中加入0.02 mol/L Tris-HCl，pH8. 0，使超滤液的最终pH达到8. 0。5、吸附分离将步骤4脱盐后的MBTI浓缩液经Q-kpharose Fast Flow阴离子交换树脂(2. 5X8 cm)吸附分离，MBTI吸附在树脂上。吸附完毕后的树脂用0. 02 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8. 0)充分淋洗至观0 nm下的吸光度到基线。6、解吸吸附后的树脂用 200 mL 0. 02 mol/L Tris-HCl ( pH 8. 0)和 200 mL 0.02 mol/L Tris-HCl (pH 8.0，含0.5 mol/L NaCl)混合组成的线性梯度洗脱液洗脱，收集洗脱液(2 mL/管)，可得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)。7、树脂再生解吸后，树脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。将以上方法制备的高纯度MBTI或部分纯化的MBTI添加到以淡水鲢鱼为主要原料的鱼糜制品中，使其终浓度达到25 μ g/kg，搅拌均勻，可有效抑制肌肉中的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase, MBSP)活性，使制品的凝胶强度增加14. 5%ο实施例6
本实施例的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分离纯化方法，包括如下步骤
1、提取将1000 g干燥的绿豆粉，加入4000 ml浓度为0.05 mol/L的硫酸，搅拌M h， 分成5份，每份组织捣碎30 min。在12000 g下离心15 min，收集上清液约1750 mL，即为 MBTI粗提液。2、中禾口 向1750 mL粗提液中加入1. 5 mol/L NaOH，至溶液的pH呈中性。3、热处理将中和后的MBTI粗提液在水浴80° C中加热30 min，加热后立即冷却，10000 g离心15 min，收集上清液。4、膜处理将上述3处理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超滤膜超滤， 截留大分子，收集含目的蛋白MBTI (约9 kDa)的外液。进一步用5 kDa分子量截留的超滤膜对外液超滤脱盐浓缩，同时在超滤液中加入0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.幻，使脱盐完全，体积约为300 mL。5、吸附分离将步骤4脱盐后的MBTI浓缩液上样于用0.02 mol/L磷酸缓冲液 CpH 7. 5)平衡的DEAE-S印harose Fast Flow阴离子交换柱(2· 5X 18 cm)，流速2 mL/min。 吸附完毕后，用0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH=7.5)充分淋洗柱子至观0 nm下的吸光度到基线。
6、解吸吸附后的树脂用400 mL 0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH 7. 5)和400 mL 0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH 7. 5，含0.5 mol/L NaCl)组成的线性梯度洗脱液解吸，收集洗脱液(4 mL/管)得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)。7、树脂再生解吸后，树脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。将以上方法制备的高纯度MBTI或部分纯化的MBTI添加到以海水鱼蓝圆鰺为主要原料的鱼糜制品中，使其终浓度达到30 mg/kg，擂溃搅拌均勻，可有效抑制肌肉中的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase, MBSP)活性，使最终制品的凝胶强度增加17. 6%。上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
权利要求
1.一种绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤1)提取将干燥的绿豆用粉碎机粉碎成粉末；以1:4-6 m/v比例溶于硫酸中，搅拌浸泡后，离心取其上清液为粗提液；2)中和向步骤1)所得的粗提液中加碱至溶液的pH呈中性；3)热处理将步骤2)所得的粗提液在水浴中加热，加热后立即冷却，离心收集上清液；4)膜处理将步骤3)所得的上清液用30kDa分子量截留的超滤膜超滤后取外液；进一步用5 kDa分子量截留的超滤膜超滤脱盐制得浓缩液；5)吸附分离解吸将步骤4)脱盐后的浓缩液经Q-kpharose或DEAE-kpharose阴离子交换树脂吸附分离，绿豆胰蛋白酶抑制剂吸附在树脂上，吸附后的树脂经梯度淋洗解吸， 得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，其特征在于 所述的步骤1)中硫酸浓度为0. 05-0. 1 mol/L，搅拌浸泡时间为18-36 h，组织捣碎后，以 8000-12000 g离心15-30 min，上清液为粗提液。
3.根据权利要求1所述的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，其特征在于所述的步骤2)中碱采用1-2 mol/L的NaOH。
4.根据权利要求1所述的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，其特征在于所述的步骤3)中加热条件采用60° C，90min或80° C，30min或90° C，15min中的一种； 10000-12000 g离心10-15 min，收集上清液为部分纯化的绿豆胰蛋白酶抑制剂。
5.根据权利要求1所述的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，其特征在于所述的步骤4)中的上清液用30 kDa分子量截留的超滤膜超滤，截留大分子量蛋白，而分子量较小的蛋白则流出到外液；进一步用5 kDa分子量截留的超滤膜超滤脱盐，同时在超滤液中加入pH 7. 5-8. 0的20 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液或磷酸缓冲液制得浓缩液。
6.根据权利要求1所述的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，其特征在于所述的步骤5)中阴离子交换树脂采用二乙基氨乙基或季氨基阴离子交换树脂；吸附后的树脂经0-0. 5 mol/L NaCl梯度的盐淋洗解吸，得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂。
7.一种如权利要求1所述的绿豆胰蛋白酶抑制剂在鱼糜制品生产中的应用，其特征在于将绿豆胰蛋白酶抑制剂添加到以海水鱼或淡水鱼为主要原料的鱼糜制品中，混合均勻， 用于增强鱼糜弹性。
8.如权利要求7所述的一种绿豆胰蛋白酶抑制剂在鱼糜制品生产中的应用，其特征在于所述的绿豆胰蛋白酶抑制剂在鱼糜制品中添加的终浓度为10-50 mg/kg以上，使鱼糜制品的凝胶强度提高10-20%。
全文摘要
本发明公开了一种绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，包括如下步骤1)提取；2)中和；3)热处理；4)膜处理；5)吸附分离解吸,得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂。以及将绿豆胰蛋白酶抑制剂添加到以海水鱼或淡水鱼为主要原料的鱼糜制品中，混合均匀，用于增强鱼糜弹性的应用。本发明具有工艺简单，分离效果好,其对鱼糜制品弹性增强具有很大的改善作用。
文档编号C07K1/18GK102295700SQ20111021563
公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者曹敏杰 申请人:集美大学